Name: El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de Coxiella burnetii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende el método LAMP con reactivos liofilizados para detectar Coxiella burnetii en muestras de pacientes. Esta técnica isotérmica simplifica el diagnóstico de la fiebre Q en entornos con recursos limitados.

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Esta investigación fue apoyada por el Centro de Investigación Médica de la Marina, la unidad de trabajo de investigación 6000.RAD1.J.A0310. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente la política oficial o la posición del Departamento de la Marina, el Departamento de Defensa, o el gobierno de Estados Unidos. Wei Mei-Ching es un empleado del gobierno de Estados Unidos. Este trabajo fue preparado como parte de sus funciones oficiales. Título 17 USC §105 establece que &quot;La protección de copyright bajo este título no está disponible para toda la obra del Gobierno de los Estados Unidos. &#39; Título 17 USC § 101 define una obra gobierno de Estados Unidos como un trabajo preparado por miembro del servicio militar o empleado del gobierno de Estados Unidos como parte de las funciones oficiales de esa persona.

1. Preparar diluciones de ADN plásmido como estándar para la reacción LAMP <ol><li> Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica (DO) a 260 nm para determinar el plásmido (que contiene IS1111a gen diana de C. burnetii RSA 493) la concentración de ADN. Un OD 260 de 1 equivale a 50 g / l de ADN. </li><li> Convertir la cantidad de ADN plásmido en el número de copias. Dado que el tamaño del plásmido es 6330 pb, el peso molecular de este plásmido es 4,1 x 10 6 g (6.330 pb x 649 g / bp). La concentración de ADN del plásmido es 34,2 ng / l (como se determina a partir del paso 1.1). 1 l de esta muestra de ADN contiene 34,2 ng de ADN plásmido, lo que equivale a 5 x 10 9 copias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) de ADN. </li><li> Añadir 10 l de ADN plásmido (5 x 10 9 copias / l) a 90 l de agua para una dilución de 10 veces para hacer una muestra de ADN de 5 x 10 8 copias / l. </li><li> Repita el paso 1.3 para preparar muestras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, y 5 x 10 0 copias / l. </li></ol> 2. Prepare la plantilla de ADN de muestras para la reacción LAMP <ol><li> Extraer ADN de muestras de plasma humano usando un kit Mini comercial de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Use un total de 200 muestras l para la extracción y eluir el ADN extraído en un volumen de 20 l. </li></ol> 3. Preparar 2x tampón de reacción LAMP se <ol><li> Mezclar 200 l de 10x tampón de Pol, 320 l de 5 M trimetilglicina, 12 l de 1 M MgSO 4, 280 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno) y 188 l de agua para hacer 1 ml de tampón 2x LAMP. Mezcle en un vórtex durante 10 s. </li></ol> 4. Realizar la lámpara estándar de Reacción <ol><li> Mezclar 12,5 l de 2x LATampón MP (tal como se preparó en el paso 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mM mezcla dNTP), 1,2 l de mezcla de cebador, 1 l de ADN polimerasa Bst (8 U / l), y 5,3 l de agua para hacer la mezcla de reacción (20 l) en un tubo de PCR de 0,2 ml. </li><li> Añadir 5 l de ADN (del paso 1 o 2) a la mezcla de reacción de 20 l y mezclar bien. </li><li> Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento. Esta es la temperatura óptima de reacción previamente determinada. </li><li> Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción. </li><li> Cargar 5 l de productos de reacción en un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos. </li><li> gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE. </li><li> Visualizar los resultados por la luz UV. </li></ol> 5. Realizar reacción LAMP con reconstituidoreactivos <ol><li> Mezclar 125 l de 10x tampón, Pol 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO 4, 667,5 l de agua para hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s. </li><li> Retire los tubos que contienen los reactivos liofilizados de la bolsa de papel de aluminio sellado. No utilizar los tubos si la bolsa de papel de aluminio no está cerrado o si está dañado. </li><li> Añadir 20 l de tampón de reconstitución en cada tubo para resuspender los reactivos liofilizados. </li><li> Mezclar pipeteando arriba y abajo de tampón 5 veces. Echar un vistazo para asegurarse de que los reactivos liofilizados están completamente re-suspendido. El polvo blanco debe desaparecer en el tubo. </li><li> Añadir 5 l de molde de ADN (de la etapa 1 o 2) a los reactivos reconstituidos y mezclar bien. </li><li> Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento. </li><li> Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción. </li><li> De carga 5 l de reacciónproductos a un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos. </li><li> gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE. </li><li> Visualizar los resultados por la luz UV. </li></ol> 6. Realizar LAMP reacción con tampón de reconstitución que contiene HNB fluorescente o colorante intercalante <ol><li> Mezclar 125 l de 10x de Pol Buffer, 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO 4, 7,5 l de HNB 20 mM (o 12,5 l de 100x colorante fluorescente de intercalación) y 660 l (o 655 l) de agua a hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s. </li><li> Utilice el tampón reconstituido preparado en la sección 6 para repetir los pasos 5.2 - 5.6. </li><li> Visualizar los resultados por el ojo desnudo (de reacción que contiene HNB) o una luz UV (de reacción que contiene el colorante intercalante fluorescente). </li></ol> 7. Realizar reacción LAMP en tiempo real con escáner Tubo <ol><li> Añadir 5 l de ADN para la reconstituted reactivos que contienen colorante intercalante fluorescente, cerca del tubo y la inserta en el escáner de tubo. </li><li> Ajuste la temperatura de incubación a 60 ° C. Medir la fluorescencia a 520 nm durante 60 min. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
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<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
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<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Anteriormente, hemos desarrollado un ensayo de lámpara sensible y específico de orientación del elemento de inserción 14 IS1111a. El elemento IS1111 fue seleccionado porque es muy conservadas entre las diferentes cepas de C. burnetii y su alto número de copias (7-110) en la bacteria (Klee 2006). Nuestros resultados muestran que la lámpara puede detectar aproximadamente 25 copias del elemento IS1111, que puede correlacionarse con tan poco como una copia cromosómica del ADN <...

