Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

El objetivo general de este experimento es investigar el comportamiento de sorción de oro por las proteínas de la capa S de la cepa bacteriana presentada desde un punto de vista ecológico y tecnológico. Estos métodos pueden responder a preguntas clave en la ciencia relacionada con el medio ambiente en tales campos como los procesos de sorción y la remoción y recuperación de metales. La principal ventaja de estas técnicas es que se puede detectar la sorción de metales y la adsorción de nanopartículas en otro rango de escala.

Mediante el uso de QCM-D es posible detectar esto en una medición en tiempo real. Para comenzar este procedimiento, equipe las celdas de fluido con maniquíes de sensores. Bombee al menos 20 mililitros por módulo de un agente limpiador líquido alcalino al 2% en agua ultrapura a través del QCM-D y el sistema de tubos.

Después de esto, bombee un volumen cinco veces mayor por módulo de agua ultrapura a través del sistema con un caudal de hasta 300 microlitros por minuto según el protocolo del fabricante. Limpie los sensores de dióxido de silicio fuera de los módulos de flujo mediante incubación en una solución de dodecil sulfato de sodio al 2% durante al menos 20 minutos. A continuación, enjuague los sensores varias veces con agua ultrapura.

Después de secar los cristales con aire comprimido filtrado, colóquelos en una cámara de limpieza de ozono durante 20 minutos. Después de esto, repita el procedimiento de limpieza dos veces para eliminar todo el contenido orgánico. Para eliminar los metales unidos a la superficie del sensor, enjuague los sensores con un molar de ácido nítrico.

A continuación, enjuague los sensores varias veces con agua ultrapura. A continuación, modifique los sensores con tres gramos por litro de capas alternas de polietilenimina y sulfonato de poliestireno mediante recubrimiento por inmersión utilizando la técnica capa a capa o LBL. Coloque los sensores dentro de la solución de polielectrolito adecuada en placas de pocillos profundos e incube estas durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, retire los sensores de la solución de polielectrolito y enjuáguelos intensamente con agua ultrapura entre cada paso del recubrimiento por inmersión. Una vez completada la modificación externa, coloque los sensores dentro del módulo de flujo. Equilibre los sensores enjuagándolos con agua ultrapura antes de comenzar los experimentos.

En este punto, disuelva el Slp1 previamente aislado y purificado en la fórmula urea para convertir los polímeros en monómeros. Centrifugar las proteínas monomerizadas a 15.000 veces g y 4 grados centígrados durante una hora para eliminar los aglomerados de proteínas más grandes. Mezclar el sobrenadante Slp1 solubilizado y centrifugado con tampón de recristalización hasta obtener una concentración final de proteína de 0,2 gramos por litro.

Después de una recristalización exitosa de la proteína en la parte superior de los sensores modificados con polielectrolito dentro de los módulos de flujo, enjuague los sensores recubiertos con tampón de recristalización intensamente con un caudal de 125 microlitros por minuto hasta que se detecten valores estables de frecuencia y cambios de disipación. Después de un recubrimiento exitoso de Slp1 en los módulos de flujo, enjuague intensamente la capa de Slp1 obtenida con tampón de citrato de 1,6 milimolares pH 5,0 hasta que se detecten valores estables de cambios de frecuencia y disipación. A continuación, bombee una solución de nanopartículas milimolares previamente preparada a los módulos de flujo con un caudal de 125 microlitros por minuto.

A continuación, rastree la adsorción de masa a la capa Slp1. Después de completar la interacción de nanopartículas metálicas, enjuague la capa con un tampón sin nanopartículas para eliminar los metales débiles unidos o las nanopartículas. Utilizando un microscopio de fuerza atómica o AFM con un microscopio óptico invertido, grabe imágenes en líquido utilizando agua ultrapura directamente en los sensores QCM-D recubiertos.

Enjuague los sensores con agua ultrapura después de los experimentos QCM-D y colóquelos dentro de la celda de fluido AFM. Utilice un voladizo con una frecuencia de resonancia de aproximadamente 25 kilohercios en el agua y una rigidez de menos de 0,1 newton por metro. Ajuste la velocidad de escaneo entre 2,5 y 10 micrómetros por segundo.

Tome imágenes en modo de contacto dinámico mientras el voladizo es excitado por un piezoeléctrico a su frecuencia de resonancia. Finalmente, determine la distancia del voladizo a la superficie mediante la amortiguación de oscilación. Las capacidades máximas de unión del metal del oro tres por Slp1 suspendido muestran que se unió de manera estable durante la incubación de 24 horas dentro del rango de pH investigado.

La disminución inmediata de la frecuencia indica una rápida adsorción y una alta afinidad de las proteínas con la superficie modificada con polielectrolitos. La disipación también aumenta inmediatamente, lo que indica una adsorción de moléculas viscoelásticas a la superficie debido a la rápida amortiguación que resulta en valores de disipación crecientes. Las nanopartículas de oro cero presintetizadas se incubaron con Slp1 y se analizaron mediante SDS-PAGE, que verificó los datos de QCM-D que muestran que las nanopartículas no alteran la estructura de Slp1.

La adsorción de nanopartículas de oro cero metálico presintetizadas se muestra para experimentos QCM-D en gráficos delta F-delta D y como perfiles de espesor y masa. Aquí se muestra la red de proteínas de Slp1 recristalizada en sensores modificados con polielectrolitos. La constante de red se determinó entre 13 y 14 nanómetros y el espesor de la capa resultó ser de 10 más o menos dos nanómetros.

Los estudios de AFM verificaron que después de la interacción de los tres oros, la red Slp1 permaneció completamente intacta, lo que confirma los resultados de QCM-D que predijeron la estabilidad del recubrimiento. AFM verifica la adsorción de nanopartículas de oro cero en la red Slp1, pero debido al tamaño de partícula, no siguen la simetría p4 de Slp1. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día hábil si se realiza correctamente.

Siguiendo estos métodos, se pueden realizar otras técnicas como la espectroscopia infrarroja o la microscopía de iones de helio para responder a otras preguntas, como miras de unión específicas o interacción con oro o nanopartículas de oro. La técnica presentada allanó el camino para que el uzrachem estudiara las interacciones de las biomoléculas con los metales y, por ejemplo, el comportamiento de adsorción y disorción en diferentes tipos de superficies. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo investigar las interacciones de los metales con solventes biológicos y, por favor, cuando esté utilizando este método, no olvide usar gafas, bata de laboratorio y, por supuesto, también guantes.