Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología
17 de marzo de 2016
Aquí presentamos una metodología para la producción de un accidente cerebrovascular focal en la sustancia blanca murina mediante la inyección local de un inhibidor irreversible del óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) (L-Nio). Se presentan dos variaciones estereotácticas, el trazado neuronal retrógrado y el marcaje y disección de tejido fresco que amplían las aplicaciones potenciales de esta técnica.
El objetivo general de este procedimiento es localizar con precisión un pequeño accidente cerebrovascular en la sustancia blanca de ratones para modelar esta forma común de accidente cerebrovascular subcortical en la sustancia blanca. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del accidente cerebrovascular, como los mecanismos de lesión axonal, la respuesta neuronal al accidente cerebrovascular subcortical y cómo los elementos celulares de la sustancia blanca responden tanto durante las fases aguda como de reparación del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para localizar con precisión un accidente cerebrovascular en la sustancia blanca, y puede emplearse con una amplia variedad de modelos murinos de ratón.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la pequeña cantidad de sustancia blanca, lo que provoca una mala localización del accidente cerebrovascular. Pueden ser necesarios ajustes menores en el ángulo de inyección o en las coordenadas estereotáxicas para cada cepa de ratón, o en la configuración estereotáxica. Comience primero fijando una pipeta de vidrio estirada a un tubo conectado a una línea de vacío.
Introduzca el extremo estirado en la solución de L-Nio, o en L-Nio más trazador fluorescente. Inicie el vacío y aplique succión hasta que al menos dos milímetros de la porción de la pipeta con un diámetro de 0,5 milímetros estén llenos. Coloque la pipeta llena a un lado.
Luego coloque el ratón en un aparato estereotáxico equipado con un microscopio estereotáxico. Después de anestesiar y preparar al ratón para la cirugía según los procedimientos aprobados, verifique la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie. No debe haber ninguna respuesta.
A continuación, ajuste el brazo de inyección a 36 grados. Sujete un porta-pipeta de vidrio estirado al extremo distal de un sistema de inyección de bajo volumen con presión, y fíjelo al brazo de inyección. Después de realizar una incisión media en el cuero cabelludo de 1,5 centímetros para exponer el cráneo, seque la superficie del cráneo con un hisopo de algodón.
Luego, observando a través de un microscopio estereotáctico con un aumento de uno a tres X, utilice una herramienta de micropunto para eliminar cualquier tejido perióstico sobreyacente. Marque el bregma con un marcador de punta fina. A continuación, use un taladro quirúrgico equipado con una broca quirúrgica de punta fina para realizar una craneotomía elíptica de dos milímetros, comenzando posteriormente en el bregma y extendiéndose anteriormente justo a la izquierda de la línea media.
Retire los fragmentos óseos y los tejidos blandos superpuestos para que pueda visualizarse la corteza cerebral. Mantenga la superficie cortical húmeda aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril. A continuación, fije la pipeta llena al brazo inyector.
Alinee el extremo distal de la pipeta con el bregma y ajuste a cero las coordenadas estereotácticas. Avance la pipeta hasta el primer punto de inyección utilizando las coordenadas anterior, posterior y medial-lateral indicadas en la tabla uno. Luego, avance la pipeta hasta la superficie cortical y ajuste a cero la medición dorsal-ventral.
Baje lentamente la pipeta hasta las coordenadas dorsal-ventral. Asegúrese de que el aumento del microscopio estereotáctico esté ajustado a tres veces y de que la retícula calibrada pueda verse con claridad. Observe la pipeta en ángulo desde un lado para obtener una vista sagital del menisco entre el aire y el líquido.
El menisco debe aparecer en el mismo plano focal tanto de la pared interna como de la externa de la pipeta. Ahora, utilizando un sistema de inyección por presión local ajustado a 20 PSI durante pulsos de 20 milisegundos, inyecte 100 nanolitros de L-Nio en el cerebro. Después de inyectar el volumen total, espere cinco minutos para prevenir el reflujo a lo largo del trayecto de la pipeta.
A continuación, retire la pipeta y repita el procedimiento de inyección en el segundo y tercer conjunto de coordenadas proporcionados en la tabla uno. Después de la inyección final, retire la pipeta y coloque suficiente cera ósea para llenar el sitio de craneotomía. Finalmente, acerque los bordes de la herida del cuero cabelludo y sujételos con adhesivo dérmico.
