Name: Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a investigar la adsorción de oro mediante proteínas S-layer de Lysinibacillus sphaericus usando QCM-D, ICP-MS y AFM. Estas técnicas permiten detectar sorción de metales y nanopartículas en tiempo real para aplicaciones ecológicas.

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El presente trabajo fue parcialmente financiado por el IGF-proyecto &quot;S-tamiz&quot; (490 ZBG / 1), financiado por el BMWi y BMBF-proyecto &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A). Un agradecimiento especial a Tobias J. Günther por su valiosa ayuda durante los estudios de AFM y a Erik V. Johnstone por leer el manuscrito como un hablante nativo de Inglés. Además, el autor de este trabajo quiere agradecer a Aline Ritter y Sabrina Gurlit (del Instituto de Ecología de Recursos para la asistencia en las mediciones de ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava y el Grupo de Biotecnología del Instituto Helmholtz- Freiberg de Tecnología de Recursos.

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo estudiado la unión de Au a las proteínas de la capa S se investigó usando una combinación de diferentes métodos analíticos. En particular, la unión de Au es muy atractivo no sólo para la recuperación de Au de las aguas de minería o las soluciones del proceso, sino también para la construcción de materiales, por ejemplo, superficies sensoriales. Para los estudios de la interacción Au (Au (III) y Au (0) -NPs) con suspensión y monocapa de SLP1 recristalizado, la proteína tuvo que aislarse....

