Name: Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprende a inducir un modelo de infarto focal en la sustancia blanca subcortical de ratones mediante inyección estereotáctica de L-Nio. Este método permite estudiar la degeneración axonal y la respuesta microglial en neurociencia.

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SN y MDD recibieron el apoyo de los NIH K08 NS083740 y el Departamento de Neurología de la UCLA. AJG reconoce el apoyo por el Dr. Miriam y la Fundación de Investigación Sheldon G. Adelson Médica y la Fundación Larry L. Hillblom. KLN agradece el apoyo del Centro de Accidentes Cerebrovasculares Asociación Americana del Corazón 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS y STC fueron apoyados por el NIH R01 NS071481. JDH reconoce el apoyo de NIH K08 NS083740.

El uso de animales en este protocolo se ha realizado de acuerdo con los procedimientos aprobados por la Universidad de California en Los Ángeles Cuidado de Animales y el empleo. Nota: Comience por identificar la población objetivo murino. En estudios anteriores, de tipo salvaje ratones C57 / Bl6 solamente masculinas se han utilizado, sin embargo varios ratones transgénicos o knockout también se pueden utilizar. Tenga en cuenta que las coordenadas estereotácticas se basan en C57 / Bl6 anatomía. Se recomienda que cada usuario verificar inicialmente la localización de la carrera a la sustancia blanca. 1. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua medial <ol><li> Comience por la preparación de una pipeta de vidrio tirado usando tubo capilar 0,5 mm de tal manera que el diámetro distal es de entre 15 a 25 micras 11. </li><li> Preparar una alícuota de 10 l estéril de L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27,4 mg / ml (130 mM) en solución salina normal estéril al 0,9%. </li><li> Pre-llenar la pipeta de vidrio tiradocon un pequeño volumen de L-Nio (2-5 l) fijando el pipeta de vidrio a un tubo conectado a una línea de vacío. Acostar a la pipeta sobre la mesa de trabajo e introduzca el extremo tirado en la solución de L-Nio. <ol><li> Aplicar el vacío hasta que al menos 2 mm de la porción de 0,5 mm de la pipeta se llena. Apague el vacío y retirar la pipeta. Coloca a un lado hasta Paso 1.12. </li></ol></li><li> Coloque el ratón en una cámara de inducción e inducir anestesia del ratón usando estándar de 32% de isoflurano fluía a través de un vaporizador (5 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N 2) durante 1 min o hasta que profundamente anestesiados. Transferir el ratón para un aparato estereotáxico equipado con un microscopio estereotáctica. Proporcionar anestesia de mantenimiento utilizando 32% de isoflurano fluido a través de un vaporizador (2 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N 2) y un cono de nariz. Comprobar la profundidad de la anestesia con una pizca dedo del pie. </li><li> Ajuste el brazo de la inyección de 36 °. </li><li> Affixa sacó titular de la pipeta de vidrio al extremo distal de un sistema de inyección a presión de bajo volumen y adjuntarlo al brazo de la inyección de la configuración estereotáctica. </li><li> Escudo bigotes del animal anestesiado con vaselina y lugar artificial ungüento de lágrimas sobre ambos ojos. Preparar un campo quirúrgico estéril mediante la colocación de un campo estéril sobre la cabeza del animal con una abertura de 5 a 10 cm sobre la cabeza. Preparar una superficie quirúrgica aspetic por el afeitado de la piel que recubre el cráneo. Limpiar el cuero cabelludo con la alternancia de betadine y el 70% algodones con alcohol. </li><li> Hacer una incisión media de 1,5 cm del cuero cabelludo con unas tijeras finas estériles para exponer la superficie del cráneo. Se seca el cráneo con un hisopo de algodón estéril y usando un microscopio estereotáctica en 1-3x magnificación, retirar cualquier tejido del periostio que recubre el uso de una herramienta de punto de micro estéril. </li><li> Marcar el bregma como punto de referencia con un marcador de punta fina. </li><li> Perforar una craneotomía ellipitical 2 mm con una broca quirúrgica estéril fina stip0; comenzando posterior al bregma y que se extiende hacia delante justo a la izquierda de la línea media. Eliminar fragmentos de hueso y el tejido superior de blando, de manera que la corteza cerebral puede ser visualizado. </li><li> Mantenga el campo quirúrgico y la superficie cortical húmedo aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril. </li><li> Colocar una pipeta de vidrio tirado al brazo inyector del aparato estereotáxico. Alinear el extremo distal de la pipeta con la Bregma y poner a cero las coordenadas estereotácticas. </li><li> Avanzar en la pipeta a la primera anterior / posterior (A / P) y medial / lateral (M / L) coordenadas proporcionadas en la Tabla 1. </li><li> Avanzar en la pipeta a la superficie cortical y cero el ventral (V D /) medición dorsal /. </li><li> Pasar lentamente la pipeta en el cerebro hasta llegar a la primera D / V de coordenadas en la Tabla 1. </li><li> El uso de un sistema de inyección de baja presión de volumen ajustado a 20 psi durante 20 ms pulsos, inyectar 100 nl de L-Nio en el cerebro y esperar 5 minutos para prevenir el reflujohasta la pista de la pipeta. <ol><li> Utilizar una retícula calibrada en el ocular del microscopio estereotáctica y un aumento de 3 veces. </li><li> Por consiguiente, desplazar a un total de 0,100 mm 3 (0,5 mm de longitud en una pipeta 0,5 mm de diámetro, que corresponde a 