Después de administrar analgesia posoperatoria, coloque el animal en una jaula limpia. Administre antibióticos posoperatorios en el agua de bebida durante cinco días, o hasta el sacrificio si es menos de cinco días. Después de sacrificar y decapitar el ratón según los procedimientos aprobados, use tijeras estériles para abrir el cráneo por la parte posterior, y luego use una espátula para retirar suavemente el cráneo sobreyacente.
A continuación, inserte una espátula estéril de cuatro milímetros en la parte frontal del cerebro para seccionar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Luego, levante suavemente el cerebro del cráneo y colóquelo en tampón de disección frío con hielo. Utilizando un bloque para cerebro y hojas de bisturí estériles, corte rebanadas de dos a tres milímetros que contengan la región afectada, y colóquelas en tampón de disección frío.
Bajo un microscopio estereoscópico, identifique la sustancia blanca subyacente a la corteza motora en el hemisferio inyectado. En intervalos tempranos posteriores al accidente cerebrovascular, la inyección de L-Nio mezclado con colorantes de laboratorio comunes, como el verde rápido, puede permitir la identificación visual del accidente cerebrovascular. En intervalos más largos posteriores al accidente cerebrovascular, la región puede identificarse visualmente por necrosis focal y palidez de la mielina.
Una vez identificada, use un escalpelo para diseccionar cuidadosamente la región de sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular. Retire la corteza sobreyacente y el estriado subyacente, según se desee. Como se muestra aquí, la marcación por inmunofluorescencia para filamentos neurales, mostrada en rojo, demuestra el grado de pérdida axonal siete días después del accidente cerebrovascular, utilizando el enfoque medial.
Mediante el enfoque angulado posterior, la lesión por accidente cerebrovascular en la sustancia blanca se dirige justo por encima del ventrículo lateral y muestra una intensa reactividad microglial, tal como se detecta mediante inmunomarcado para IBA-1. Dos marcadores de filamentos intermedios de astrocitos, la vimentina, mostrada en rojo, y la proteína ácida fibrilar glial, mostrada en verde, revelan cambios en la morfología de los astrocitos de la sustancia blanca tras el accidente cerebrovascular. La coinyección de amina de dextrano fluorescente en el momento de la inducción del accidente cerebrovascular permite la identificación de neuronas individuales cuyos axones resultaron dañados por el accidente cerebrovascular.
La mayor parte de la marcación ocurre en axones dentro de las neuronas de las capas cinco y seis de las cortezas sensoriomotoras primarias que recubren el área del accidente cerebrovascular. Esta imagen representa siete días después del accidente cerebrovascular. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 45 minutos, si se lleva a cabo correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un accidente cerebrovascular focal en la materia blanca de un ratón y preparar el cerebro para una variedad de procesamientos posteriores, útiles para responder preguntas importantes en el estudio del accidente cerebrovascular y la reparación neurológica.
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Resumen
Este artículo presenta una metodología para producir un accidente cerebrovascular focal en la sustancia blanca de ratones mediante la inyección local de un inhibidor irreversible de eNOS (L-Nio). La técnica incluye variaciones estereotácticas y marcado de tejido fresco para ampliar sus aplicaciones en la investigación del accidente cerebrovascular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre accidente cerebrovascular
- Modelos murinos
Antecedentes
- Los accidentes cerebrovasculares focales en la sustancia blanca son comunes en los modelos de accidente cerebrovascular subcortical.
- Comprender la lesión axonal y las respuestas neuronales es fundamental en la investigación del accidente cerebrovascular.
- La localización precisa de los accidentes cerebrovasculares puede mejorar los resultados experimentales.
- Las variaciones entre cepas de ratones pueden requerir ajustes en la técnica.
Objetivo del estudio
- Modelar con precisión el accidente cerebrovascular en la sustancia blanca subcortical en ratones.
- Investigar los mecanismos de lesión axonal y las respuestas neuronales.
- Explorar las respuestas celulares durante las fases aguda y de reparación del accidente cerebrovascular.