Debido al creciente uso del oro para diversas aplicaciones como la electrónica, catalizadores, biosensores, o instrumentos médicos, la demanda de este metal precioso ha crecido en los últimos pocos años 6-9. Oro, así como muchos otros metales preciosos y pesados ​​se liberan en el medio ambiente a través de efluentes industriales en concentraciones diluidas, a través de las actividades mineras, y la eliminación de residuos 7,8,10, aunque la mayor contaminación ambiental por metales pesados ​​o preciosos es un proceso en curso causado principalmente por las actividades tecnológicas. Esto conduce a una interferencia significativa de los ecosistemas naturales y potencialmente podría amenazar la salud humana 9. Conocer estos resultados negativos promueve la búsqueda de nuevas técnicas para eliminar los metales de los ecosistemas y las mejoras en el reciclaje de metales contaminados por las aguas residuales industriales. Métodos físico-químicos bien establecidos como precipitación o intercambio de iones no son tan eficaces, especialmente en altoly diluye soluciones 7,8,11. Biosorción, ya sea con la vida o la biomasa muerta, es una alternativa atractiva para el tratamiento de aguas residuales 10,12. El uso de tales materiales biológicos puede reducir el consumo de productos químicos tóxicos. Muchos microorganismos se han descrito para acumular o inmovilizar metales. Por ejemplo, las células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 han demostrado capacidades de unión altos para los metales preciosos, por ejemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), y otros metales tóxicos como el Pb (II) o U (VI) 4,13, las células de Bacillus megaterium para Cr (VI) 14, las células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) y Pd (II) 15, y Chlorella vulgar para Au (III) y U (VI) 16 , 17. La unión de los metales anteriores como Au (III), Pd (II) y Pt (II) también se ha informado de Desulfovibrio desulfuricans 18 y para L. sphaericus JG-B53 19,20. Sin embargo, no all microbios unen altas cantidades de metales y su aplicación como material de sorción es limitada 12,21. Además, la capacidad de unión a metal depende de diferentes parámetros, por ejemplo, la composición celular, la bio-componente utilizado, o ambientales y las condiciones experimentales (pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). El estudio de los fragmentos de pared celular aisladas 22,23, como los lípidos de membrana, peptidoglicano, proteínas u otros componentes, ayuda a entender el metal procesos de células enteras construidas complejas 8,21 vinculante. Los componentes de la célula se centraron en en este estudio son las proteínas de la capa S. Proteínas de la capa S son partes de la envoltura celular externa de muchas bacterias y arqueas, y que constituyen aproximadamente el 15 - 20% de la masa total de proteínas de estos organismos. A medida que la primera interfaz para el medio ambiente, estos compuestos celulares influyen fuertemente en las propiedades de sorción 3 bacterianas. Proteínas de la capa S con pesos moleculares que van desde los cuarentaa cientos de kDa se producen dentro de la célula, pero se ensamblan exterior, donde son capaces de formar capas en las membranas de lípidos o componentes de la pared celular poliméricos. Una vez aislado, casi todos los S-capa proteínas tienen la propiedad intrínseca de auto-ensamblan espontáneamente en suspensión, en las interfaces, o en superficies planas que forman o estructuras similares a tubos 3. El espesor de la monocapa de la proteína depende de la bacteria y se encuentra dentro de una gama de 5 - 25 nm 24. En general, las estructuras de las proteínas S-capa formada pueden tener un oblicua (P1 o P2), cuadrada (p4), o hexagonal (p3 o p6) simetría con constantes de red de 2,5 a 35 nm 3,24. La formación de celosía parece ser en muchos casos dependientes de cationes divalentes y principalmente en Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). Sin embargo, la cascada de la reacción completa de plegado monómero, la interacción monómero-monómero, la formación de un enrejado, y el papel de diferentes metales, especialmente de cationes divalentes tales como Ca 2+ y Mg 2+, todavía no se entiende completamente. La cepa grampositivos L. sphaericus JG-B53 (renombrado de Bacillus sphaericus después de nueva clasificación filogenética) 27 se aisló de la minería del uranio pila de residuos &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, Sajonia, Alemania) 4,28,29. Su proteína S-capa funcional (SLP1) posee una red cuadrada, un peso molecular de 116 kDa 30, y un espesor de 10 nm sobre ≈ células de las bacterias que viven 31. En estudios anteriores, la formación in vitro de una capa de proteína cerrado y estable con un espesor de aproximadamente 10 nm se logró en menos de 10 min 19. La cepa relacionada L. sphaericus JG-A12, también un aislamiento de la pila &quot;Haberland&quot;, posee capacidades de unión de alta de metal y su proteína aislada S-capa ha mostrado buenos índices de absorción alta estabilidad