El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de Coxiella burnetii

El objetivo general de este experimento es desarrollar un método LAMP simple utilizando reactivos liofilizados para la detección de C. burnetii en muestras de pacientes. La principal ventaja de este protocolo es que no se requiere entrenamiento para el almacenamiento de los reactivos. Este método es ideal para su uso en entornos de recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Tatiana, una técnica de nuestro laboratorio. Comenzando con el ADN para el gen objetivo IS1111a de C.burnetii RSA493, determine la concentración de plásmidos con un espectrofotómetro a 260 nanómetros. Convierta la concentración de ADN del plásmido en número de copias utilizando los siguientes cálculos, donde 6330 es igual a la longitud y los pares de bases del plásmido, y 34,2 nanogramos por microlitro es la concentración del plásmido, como se acaba de determinar utilizando el espectrofotómetro.

A continuación, prepare diluciones en serie de 8 a 10 veces del plásmido para llegar al siguiente número de copias por microlitro. Para preparar la plantilla de ADN para la reacción LAMP, comience con 200 microlitros de muestras de plasma humano y, con el kit de minipreparación de ADN, extraiga el ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Diluya la muestra final en un volumen de 20 microlitros.

Prepare 1 mililitro de tampón de reacción 2x LAMP combinando los siguientes reactivos. Mezclar por pulso-vórtice durante 10 segundos. Para realizar la reacción LAMP estándar, en un tubo de PCR de 0,2 mililitros, mezcle 12,5 microlitros de tampón LAMP 2x, 1,2 microlitros de mezcla de cebador, 1 microlitro de ADN polimerasa Bst y 5,3 microlitros de agua.

A continuación, agregue 5 microlitros de ADN a la reacción de 20 microlitros y mezcle bien, luego incube a 60 grados centígrados en un baño de agua o bloque calefactor durante 60 minutos. Después de la incubación, finalice la reacción agregando 5 microlitros de tampón de carga de gel 10x al tubo. A continuación, cargue 5 microlitros de los productos de reacción en un gel de agarosa al 2% teñido con tinción de ácido nucleico intercalante.

Ejecute el gel en 1x TBE a 100 voltios durante 35 minutos, luego use luz ultravioleta para visualizar los resultados. Para realizar la reacción LAMP con reactivos reconstituidos, prepare 1 mililitro de tampón de reconstitución combinando los siguientes reactivos. Mezclar por pulso-vórtice durante 10 segundos.

A continuación, retire los tubos que contenían los reactivos liofilizados de la bolsa de papel de aluminio sellada. Para el paso 4.2, es muy importante asegurarse de que la bolsa de papel de aluminio esté correctamente sellada antes de abrirla. No utilice los tubos si la bolsa de aluminio no está sellada o está dañada.

Agregue 20 microlitros de tampón de reconstitución a cada tubo de reactivos y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Asegúrese de que los reactivos liofilizados se vuelvan a suspender por completo. A continuación, añada 5 microlitros de molde de ADN a los reactivos reconstituidos y mezcle bien.

Incubar a 60 grados centígrados en un baño de agua o bloque calefactor durante 60 minutos. Para finalizar la reacción después de la incubación, agregue 5 microlitros de tampón de carga de gel 10x, luego agregue 5 microlitros de los productos de reacción sobre un gel de agarosa al 2% teñido con tinción de ácido nucleico intercalante. Ejecute el gel en 1x tampón TBE a 100 voltios durante 35 minutos, luego visualice los resultados con luz ultravioleta.

Para realizar la reacción LAMP con azul de hidroxinaftol, o HNB, o colorante intercalante, prepare 1 mililitro de tampón de reconstitución combinando los siguientes reactivos que incluyen HNB o un colorante intercalante fluorescente. Mezclar por pulso-vórtice durante 10 segundos. Lleve a cabo la reacción LAMP como se acaba de describir y utilice luz ultravioleta o a simple vista para visualizar los resultados.

Para realizar la reacción LAMP con un escáner de tubos, agregue 5 microlitros de ADN a los reactivos reconstituidos que contienen el colorante fluorescente intercalado, luego inserte el tubo cerrado en el escáner de tubos. Ajuste la temperatura de incubación a 60 grados centígrados y mida la fluorescencia a 520 nanómetros durante 60 minutos. Esta figura muestra los resultados de la reacción LAMP en geles de agarosa con reactivos recién preparados y reactivos liofilizados.

Observe que el reactivo liofilizado mantiene su actividad. Las reacciones LAMP preparadas por ambos reactivos detectaron 25 copias de la plantilla de ADN. En esta figura, se muestra la detección de los productos de la reacción con HNB o colorante intercalante fluorescente en la reacción.

La adición de HNB a la reacción produce un cambio de color visual, de púrpura a azul, con 25, 50 y 100 copias de la plantilla de ADN presente en las reacciones. Además, la inclusión de colorante fluorescente intercalado en la reacción muestra una fuerte señal fluorescente con luz ultravioleta cuando hay números de copias de ADN similares. Aquí se muestran los resultados del uso del escáner de tubos para monitorear las señales fluorescentes en tiempo real con tinte fluorescente intercalante.

Las señales fluorescentes están por encima de la línea de base después de 14, 18, 21 y 23 minutos, con 10^6, 10^4, 10^3 y 100 copias de la plantilla de ADN en las reacciones. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en 90 minutos. Después de su desarrollo, este ensayo allanó el camino para el diagnóstico rápido de la infección por Coxiella burnetii en áreas de recursos limitados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstituir los reactivos LAMP liofilizados. No olvide que las muestras del paciente pueden ser infecciosas y siempre se deben tomar precauciones de seguridad al realizar este procedimiento.