100 nl) de la pipeta de vidrio tirado para cada conjunto de coordenadas. Mediante el uso de una retícula, medir y estandarizar ya que cada organizadas varía según la ampliación y las escalas utilizadas. </li><li> Para la medición exacta del volumen durante cada inyección, el enfoque de la pipeta en ángulo con el microscopio de un lado para que el menisco aire-líquido tiene una vista sagital. El menisco debe aparecer en el mismo plano focal, tanto de la pared interior y exterior de la pipeta. </li></ol></li><li> Retire lentamente la pipeta y repita los pasos 1.13-1.16.3 en el segundo y tercer conjunto de coordenadas que figuran en la Tabla 1. </li><li> Después de la inyección final, retire la pipeta y colocar la cera suficiente hueso para llenar el sitio de la craneotomía. UNpproximate los bordes de la herida del cuero cabelludo y se unen con adhesivo dérmico. </li><li> Inyectar 0,1 ml de 0,5% bupivacaína en los márgenes de la herida utilizando un 30 G aguja estéril para evitar para prevenir el dolor local asociado con la incisión del cuero cabelludo. </li><li> Devolver el animal a la vivienda y suministro de antibióticos postoperatorios (0,48 mg / ml de trimetoprim-sulfametoxazol, o 0,5 mg / ml levofloxacino) en el agua de bebida durante 5 días. </li></ol> 2. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua posterior <ol><li> Realice los pasos 1.1 a 1.12 como en el protocolo de enfoque en ángulo medial, excepto ajustar el brazo de la inyección de la configuración estereotáctica a 45 grados orientados anterior a la posterior. </li><li> Avanzar en la pipeta a la primera A / P y M / L de coordenadas que figuran en la Tabla 2. </li><li> pasos restantes completos 1.14-1.20 como en el protocolo de enfoque en ángulo lateral. </li></ol> 3. El etiquetado neuronal retrógrada <ol><li> Preparar una estéril 10alícuota l de L-Nio a 54,8 mg / ml en solución salina normal al 0,9%. </li><li> Preparar una alícuota estéril de 20% Fluororuby (o 20% de amina de dextrano biotinilado o 2% Fluorogold) en solución salina normal al 0,9%. </li><li> Diluir juntos 1: 1 para concentraciones finales de 27,4 mg / ml L-Nio y 10% Fluororuby. </li><li> Realizar el protocolo de ACV como anteriormente en las etapas 1.3-1.23. </li><li> Visualizar el trazador fluorescente de forma nativa en la sección de tejido mediante fijación por perfusión, cryosectioning y microscopía como se ha descrito previamente 8. </li></ol> 4. Procesamiento de tejidos para la inmunofluorescencia <ol><li> En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia a los ratones a través de la sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento. </li><li> Abrir la cavidad torácica con unas tijeras en ángulo e insertar una aguja 23 G de la mariposa en el ventrículo izquierdo. </li><li> Coloque una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras finas para permitir una vía de salida para el líquido de perfusión. </li><li> Transcardially perfundir con 30-40 ml de solución salina tamponada con fosfato fría, seguido de 30 a 40 ml de paraformaldehído al 4% frío a una velocidad de 10 ml / min a TA. </li><li> Decapitar al ratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo por detrás y luego retire con cuidado el cráneo recubre con una espátula, colocar el cerebro en frío PFA al 4% durante 24 horas, y luego se transfieren a un 30% de sacarosa en PBS durante 48 horas . </li><li> Preparar cuarenta secciones micras flotantes usando un criostato y realizar el procesamiento de anticuerpo como se describe anteriormente 6-8. En este estudio, utilice los siguientes anticuerpos: (: 500 dilución 1); de conejo anti-neurofilamentos 200 conejo anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); conejo anti-Iba-1 (1: 1.000). </li></ol> 5. Procesamiento de tejidos para la proteína o el análisis de ARN <ol><li> En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia mediante sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento. </li><li> decapitar alratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo posterior y retire suavemente el cráneo recubre con una espátula. </li><li> Insertar un 4 mm espátula estéril en la parte delantera del cerebro para cortar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Levante suavemente el cerebro fuera de la bóveda craneal y el lugar en tampón de disección enfriado con hielo (solución salina equilibrada de 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, glucosa 35 mM, bicarbonato de sodio 4 mM, y 0,01 mg / ml ciclohexamida). </li><li> El uso de un bloque de cerebro y cuchillas de afeitar estériles nuevas, preparar losas 2-3 mm que contienen la carrera y el lugar en el tampón de disección fría. </li><li> Bajo un microscopio de disección, identificar la materia blanca de la corteza motora subyacente en el hemisferio inyectado. A intervalos post-carrera más larga, la región puede ser identificado visualmente por necrosis focal y la palidez de la mielina. Nota: A intervalos post-ictus anteriores, la inyección de L-Nio mezcla con 1 l de 10% Fast Green puede permitir la identificación visual de la carrera ( <strong&gt; Figura 4A). </li><li> Bajo la guía de un microscopio de disección y el uso de un bisturí fresca, diseccionar cuidadosamente la región de la sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular, identificado por cualquiera de etiquetado verde rápida o pérdida de tejido. Retirar la corteza suprayacente y el cuerpo estriado subyacente si lo deseas. </li></ol>

