Recolección de subpoblaciones leucémicas: un método para la separación espacial de subpoblaciones de células leucémicas a partir del cocultivo 2D

- Cuando las células leucémicas se cocultivan con células estromales mesenquimales, interactúan con las células estromales y forman tres subpoblaciones. Células suspendidas que flotan libremente, células de fase brillante adheridas a la superficie de la monocapa mesenquimal y células de fase diminuta debajo de la monocapa mesenquimatosa. Para separar cada subpoblación, tome una placa de cultivo de tejidos con una monocapa de células estromales mesenquimales.

Siembra células leucémicas presentes en medios de cultivo específicos del tumor en la monocapa e incuba la placa durante el tiempo deseado. A continuación, recoja las células tumorales en suspensión pipeteando las células que flotan libremente en un tubo separado. Ahora, agregue el medio fresco a la placa y pipetee vigorosamente para desalojar las células tumorales de fase brillante de la superficie de la monocapa mesenquimal.

Recoja estas células pipeteándolas en un tubo separado. Agregue tripsina a la placa para eliminar las células mesenquimales adheridas. Agregue suero fetal bovino, o FBS, para detener la acción de la tripsina y romper los agregados celulares. Ahora, recoge las células de atenuación de fase en un tubo. Centrifugar los tres tubos que contienen diferentes subpoblaciones celulares individualmente y volver a suspender el pellet en medios frescos para su posterior análisis. En el siguiente protocolo, aislaremos células leucémicas en suspensión, de fase brillante y de fase atenuada de cocultivo 2D.

- Para recolectar la subpoblación de tumores en suspensión, aspire el medio de la placa de cocultivo de células leucémicas y use el mismo medio para enjuagar suavemente la placa una vez. Luego, transfiera la subpoblación de células leucémicas en suspensión flotante a un tubo cónico de 15 mililitros. Para cosechar la subpoblación de tumores de fase brillante, agregue 10 mililitros de medio fresco nuevamente a la placa de cocultivo

y enjuague aproximadamente cinco veces con suficiente fuerza, para eliminar las células leucémicas adheridas sin desalojar la monocapa de células adherentes. Luego, transfiera la subpoblación de fase brillante a su propio tubo cónico de 15 mililitros. Para recolectar la subpoblación tumoral de fase diminuta, elimine el medio restante con un enjuague de PBS de un mililitro y separe las células con tres mililitros de tripsina a 37 grados centígrados.

Después de cinco minutos, golpee suavemente los lados de la placa para desalojar las células adheridas, seguido de la adición de un mililitro de FBS para detener la reacción enzimática. Luego, enjuague el suero de tres a cinco veces para separar los agregados de células grandes y transferir la subpoblación de fase atenuada no purificada a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Cuando se hayan recolectado todas las subpoblaciones, gire las celdas y vuelva a suspender cada uno de los gránulos en un mililitro de medio precalentado.