La pequeña bacteria Gram-negativa Coxiella burnetii es el agente causante de la fiebre Q, que es una zoonosis en todo el mundo. Debido a la distribución mundial de la fiebre Q y la alta infectividad de C. burnetii, personal militar y civil de Estados Unidos desplegadas en el extranjero están en riesgo de ser infectados en las áreas endémicas. La fiebre Q se manifiesta en dos formas: infecciones agudas y crónicas. La fiebre Q aguda se presenta con síntomas similares a la gripe, hepatitis, o la neumonía, y suele ser una enfermedad autolimitada con una baja tasa de mortalidad. Q-fiebre crónica, mientras que menos frecuente, a menudo resulta en endocarditis, que tiene una tasa de mortalidad mucho más alta si se deja sin tratamiento 1,2. Por lo tanto, el diagnóstico precoz para guiar un tratamiento adecuado es fundamental para el cuidado del paciente. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han desarrollado ensayos para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Tanto PCR y qPCR son costosos ya menudo no es fácilmente disponible en las zonas con recursos limitados para el trabajo de rutina. Originalmente descrito por Notomi 6, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ofrece un método de amplificación de ADN alternativo. Lámpara utiliza ADN polimerasa Bst para la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena junto con conjuntos de cebadores especialmente diseñados que reconocen al menos seis regiones independientes del gen diana. La ventaja más significativa de LAMP es que la amplificación se produce en condiciones isotérmicas. Por lo tanto, sólo se requiere un baño de agua, calentador o una incubadora. Este método ha sido utilizado para detectar varios patógenos rickettsias 7-9. La visualización de los productos de ADN amplificados por electroforesis en gel es el método más preciso que puede diferenciar verdaderos positivos de falsos positivos debido a la amplificación no específica. Sin embargo, los procedimientos involucrados en la electroforesis en gel no son prácticos para ar de recursos limitadosEAS. Varios métodos alternativos han sido desarrollados para detectar los productos de reacción. Estos alternativa, como turbidez derivado de la formación de pirofosfato de magnesio 10 o el uso de un colorante intercalante fluorescente para ser visualizado con luz UV 11,12 son más favorables que la ejecución de un gel. Los reactivos de LAMP fueron estables durante un mes cuando se almacenaron a 25 ° C y 37 ° C, que son las temperaturas ambiente en los países tropicales y subtropicales donde la fiebre Q es endémica 13. Un ensayo de lámpara fue desarrollado en nuestro laboratorio para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de plasma 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la preparación de la mezcla de reacción LAMP a partir de los reactivos liofilizados. Los reactivos liofilizados son estables durante un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Cuando se combina con un método de visualización fácil, esto es un método ideal para usar para la detección de C. burnetii en un entorno de recursos limitados.

<table><tbody><tr><td>Imprimaciones LAMP</td><td>Eurofins MWG operón</td><td>10 nmol, sin sal</td><td>Secuencia diseñada por el cliente</td></tr><tr><td>Bst ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 unidades/ml</td></tr><tr><td>10x Tampón Thermo pol</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mezcla</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada uno</td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, trimetilglicina</td></tr><tr><td>Sulfato</td><td>de magnesio Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>tampón de carga de gel</td></tr><tr><td>SYBR verde</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualizar productos en tubos</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualizar productos en geles</td></tr><tr><td>Reactivos liofilizados</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de hidroxinaftol</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQercánder de tubo</td><td>Qiagen</td><td></td><td>detección en tiempo real</td></tr></tbody></table>