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<li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

Un número de modelos anteriores de accidente cerebrovascular subcortical se han descrito incluyendo inyecciones focales de endotelina-1 en la cápsula interna, materia blanca subcortical y el cuerpo estriado en la rata y el ratón 12 a 14 6,15. Los modelos más recientes de pequeños accidentes cerebrovasculares focales han utilizado la inyección microembolias colesterol en la arteria carótida y la oclusión 16 photothrombotic de una sola de las arteriolas penetrantes 17. Cada uno ...

accidente cerebrovascular que afecta a la sustancia blanca subcortical es una entidad clínica común, que representa hasta el 25% de los accidentes cerebrovasculares clínicos anualmente en los EE. UU. 1. El daño isquémico de la sustancia blanca también ocurre de forma silenciosa a un ritmo significativamente mayor y contribuye al desarrollo de la demencia vascular 2,3. En la actualidad, los pacientes con esta forma de isquemia cerebral tienen pocas o ninguna opción de tratamiento. A pesar de la importancia clínica de esta enfermedad, existen pocos modelos animales clínicamente relevantes 4,5. 
El objetivo de este protocolo es producir una lesión isquémica focal dentro de la sustancia blanca murina. Este modelo murino de enfermedad humana permite el estudio específico de la respuesta a la lesión axonal al accidente cerebrovascular y cómo los elementos celulares de la sustancia blanca, a saber, oligodendrocitos y astrocitos junto con los axones, responden y se reparan después del accidente cerebrovascular.
Informes anteriores han descrito un modelo de accidente cerebrovascular de materia blanca subcortical utilizando endotelina-1 (ET-1) 6 que es similar al descrito aquí. Se han realizado varios cambios clave en el protocolo experimental, por lo que los usos potenciales de este modelo se han ampliado.7,8. Este protocolo proporciona una estrategia fiable y modificable para producir un trazo focal dentro de la materia blanca del cerebro del ratón. 
Las principales ventajas de este modelo son el uso de un inhibidor químico del óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitina HCl (L-Nio) 9 sin efectos paracrinos conocidos sobre los elementos celulares de la sustancia blanca, lo que había sido una complicación de los modelos que utilizaban endotelina-1 10. Además, la focalización estereotáctica de la materia blanca en el ratón permite el uso de cualquier variedad de cepas transgénicas o knockout, ampliando en gran medida las herramientas disponibles para determinar el efecto del ictus en la materia blanca del cerebro. Aquí, se describen dos variaciones de esta técnica y se demuestran algunas de las variaciones adicionales que se pueden utilizar para mejorar la comprensión del daño axonal y de la sustancia blanca y la reparación después de un accidente cerebrovascular.