química y mecánica y para los metales preciosos como el Au (III), Pt (II), y Pd (II) 4,32,33. Esta unión de los metales preciosos es más o menos específica para algunos metales y depende de la disponibilidad de grupos funcionales en la proteína de superficie exterior e interior del polímero y en sus poros, la fuerza iónica, y el valor pH. Grupos funcionales relevantes para la interacción de metal por las proteínas son COOH, NH2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - y SO. En principio, la capacidad de unión a metal abren un amplio espectro de aplicaciones, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). por ejemplo, como componentes biosorptive para la eliminación o la recuperaciónde metales tóxicos o valiosos disueltos, plantillas para la síntesis o deposición definido de nanopartículas estructuradas regularmente metálicos (NPS) para la catálisis y otros materiales de bioingeniería como capas bio-sensorial 3,5,18,33. Arrays NP dispuestos regularmente como Au (0) -NPs podrían ser utilizados para las principales aplicaciones que van desde la electrónica molecular y biosensores, dispositivos de almacenamiento de densidad ultra alta, y catalizadores para la oxidación de CO-34-37. El desarrollo de este tipo de aplicaciones y el diseño inteligente de estos materiales requiere una comprensión más profunda de los mecanismos de unión de metales subyacentes. Un requisito previo para el desarrollo de tales materiales de origen biológico es la implementación fiable de una capa de interfaz entre la biomolécula y la superficie técnica 38,39. Por ejemplo, polielectrolitos ensamblan con la capa por capa (LBL) 40,41 técnica se han utilizado como una capa de interfaz para la recristalización de las proteínas de la capa S-39 </sup&gt;. Tal interfaz ofrece una forma relativamente fácil de realizar el recubrimiento de proteína de una manera reproducible y cuantitativa. Mediante la realización de diferentes experimentos con y sin modificación con promotores adhesivos, es posible hacer declaraciones con respecto a la cinética de revestimiento, la estabilidad de la capa, y la interacción de los metales con biomoléculas 19,42, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)). Sin embargo, el complejo mecanismo de la adsorción de proteínas y la interacción proteína-superficie no se entiende completamente. Especialmente información sobre la conformación, la orientación de patrones, y densidades de recubrimiento sigue desaparecido. Cuarzo microbalanza de cristal con el monitoreo de disipación (QCM-D) técnica ha llamado la atención en los últimos años como una herramienta para el estudio de la adsorción de proteínas, la cinética de revestimiento, y la interacción proprocesos en la escala nanométrica 19,43-45. Esta técnica permite la detección detallada de la adsorción de masas en tiempo real, y se puede utilizar como un indicador para el proceso de auto-montaje de proteínas y el acoplamiento de moléculas funcionales en redes de proteínas 19,20,42,46-48. Además, las mediciones QCM-D abren la posibilidad de estudiar los procesos de interacción de metal con la capa proteínica en condiciones biológicas naturales. En un estudio reciente, la interacción de la proteína S-capa con metales seleccionados como Eu (III), Au (III), Pd (II) y Pt (II) se ha estudiado con QCM-D 19,20. La capa de proteína adsorbida puede servir como un modelo simplificado de una pared celular de las bacterias gram-positivas. El estudio de este componente único puede contribuir a una mayor comprensión de la interacción metal. Sin embargo, únicamente los experimentos QCM-D no permiten declaraciones con respecto a las estructuras superficiales y las influencias de los metales a la proteína. Otras técnicas son necesarias para obtener dicha información. Uno posbilidad de imágenes bio-nanoestructuras y la obtención de información sobre las propiedades estructurales es la microscopía de fuerza atómica (AFM). El objetivo del estudio presentado fue investigar la sorción de oro (Au (III) y Au (0) -NPs) a las proteínas de la capa S, en particular SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Los experimentos se realizaron con las proteínas en suspensión en la escala de proceso por lotes en un intervalo de pH de 2,0 - 5,0 usando ICP-MS y con S-capas inmovilizadas utilizando QCM-D. Además, la influencia de la solución de sal de metal sobre la estabilidad de celosía se investigó con los estudios de AFM posteriores. La combinación de estas técnicas contribuye a una mejor comprensión de los procesos de interacción in vitro de metal en como una herramienta para aprender más acerca de los acontecimientos en las células bacterianas enteras respecto afinidades metálicos específicos vinculante. Este conocimiento no sólo es crucial para el desarrollo de materiales de filtración aplicables para la recuperación de metales para la protección ambiental y la conservación de la re49 fuentes, sino también para el desarrollo de matrices de NPs metálicas altamente ordenadas para diversas aplicaciones técnicas.

