Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología

El objetivo general de este procedimiento es localizar con precisión un pequeño trazo dentro de la sustancia blanca murina para modelar esta forma común de trazo de la sustancia blanca subcortical. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del accidente cerebrovascular, como los mecanismos de la lesión axonal, la respuesta neuronal al accidente cerebrovascular subcortical y cómo responden los elementos celulares de la materia blanca durante las fases aguda y de reparación del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para localizar con precisión un trazo en la sustancia blanca, y se puede utilizar con una amplia variedad de modelos de ratón murino.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, debido a la pequeña cantidad de materia blanca que conduce a la mala localización del accidente cerebrovascular. Es posible que se requieran ajustes menores en el ángulo de inyección o en las coordenadas estereotácticas para cada cepa de ratón, o en la configuración estereotáctica. Comience colocando primero una pipeta de vidrio estirado en el tubo conectado a una línea de vacío.

Inserte el extremo tirado en la solución de L-Nio o en el trazador fluorescente L-Nio plus. Encienda la aspiradora y aplique succión hasta que se llenen al menos dos milímetros de la porción de 0,5 milímetros de diámetro de la pipeta. Deje a un lado la pipeta llena.

A continuación, coloque el ratón en un aparato estereotáctico equipado con un microscopio estereotáctico. Después de anestesiar y preparar al ratón para la cirugía de acuerdo con los procedimientos aprobados, verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. No debería haber respuesta.

A continuación, ajuste el brazo de inyección a 36 grados. Fije un soporte de pipeta de vidrio estirado en el extremo distal de un sistema de inyección de presión de bajo volumen y conéctelo al brazo de inyección. Después de hacer una incisión de 1,5 centímetros en la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo, seque la superficie del cráneo con un hisopo de algodón.

Luego, mientras observa a través de un microscopio estereotáctico, con un aumento de uno a tres veces, use una herramienta de micropuntos para eliminar cualquier tejido perióstico suprayacente. Marque bregma con un marcador de punta fina. A continuación, utilice un taladro quirúrgico equipado con una broca quirúrgica de punta fina para perforar una craneotomía elíptica de dos milímetros, comenzando posteriormente en el bregma y extendiéndose anteriormente justo a la izquierda de la línea media.

Retire los fragmentos óseos y el tejido blando suprayacente para que se pueda visualizar la corteza cerebral. Mantenga la superficie cortical húmeda aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril. A continuación, fije la pipeta llena al brazo del inyector.

Alinee el extremo distal de la pipeta con bregma y ponga a cero las coordenadas estereotácticas. Avance la pipeta hasta el primer punto de inyección utilizando las coordenadas anterior, posterior y medial-lateral enumeradas en la tabla uno. A continuación, avance la pipeta hasta la superficie cortical y ponga a cero la medición dorsal-ventral.

Baje lentamente la pipeta hasta las coordenadas dorsal-ventral. Asegúrese de que el aumento del microscopio estereotáctico esté ajustado a tres X y que la retícula calibrada se pueda ver claramente. Visualice la pipeta en ángulo desde un lado para que el menisco de líquido de aire tenga una vista sagital.

El menisco debe aparecer en el mismo plano focal de la pared interna y externa de la pipeta. Ahora, utilizando un sistema de inyección de presión local establecido en 20 PSI para pulsos de 20 milisegundos, inyecte 100 nanolitros de L-Nio en el cerebro. Después de inyectar el volumen total, espere cinco minutos para evitar el reflujo por la pista de pipeta.

A continuación, retire la pipeta y repita el procedimiento de inyección en el segundo y tercer conjunto de coordenadas proporcionadas en la tabla uno. Después de la inyección final, retire la pipeta y coloque suficiente cera ósea para llenar el sitio de la craneotomía. Finalmente, aproxime los bordes de la herida del cuero cabelludo y únalo con adhesivo dérmico.

Después de administrar la analgesia postoperatoria, coloque al animal en una jaula limpia. Suministrar antibióticos postoperatorios en el agua de bebida durante cinco días, o hasta el sacrificio si es inferior a cinco días. Después de sacrificar y decapitar al ratón de acuerdo con los procedimientos aprobados, use tijeras estériles para abrir el cráneo posteriormente, y luego use una espátula para quitar suavemente el cráneo suprayacente.

A continuación, inserte una espátula estéril de cuatro milímetros en la parte delantera del cerebro para cortar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Luego, levante suavemente el cerebro fuera del cráneo y colóquelo en un tampón de disección helado. Usando un bloqueador cerebral y hojas de afeitar estériles, corte rodajas de dos a tres milímetros que contengan la región afectada y colóquelas en un tampón de disección frío.

Bajo un microscopio de disección, identifique la materia blanca subyacente a la corteza motora en el hemisferio inyectado. En los intervalos más tempranos posteriores al accidente cerebrovascular, la inyección de L-Nio mezclada con tintes de laboratorio comunes, como el verde rápido, puede permitir la identificación visual del accidente cerebrovascular. A intervalos más largos después del accidente cerebrovascular, la región puede identificarse visualmente por necrosis focal y palidez de mielina.

Una vez identificado, use un bisturí para diseccionar cuidadosamente la región de materia blanca que contiene el trazo. Extirpe la corteza suprayacente y el cuerpo estriado subyacente, según se desee. Como se muestra aquí, el marcaje inmunofluorescente para filamentos neuronales, que se muestra en rojo, demuestra el grado de pérdida axonal siete días después del accidente cerebrovascular, utilizando el abordaje medial.

Utilizando el abordaje en ángulo posterior, la lesión del accidente cerebrovascular de la sustancia blanca se dirige justo por encima del ventrículo lateral y muestra una intensa reactividad microglial, como se detecta mediante inmunomarcaje para IBA-1. Dos marcadores de filamento intermedio de astrocitos, la vimentina, que se muestra en rojo, y la proteína ácida fibrilar glial, que se muestra en verde, revelan cambios en la morfología de los astrocitos de sustancia blanca después de un accidente cerebrovascular. La coinyección de amina dextrano fluorescente en el momento de la inducción del accidente cerebrovascular permite la identificación de neuronas individuales con axones lesionados por el accidente cerebrovascular.

La mayor parte del marcaje se produce en los axones dentro de las neuronas de la capa cinco y seis en las cortezas sensoriomotoras primarias que recubren el accidente cerebrovascular. Esta imagen representa siete días después de un accidente cerebrovascular. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 45 minutos, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un accidente cerebrovascular focal de materia blanca en un ratón y preparar el cerebro para una variedad de procesamiento posterior, útil para responder preguntas importantes sobre el accidente cerebrovascular y la reparación neurológica.