<table><tbody><tr><td>L-N5-(1-iminoetil)ornitina, diclorhidrato</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>World Precision Instruments</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instrumentation</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>Configuración estereotáctica</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>KOPF</td><td>Modelo 720</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de disección roma</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Taladro</td><td>Dremel</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>Brocas</td><td>Fine Herramientas científicas</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim-Sulfamethaxole</td><td>STI Pharmacy</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Fluororuby</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>Toboganes de vidrio</td><td>Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G aguja de mariposa</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ciclohexamida</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca neurobiología

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Accidente cerebrovascular que afecta a las cuentas de la materia blanca de hasta el 25% de los accidentes cerebrovasculares presentaciones clínicas, se produce en silencio a velocidades que pueden ser 5-10 veces mayor, y contribuye de manera significativa al desarrollo de la demencia vascular. Pocos modelos de derrame cerebral focal materia blanca existen y esta falta de modelos apropiados ha dificultado la comprensión de los mecanismos neurobiológicos implicados en la respuesta lesión y reparación después de este tipo de accidente cerebrovascular. La principal limitación de otros modelos de accidente cerebrovascular subcortical es que no restrinjan de manera focal del infarto de la sustancia blanca o principalmente han sido validados en las especies no murinos. Esto limita la capacidad de aplicar la amplia variedad de herramientas de investigación murinos para estudiar la neurobiología de la carrera de la materia blanca. Aquí presentamos una metodología para la producción fiable de un derrame cerebral focal en la sustancia blanca murino mediante una inyección local de un inhibidor de eNOS irreversible. También presentamos algunas variaciones en el protocolo general entre ellos dos estereotáctica únicovariaciones, la localización neuronal retrógrada, así como el etiquetado de disección de tejido fresco y que en gran medida ampliar las posibles aplicaciones de esta técnica. Estas variaciones permiten múltiples enfoques para analizar los efectos neurobiológicos de esta forma común y poco estudiada de accidente cerebrovascular.

Usando el modelo presentado, la sustancia blanca subyacente extremidad anterior corteza sensoriomotora fiable puede ser objetivo. Este modelo accidente cerebrovascular inducida químicamente produce axonal focal y la pérdida de mielina, astrocitosis y microgliosis (Figura 1), como se ve típicamente en infartos lacunares humanos. Mediante el uso de tres inyecciones, un modelo de utilidad clínica se establece con deterioro temprano en las tareas motoras miembro delantero <s...

Aquí presentamos una metodología para la producción de un accidente cerebrovascular focal en la sustancia blanca murina mediante la inyección local de un inhibidor irreversible del óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) (L-Nio). Se presentan dos variaciones estereotácticas, el trazado neuronal retrógrado y el marcaje y disección de tejido fresco que amplían las aplicaciones potenciales de esta técnica.

Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

El objetivo general de este procedimiento es localizar con precisión un pequeño accidente cerebrovascular en la sustancia blanca de ratones para modelar esta forma común de accidente cerebrovascular subcortical en la sustancia blanca. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del accidente cerebrovascular, como los mecanismos de lesión axonal, la respuesta neuronal al accidente cerebrovascular subcortical y cómo los elementos celulares de la sustancia blanca responden tanto durante las fases aguda como de reparación del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para localizar con precisión un accidente cerebrovascular en la sustancia blanca, y puede emplearse con una amplia variedad de modelos murinos de ratón.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la pequeña cantidad de sustancia blanca, lo que provoca una mala localización del accidente cerebrovascular. Pueden ser necesarios ajustes menores en el ángulo de inyección o en las coordenadas estereotáxicas para cada cepa de ratón, o en la configuración estereotáxica. Comience primero fijando una pipeta de vidrio estirada a un tubo conectado a una línea de vacío.Introduzca el extremo estirado en la solución de L-Nio, o en L-Nio más trazador fluorescente. Inicie el vacío y aplique succión hasta que al menos dos milímetros de la porción de la pipeta con un diámetro de 0,5 milímetros estén llenos. Coloque la pipeta llena a un lado.Luego coloque el ratón en un aparato estereotáxico equipado con un microscopio estereotáxico. Después de anestesiar y preparar al ratón para la cirugía según los procedimientos aprobados, verifique la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie. No debe haber ninguna respuesta.A continuación, ajuste el brazo de inyección a 36 grados. Sujete un porta-pipeta de vidrio estirado al extremo distal de un sistema de inyección de bajo volumen con presión, y fíjelo al brazo de inyección. Después de realizar una incisión media en el cuero cabelludo de 1,5 centímetros para exponer el cráneo, seque la superficie del cráneo con un hisopo de algodón.Luego, observando a través de un microscopio estereotáctico con un aumento de uno a tres X, utilice una herramienta de micropunto para eliminar cualquier tejido perióstico sobreyacente. Marque el bregma con un marcador de punta fina. A continuación, use un taladro quirúrgico equipado con una broca quirúrgica de punta fina para realizar una craneotomía elíptica de dos milímetros, comenzando posteriormente en el bregma y extendiéndose anteriormente justo a la izquierda de la línea media.Retire los fragmentos óseos y los tejidos blandos superpuestos para que pueda visualizarse la corteza cerebral. Mantenga la superficie cortical húmeda aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril. A continuación, fije la pipeta llena al brazo inyector.Alinee el extremo distal de la pipeta con el bregma y ajuste a cero las coordenadas estereotácticas. Avance la pipeta hasta el primer punto de inyección utilizando las coordenadas anterior, posterior y medial-lateral indicadas en la tabla uno. Luego, avance la pipeta hasta la superficie cortical y ajuste a cero la medición dorsal-ventral.Baje lentamente la pipeta hasta las coordenadas dorsal-ventral. Asegúrese de que el aumento del microscopio estereotáctico esté ajustado a tres veces y de que la retícula calibrada pueda verse con claridad. Observe la pipeta en ángulo desde un lado para obtener una vista sagital del menisco entre el aire y el líquido.El menisco debe aparecer en el mismo plano focal tanto de la pared interna como de la externa de la pipeta. Ahora, utilizando un sistema de inyección por presión local ajustado a 20 PSI durante pulsos de 20 milisegundos, inyecte 100 nanolitros de L-Nio en el cerebro. Después de inyectar el volumen total, espere cinco minutos para prevenir el reflujo a lo largo del trayecto de la pipeta.A continuación, retire la pipeta y repita el procedimiento de inyección en el segundo y tercer conjunto de coordenadas proporcionados en la tabla uno. Después de la inyección final, retire la pipeta y coloque suficiente cera ósea para llenar el sitio de craneotomía. Finalmente, acerque los bordes de la herida del cuero cabelludo y sujételos con adhesivo dérmico.Después de administrar analgesia posoperatoria, coloque el animal en una jaula limpia. Administre antibióticos posoperatorios en el agua de bebida durante cinco días, o hasta el sacrificio si es menos de cinco días. Después de sacrificar y decapitar el ratón según los procedimientos aprobados, use tijeras estériles para abrir el cráneo por la parte posterior, y luego use una espátula para retirar suavemente el cráneo sobreyacente.A continuación, inserte una espátula estéril de cuatro milímetros en la parte frontal del cerebro para seccionar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Luego, levante suavemente el cerebro del cráneo y colóquelo en tampón de disección frío con hielo. Utilizando un bloque para cerebro y hojas de bisturí estériles, corte rebanadas de dos a tres milímetros que contengan la región afectada, y colóquelas en tampón de disección frío.Bajo un microscopio estereoscópico, identifique la sustancia blanca subyacente a la corteza motora en el hemisferio inyectado. En intervalos tempranos posteriores al accidente cerebrovascular, la inyección de L-Nio mezclado con colorantes de laboratorio comunes, como el verde rápido, puede permitir la identificación visual del accidente cerebrovascular. En intervalos más largos posteriores al accidente cerebrovascular, la región puede identificarse visualmente por necrosis focal y palidez de la mielina.Una vez identificada, use un escalpelo para diseccionar cuidadosamente la región de sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular. Retire la corteza sobreyacente y el estriado subyacente, según se desee. Como se muestra aquí, la marcación por inmunofluorescencia para filamentos neurales, mostrada en rojo, demuestra el grado de pérdida axonal siete días después del accidente cerebrovascular, utilizando el enfoque medial.Mediante el enfoque angulado posterior, la lesión por accidente cerebrovascular en la sustancia blanca se dirige justo por encima del ventrículo lateral y muestra una intensa reactividad microglial, tal como se detecta mediante inmunomarcado para IBA-1. Dos marcadores de filamentos intermedios de astrocitos, la vimentina, mostrada en rojo, y la proteína ácida fibrilar glial, mostrada en verde, revelan cambios en la morfología de los astrocitos de la sustancia blanca tras el accidente cerebrovascular. La coinyección de amina de dextrano fluorescente en el momento de la inducción del accidente cerebrovascular permite la identificación de neuronas individuales cuyos axones resultaron dañados por el accidente cerebrovascular.La mayor parte de la marcación ocurre en axones dentro de las neuronas de las capas cinco y seis de las cortezas sensoriomotoras primarias que recubren el área del accidente cerebrovascular. Esta imagen representa siete días después del accidente cerebrovascular. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 45 minutos, si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un accidente cerebrovascular focal en la materia blanca de un ratón y preparar el cerebro para una variedad de procesamientos posteriores, útiles para responder preguntas importantes en el estudio del accidente cerebrovascular y la reparación neurológica.

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Inducción de un accidente cerebrovascular de la sustancia blanca en un modelo murino utilizando un inhibidor de óxido nítrico

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