<table><tbody><tr><td><Equipo > fuerte y software</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorreactor, Vapor en el lugar 70L Sistema piloto</td><td>Applikon Biotechnology, Países Bajos</td><td>Z6X</td><td>Incluyendo dO2, sensores de pH de Applikon Biotechnology y BioXpert software V2 Monitor de</td></tr><tr><td>biomasa no invasivo BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), EE. UU</td>. <td>Espectrómetro Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td> Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Gran Bretaña</td><td>80-2109-10</td><td>Empresa ahora GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>Microcentrífuga MiniStar</td><td>VWR, Alemania</td><td>521-2844</td><td>Para la centrifugación de muestras de cultivo</td></tr><tr><td>Microscopio para sistema de investigación BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Alemania</td><td>037006</td><td>Microscopio en combinación con el software de imagen</td></tr><tr><td>Cell^P (versión 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, M&uuml; nster, Alemania</td><td>---</td><td>junto con el microscopio</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot sistema de separación Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, EE. UU.</td><td>9010PLT</td><td>Para la recolección de biomasa</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Alemania</td><td>431-2601</td><td>Para la eliminación de flagelos y la homogeneización de muestras</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Centrífuga Superspeed</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU</td>. <td>728411</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr><tr><td>de proteínas Procesador móvil de fluido de alto cizallamiento, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, EE. UU.</td><td>M110EH30K</td><td>Utilizado para la ruptura celular</td></tr><tr><td>Liofilizador Alpha 1-4 LSC</td><td>Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Alemania</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>Espectrofotometría UV-VIS (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU</td>. <td>91-ND-2000C-L</td><td>Para la determinación de proteínas concentración</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN cámara de electroforesis vertical</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Múnich, Alemania</td><td>165-3322</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Múnich, Alemania</td><td>1708030</td><td>Se utiliza para la obtención de imágenes de geles SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), EE. UU.</td><td>N8120536</td><td>Para la determinación de la concentración</td></tr> <tr><td>de metalesZetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido</td><td>ZEN3600</td><td>Para la determinación del tamaño de las nanopartículas</td></tr>, <tr><td>dispositivo Q-Sense E4&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia</td><td>QS-E4</td><td>pedido a través de LOT quantum design (software incluido con la plataforma E4)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (registro de datos)</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (evaluación y modelado de datos)</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulos de flujo QCM-D QFM&nbsp; 401 y nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia</td><td>QS-QFM401</td><td>pedido a través de LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; Sensores piezoeléctricos de cuarzo de corte AT 303 SiO2</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia</td><td>QS-QSX303</td><td>solicitado a través de LOT quantum design</td></tr><tr><td>Cámara de limpieza de ozono</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), EE. UU.</td><td>QS-ESA006</td><td>ordenado a través de LOT Quantum</td></tr><tr><td>Design Microscopio de fuerza atómica MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Bárbara (CA), EE. UU.</td><td>MFP-3DBio</td><td>Software de medición e imagen AFM</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR Versión 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Bárbara (CA), EE. UU</td><td></td>---<td>software de imágenes incluido en Cat. No. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Versión Pro 6.3.2.3 Software</td><td>WaveMetrics, Inc., EE. ---</td><td></td> <td>el software de imagen incluido en el nº de cat. No. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Bárbara (CA), EE. UU</td>. <td>Bioheater</td><td>Calentador de muestra para mediciones AFM</td></tr><tr><td>Biolever mini voladizo,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Alemania LLC, Alemania</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Voladizo preferido para mediciones de AFM</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L. , España</td> software <td>gratuito</td><td>para el análisis de AFM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Detergentes y otros equipos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido ácido, 100 %, P.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>Líquidos y vapores peligrosos, inflamables y corrosivos. Causa quemaduras graves en la piel y daño ocular.</td></tr><tr><td>Antiespumante 204</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>A6426</td><td>Para supresión de espuma</td></tr><tr><td>, azul de bromofenol, sal de sodio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brillante R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa II del bazo porcino</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>D4138</td><td>Tipo IV, 2.000 - 6.000&nbsp; Etanol de Kunitz unidades/mg de proteína</td></tr><tr><td>, 95%</td><td>VWR, Alemania</td><td>20827.467</td><td>Peligro,</td></tr><tr><td>glicerina inflamable, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Clorhidrato de guanidina (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>Peligro; Corrosivo, utilizado para el ajuste</td></tr><tr><td>del pH Lisozima de clara de huevo de gallina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>Polvo liofilizado, proteína = 90 %, = 40.000 unidades/mg de proteína (Sigma)&nbsp;</td></tr><tr><td>Agitador magnético con calentamiento,&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Alemania</td><td>504.10100.00</td><td>Agitador estándar dentro</td></tr><tr><td>del experimento NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>Ácido nítrico (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>Peligro; Oxidante, corrosivo</td></tr><tr><td>PageRuler Escalera de proteínas sin teñir</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poly(4-estirenosulfonato de sodio) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>243051</td><td>Mw promedio ~ 70,000</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI), ramificada</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>Advertencia; Nocivo, irritante, peligroso para el medio ambiente; promedio Mw ~25,000</td></tr><tr><td>Carbonato de potasio anhidro (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>Advertencia; </td></tr><tr><td>Ribonucleasa A dañina del páncreas bovino&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>R5503</td><td>Tipo I-AS, 50 - 100 unidades Kunitz/mg de proteína&nbsp;</td></tr><tr><td>Azida de sodio (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td>106688 Peligro; muy tóxico y peligroso para el medio ambiente</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr> <tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L-5750</td><td>Peligro; tóxico</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>Peligro; Corrosivo, utilizado para la regulación del pH dentro del cultivo y el ajuste del pH</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, Membrana de diálisis, MWCO 50,000&nbsp;</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>Peligro; Corrosivo, utilizado para la regulación del pH en el cultivo</td></tr><tr><td>Ácido tánico (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>Advertencia; Nocivo, peligroso para el medio ambiente</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Tubos de ultrafiltración</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>Peligro, tóxico</td></tr></tbody></table>

