El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de

El objetivo general de este experimento es desarrollar un método LAMP sencillo que utilice reactivos liofilizados para la detección de C.burnetii en muestras de pacientes. La principal ventaja de este protocolo es que no se requiere refrigeración para el almacenamiento de los reactivos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.

La procedura será demostrada por Tatiana, una técnica de nuestro laboratorio. Comenzando con el ADN del gen diana IS1111a de C.burnetii RSA493, determine la concentración del plásmido mediante un espectrofotómetro a 260 nanómetros. Convierta la concentración de ADN plasmídico en número de copias utilizando los siguientes cálculos, donde 6330 equivale a la longitud en pares de bases del plásmido, y 34,2 nanogramos por microlitro es la concentración del plásmido, tal como se determinó recientemente usando el espectrofotómetro.

Luego, prepare diluciones seriadas de 8 a 10 veces del plásmido para obtener el siguiente número de copias por microlitro. Para preparar la plantilla de ADN para la reacción de LAMP, comience con 200 microlitros de muestras de plasma humano y, utilizando el kit de minipreparación de ADN, extraiga el ADN según el protocolo del fabricante. Diluya la muestra final en un volumen de 20 microlitros.

Prepare 1 mililitro de tampón de reacción LAMP 2x combinando los siguientes reactivos. Mezcle mediante vortexeo breve durante 10 segundos. Para realizar la reacción LAMP estándar, en un tubo PCR de 0,2 mililitros, mezcle 12,5 microlitros de tampón LAMP 2x, 1,2 microlitros de mezcla de cebadores, 1 microlitro de polimerasa Bst ADN y 5,3 microlitros de agua.

A continuación, agregue 5 microlitros de ADN a la reacción de 20 microlitros y mezcle bien; luego incube a 60 grados Celsius en un baño de agua o bloque calefactor durante 60 minutos. Después de la incubación, detenga la reacción agregando 5 microlitros de tampón de carga para geles 10x al tubo. A continuación, cargue 5 microlitros de los productos de la reacción en un gel de agarosa al 2 % teñido con un colorante intercalante de ácidos nucleicos.

Corra el gel en TBE 1x a 100 voltios durante 35 minutos, luego utilice luz UV para visualizar los resultados. Para realizar la reacción LAMP con reactivos reconstituidos, prepare 1 mililitro de tampón de reconstitución combinando los siguientes reactivos. Mezcle mediante vortex de pulso durante 10 segundos.

A continuación, retire los tubos que contenían los reactivos liofilizados de la bolsa de aluminio sellada. Para el paso 4.2, es muy importante asegurarse de que la bolsa de aluminio esté correctamente sellada antes de abrirla. No utilice los tubos si la bolsa de aluminio no está sellada o está dañada.

Agregue 20 microlitros de tampón de reconstitución a cada tubo de reactivos y mezcle pipeteando arriba y abajo cinco veces. Asegúrese de que los reactivos liofilizados se resuspendan completamente. Luego, agregue 5 microlitros de la plantilla de ADN a los reactivos reconstituidos y mezcle bien.

Incubar a 60 grados Celsius en un baño de agua o bloque térmico durante 60 minutos. Para finalizar la reacción después de la incubación, añadir 5 microlitros de tampón de carga para geles 10x y luego agregar 5 microlitros de los productos de reacción en un gel de agarosa al 2 % teñido con un colorante intercalante de ácidos nucleicos. Correr el gel en tampón TBE 1x a 100 voltios durante 35 minutos, luego visualizar los resultados mediante luz ultravioleta.

Para realizar la reacción LAMP con azul de hidroxinaftol, o HNB, o un colorante intercalante, prepare 1 mililitro de tampón de reconstitución combinando los siguientes reactivos que incluyen HNB o un colorante intercalante fluorescente. Mezcle mediante vortex de pulso durante 10 segundos. Lleve a cabo la reacción LAMP como se acaba de describir y utilice luz UV o el ojo desnudo para visualizar los resultados.

Para realizar la reacción LAMP con un escáner de tubos, agregue 5 microlitros de ADN a los reactivos reconstituidos que contienen el colorante fluorescente intercalante, luego inserte el tubo cerrado en el escáner de tubos. Establezca la temperatura de incubación en 60 grados Celsius y mida la fluorescencia a 520 nanómetros durante 60 minutos. Esta figura muestra los resultados de la reacción LAMP en geles de agarosa con reactivos recién preparados y reactivos liofilizados.

Observe que el reactivo liofilizado mantiene su actividad. Las reacciones de LAMP preparadas con ambos reactivos detectaron 25 copias de la plantilla de ADN. En esta figura, se muestra la detección de los productos de la reacción con HNB o con colorante fluorescente intercalante en la reacción.

La adición de HNB a la reacción produce un cambio de color visible, de púrpura a azul, con 25, 50 y 100 copias de la plantilla de ADN presentes en las reacciones. Además, la inclusión de un colorante intercalante fluorescente en la reacción muestra una señal fluorescente intensa con luz ultravioleta cuando están presentes números similares de copias de ADN. Aquí se muestran los resultados obtenidos al usar el escáner de tubos para monitorear en tiempo real las señales fluorescentes con el colorante intercalante fluorescente.

Las señales fluorescentes están por encima de la línea base tras 14, 18, 21 y 23 minutos, con 10^6, 10^4, 10^3 y 100 copias de la plantilla de ADN en las reacciones. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en 90 minutos. Tras su desarrollo, este ensayo allanó el camino para el diagnóstico rápido de la infección por Coxiella burnetii en áreas con recursos limitados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstituir reactivos LAMP liofilizados. No olvide que las muestras de pacientes pueden ser infecciosas y que siempre se deben tomar precauciones de seguridad al realizar este procedimiento.