Métodos Utilizados
- Inyección de L-Nio utilizando un aparato estereotáctico.
- Preparación del ratón y procedimientos quirúrgicos para la inducción de accidente cerebrovascular.
- Diseción y etiquetado del tejido cerebral para análisis.
- Etiquetado inmunofluorescente para evaluar la pérdida axonal y la reactividad microglial.
Resultados principales
- Localización exitosa de lesiones por accidente cerebrovascular en la sustancia blanca de ratones.
- Identificación de lesión axonal y activación de la microglía tras el accidente cerebrovascular.
- Identificación visual del accidente cerebrovascular mediante trazadores fluorescentes.
- Demuestra los cambios astrocíticos en respuesta al accidente cerebrovascular.
Conclusiones
- Esta técnica permite un modelado preciso de los accidentes cerebrovasculares en la sustancia blanca.
- Proporciona información sobre los mecanismos celulares del daño por accidente cerebrovascular.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar la comprensión de los procesos de recuperación tras un accidente cerebrovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La modelización del accidente cerebrovascular focal en la sustancia blanca en ratones aborda una brecha crítica en la investigación preclínica del ictus, permitiendo la desvinculación mecanicista de las vías de degeneración axonal. Este modelo apoya la validación de objetivos al proporcionar un sistema relevante a la enfermedad para estudiar las respuestas neuroinflamatorias y de reparación relacionadas con la demencia vascular y la carga de infartos silenciosos. La localización precisa de la lesión mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento, reduciendo la variabilidad biológica en los resultados de los ensayos posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con los mecanismos de lesión axonal en la patología de la sustancia blanca.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma compatible con modelos murinos para la validación funcional de dianas mediante herramientas neurobiológicas establecidas.
- Valor científico: Apoya la desestimación biológica al modelar la contribución de infartos silenciosos a la progresión de la demencia vascular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera puntos finales histológicos cuantificables, como la pérdida axonal y la reactividad de la microglía, para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita la preparación de secciones de tejido validadas para análisis reproducibles mediante inmunofluorescencia y trazado basado en trazadores.
- Valor científico: Permite la preparación para cribado mediante la inducción de lesiones focales compatibles con el trazado neuronal retrógrado y la marcación de tejido fresco.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al modelar el accidente cerebrovascular en la sustancia blanca subcortical que contribuye a la demencia vascular.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la administración estereotáctica y el procesamiento de tejidos estandarizados.
- Valor científico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la ubicación de la lesión con los perfiles de respuesta celular en las fases aguda y de reparación.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la prueba de hipótesis sobre mecanismos específicos del accidente cerebrovascular en la sustancia blanca antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías mediante la inducción dirigida de lesiones en tractos de materia blanca de ratón.
- Selección: Proporciona tejido listo para ensayos con resultados cuantificables, como la activación de microglía IBA-1+ y la pérdida de filamentos axonales.
- Análisis: Ofrece variables dependientes medibles, incluyendo la intensidad de fluorescencia de los marcadores de filamentos neurales y astrocíticos, para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de fases del accidente cerebrovascular relevantes para el deterioro cognitivo vascular.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un marco estereotáctico reutilizable, adaptable a diferentes cepas de ratones y combinaciones de trazadores, para estudios longitudinales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en los modelos de lesión de la sustancia blanca.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante coordenadas estandarizadas, parámetros de inyección y protocolos de disección de tejidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana del compromiso del objetivo en las vías de degeneración axonal.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo al modelar un subtipo de accidente cerebrovascular altamente prevalente pero poco estudiado, asociado al riesgo de demencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica y neuroanatomía murina para una correcta localización de la sustancia blanca.
- Depende de sistemas de inyección con presión calibrada y herramientas microquirúrgicas estériles para inducir lesiones de manera consistente.
- Necesita una estandarización entre equipos de trabajo en los protocolos de tinción histológica y de obtención de imágenes para lograr reproducibilidad en múltiples centros.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el modelo en diferentes fondos genéticos murinos o en condiciones comórbidas.
- Las limitaciones prácticas incluyen el pequeño tamaño del blanco, que requiere ajustes de coordenadas específicos según la cepa, y un cuidado postoperatorio minucioso para asegurar la supervivencia.