au-interacción de slp1 polímeros y monocapa de<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, icp-ms y afm como herramientas para estudios biomolécula metálicos

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

En esta publicación se describe el comportamiento de sorción de oro de las proteínas de la capa superficial (capa S) (Slp1) de Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Estas biomoléculas se disponen en matrices bidimensionales paracristalinas en las superficies, se unen a los metales, por lo que son interesantes para varias aplicaciones biotecnológicas, como los materiales biosorptivos para la eliminación o recuperación de diferentes elementos del medio ambiente y los procesos industriales. La deposición de nanopartículas de Au(0) en capas S, ya sea por síntesis dirigida a la capa S 1 o por adsorción de nanopartículas, abre nuevas posibilidades para diversas aplicaciones sensoriales. Aunque numerosos estudios han descrito las propiedades biosorptivas de las capas S 2-5, una comprensión más profunda de la interacción proteína-proteína y proteína-metal sigue siendo un desafío. En el siguiente estudio, se utilizó la espectrometría de masas acoplada inductivamente (ICP-MS) para la detección de la sorción de metales por capas S en suspensión. Esto se correlacionó con las mediciones de la microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que permite la detección en línea de la formación de monocapas proteicas y la deposición de metales y, por lo tanto, una comprensión más detallada de la unión de metales.
Los resultados de ICP-MS indicaron que la unión de Au(III) a los polímeros de la capa S en suspensión depende del pH. La unión máxima de Au(III) se obtuvo a pH 4.0. Las investigaciones de QCM-D permitieron la detección de la sorción de Au(III), así como la deposición de Au(0)-NPs en tiempo real durante los experimentos in situ. Además, este método permitió estudiar la influencia de la unión de metales en la estabilidad de la red de proteínas de Slp1. Las propiedades estructurales y la estabilidad de la capa de proteínas se pudieron visualizar directamente después del experimento QCM-D utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). En conclusión, la combinación de estos diferentes métodos proporciona una comprensión más profunda de la unión de metales por parte de las proteínas bacterianas de la capa S en suspensión o como monocapas en células bacterianas o superficies recristalizadas.

Cultivo de Microorganismos y SLP1 Caracterización Los datos registrados del crecimiento bacteriano indica el final de la fase de crecimiento exponencial en alrededor de 5 hr. Investigaciones anteriores han demostrado que SLP1 se puede aislar desde este punto de cosecha (4,36 g / L biomasa húmeda (≈ 1,45 g / L (BDW)) con un rendimiento máximo 19. Sin embargo, la optimización del cultivo mediante el u...

Para obtener información básica sobre la sorción y el reciclaje de oro de sistemas acuosos, se investigó la interacción de las nanopartículas de Au(III) y Au(0) en las proteínas de la capa S. La sorción de polímeros proteicos se investigó por ICP-MS y la de monocapas proteicas por QCM-D. El AFM posterior permite la obtención de imágenes de las nanoestructuras.

Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

El objetivo general de este experimento es investigar el comportamiento de sorción de oro mediante proteínas de la capa S de la cepa bacteriana presentada desde un punto de vista ecológico y tecnológico. Estos métodos pueden responder preguntas clave en ciencias relacionadas con el medio ambiente, como los campos de los procesos de sorción y la eliminación y recuperación de metales. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten detectar la sorción de metales y la adsorción de nanopartículas en otro rango de escala.Mediante el uso de QCM-D es posible detectar esto en una medición en tiempo real. Para comenzar este procedimiento, equipar las celdas de fluido con sensores simulados. Bombear al menos 20 mililitros por módulo de un agente limpiador líquido alcalino al 2% en agua ultrapura a través del sistema de QCM-D y tubos.A continuación, haga pasar a través del sistema un volumen cinco veces mayor por módulo de agua ultrapura con un caudal de hasta 300 microlitros por minuto según el protocolo del fabricante. Limpie los sensores de dióxido de silicio situados fuera de los módulos de flujo mediante incubación en una solución al 2% de dodecilsulfato de sodio durante al menos 20 minutos. Luego, enjuague los sensores varias veces con agua ultrapura.Después de secar los cristales con aire comprimido filtrado, colóquelos en una cámara de limpieza con ozono durante 20 minutos. A continuación, repita el procedimiento de limpieza dos veces para eliminar todos los contenidos orgánicos. Para eliminar los metales unidos de la superficie del sensor, enjuague los sensores con ácido nítrico uno molar.Luego, enjuague los sensores varias veces con agua ultrapura. A continuación, modifique los sensores con capas alternadas de polietilenimina y poliestireno sulfonato a tres gramos por litro mediante recubrimiento por inmersión utilizando la técnica de capa por capa o técnica LBL. Coloque los sensores dentro de la solución de polielectrolito adecuada en placas de pocillos profundos e incúbelos durante 10 minutos a temperatura ambiente.Luego, retire los sensores de la solución de polielectrolito y enjuáguelos entre cada paso de recubrimiento por inmersión intensivamente con agua ultrapura. Una vez completada la modificación externa, coloque los sensores dentro del módulo de flujo. Equilibre los sensores enjuagándolos con agua ultrapura antes de comenzar los experimentos.En este punto, disuelva previamente el Slp1 aislado y purificado en fórmula de urea para convertir los polímeros en monómeros. Centrifugue las proteínas monomerizadas a 15.000 ×g y 4 grados Celsius durante una hora para eliminar los aglomerados proteicos más grandes. Mezcle el sobrenadante de Slp1 solubilizado y centrifugado con tampón de recristalización hasta alcanzar una concentración proteica final de 0,2 gramos por litro.Después de la recristalización exitosa de la proteína sobre los sensores modificados con policatión dentro de los módulos de flujo, enjuague los sensores recubiertos intensivamente con tampón de recristalización a un caudal de 125 microlitros por minuto hasta que se detecten valores estables de cambios en frecuencia y disipación. Tras el recubrimiento exitoso con Slp1 en los módulos de flujo, enjuague intensivamente la capa de Slp1 obtenida con tampón de citrato 1,6 milimolar, pH 5,0, hasta que se detecten valores estables de cambios en frecuencia y disipación. A continuación, bombee una solución previamente preparada de nanopartículas de un milimolar hacia los módulos de flujo con un caudal de 125 microlitros por minuto.Luego, realice el seguimiento de la adsorción de masa en la capa de Slp1. Tras finalizar la interacción con la nanopartícula metálica, enjuague la capa con tampón libre de nanopartículas para eliminar los metales o nanopartículas débilmente unidos. Utilizando un microscopio de fuerza atómica o AFM con un microscopio óptico invertido, registre imágenes en líquido utilizando agua ultrapura directamente sobre los sensores recubiertos de QCM-D.Lave los sensores con agua ultrapura después de los experimentos de QCM-D y colóquelos dentro de la celda de fluidos del MFA. Utilice un cantiléver con una frecuencia de resonancia de aproximadamente 25 kilohercios en agua y una rigidez inferior a 0,1 newton por metro. Ajuste la velocidad de escaneo entre 2,5 y 10 micrómetros por segundo.Obtenga imágenes en modo de contacto dinámico mientras la ménsula es excitada por un piezoeléctrico en su frecuencia de resonancia. Finalmente, determine la distancia entre la ménsula y la superficie mediante la amortiguación de la oscilación. Las capacidades máximas de unión al metal del oro tres mediante Slp1 en suspensión muestran que se mantuvo establemente unido durante la incubación de 24 horas dentro del rango de pH estudiado.La disminución inmediata de la frecuencia indica una adsorción rápida y una alta afinidad de las proteínas por la superficie modificada con policatión. La disipación también aumenta inmediatamente, lo que indica la adsorción de moléculas viscoelásticas a la superficie debido a una amortiguación rápida que resulta en valores crecientes de disipación. Se incubaron nanopartículas de oro pre-sintetizadas con Slp1 y se analizaron mediante electroforesis SDS-PAGE, lo que confirmó los datos de QCM-D, mostrando que las nanopartículas no alteran la estructura de Slp1.Se muestra la adsorción de nanopartículas de oro metálico cero previamente sintetizadas en experimentos QCM-D mediante gráficos delta F-delta D y como perfiles de espesor y masa. Aquí se muestra la red proteica de Slp1 recristalizada sobre sensores modificados con polielectrolitos. La constante de red se determinó en 13 a 14 nanómetros y el espesor de la capa se encontró que era de 10 ± 2 nanómetros.Los estudios mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) verificaron que tras la interacción con oro tres, la red de Slp1 permaneció completamente intacta, lo cual confirma los resultados de QCM-D que predijeron la estabilidad del recubrimiento. La AFM verifica la adsorción de nanopartículas de oro cero sobre la red de Slp1, pero debido al tamaño de las partículas, estas no siguen la simetría p4 de Slp1. Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en un solo día laborable si se lleva a cabo correctamente.Tras seguir estos métodos, se pueden realizar otras técnicas como espectroscopía infrarroja o microscopía de iones de helio para responder preguntas adicionales, como los sitios específicos de unión o la interacción con oro o nanopartículas de oro. La técnica presentada allanó el camino para que el uzrachem estudie las interacciones de las biomoléculas con metales y, por ejemplo, el comportamiento de adsorción y desorción sobre diferentes tipos de superficies. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo investigar las interacciones de los metales con disolventes biológicos; y por favor, cuando utilice este método, no olvide usar gafas protectoras, bata de laboratorio y, por supuesto, guantes.

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Investigación

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Química

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Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos (Video) | JoVE Journal

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