el desarrollo de la mediación de la loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; coxiella burnetii</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, el agente que causa la fiebre Q, es una bacteria intracelular obligado. Ensayos de diagnóstico basado en la PCR se han desarrollado para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas. PCR requiere un equipo especializado y una amplia formación de usuario final, y por lo tanto, no es adecuado para el trabajo de rutina especialmente en un área de recursos limitados. Hemos desarrollado un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de pacientes. Este método se realiza a una única temperatura de alrededor de 60 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento. La sensibilidad de este ensayo LAMP es muy similar a la PCR con un límite de detección de aproximadamente 25 copias por reacción. Este informe describe la preparación de la reacción usando reactivos liofilizados y visualización de los resultados utilizando azul de hidroxinaftol (HNB) o una lámpara de UV con colorante intercalante fluorescente en la reacción. Los reactivos de LAMP fueron lyophilizeta y se almacena a temperatura ambiente (RT) durante un mes, sin pérdida de sensibilidad de detección. Este ensayo LAMP es particularmente robusto porque la preparación de la mezcla de reacción no implica pasos complejos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.

Los reactivos liofilizados de LAMP en el interior del tubo de 0,2 ml contiene ADN polimerasa Bst, cebadores y dNTPs. 20 l de tampón de reconstitución se utiliza para volver a suspender los reactivos liofilizados. La figura 1 muestra los resultados de la reacción de lámpara en geles de agarosa con reactivos recién preparados y reactivos liofilizados. El reactivo liofilizado no reduce su actividad. LAMP reacciones preparados por ambos reactivos puede detectar 25 c...

Describimos aquí un método simple de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que utiliza reactivos liofilizados para la detección de C. burnetii en muestras de pacientes.

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

El objetivo general de este experimento es desarrollar un método LAMP sencillo que utilice reactivos liofilizados para la detección de C.burnetii en muestras de pacientes. La principal ventaja de este protocolo es que no se requiere refrigeración para el almacenamiento de los reactivos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.La procedura será demostrada por Tatiana, una técnica de nuestro laboratorio. Comenzando con el ADN del gen diana IS1111a de C.burnetii RSA493, determine la concentración del plásmido mediante un espectrofotómetro a 260 nanómetros. Convierta la concentración de ADN plasmídico en número de copias utilizando los siguientes cálculos, donde 6330 equivale a la longitud en pares de bases del plásmido, y 34,2 nanogramos por microlitro es la concentración del plásmido, tal como se determinó recientemente usando el espectrofotómetro.Luego, prepare diluciones seriadas de 8 a 10 veces del plásmido para obtener el siguiente número de copias por microlitro. Para preparar la plantilla de ADN para la reacción de LAMP, comience con 200 microlitros de muestras de plasma humano y, utilizando el kit de minipreparación de

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Domesle, K. J., et al. Amplificación isotérmica mediada por lazos para el cribado de Salmonella en alimentos de origen animal y la confirmación de Salmonella por aislamiento en cultivo.  J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar un gen bacteriano objetivo amplificando el ADN a temperatura constante. La mezcla de reacción se prepara añadiendo una mezcla maestra isotérmica, cebadores específicos para el gen...

Amplificación isotérmica mediada por lazo para la detección de genes bacterianos

Este video muestra un método para evaluar el crecimiento intracelular de mutantes de Coxiella marcados con GFP dentro de células epiteliales cultivadas. El fenotipo mutante se visualiza mediante inmunotinción y microscopía de epifluorescencia, lo que permite estudiar el efecto de la mutación sobre el crecimiento intracelular.

Evaluación del crecimiento intracelular de mutantes de Coxiella dentro de células eucariotas

El diagnóstico de la infección por Eimeria en pollos sigue siendo exigente. Los enfoques basados en la morfología de los parásitos y la patología del huésped suelen no ser concluyentes, mientras que los enfoques moleculares basados en la PCR han demostrado ser exigentes en cuanto a coste y experiencia. El objetivo de este protocolo es establecer la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) como un diagnóstico molecular sencillo para la infección eimeriana.

Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectan pollos

Provided es un protocolo para desarrollar un ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real para cuantificar la concentración inicial de muestras de ADN utilizando un termociclador o un microscopio y calentador de etapa. También se describe el desarrollo de un control positivo interno. Se proporcionan scripts para procesar datos de fluorescencia sin procesar en tiempo real.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

La investigación de las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus anfitriones es un área importante de la investigación biológica. A continuación, describimos las técnicas necesarias para medir la translocación efector por Coxiella burnetii durante siRNA silenciamiento de genes utilizando sustrato Blam.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Este protocolo describe la fabricación de una cinta pequeña, lista para usar que se puede aplicar para detección visual de varios ácidos nucleicos en una prueba individual, que es fácil de operar. En este enfoque, una gama capilar fue utilizada para la detección multiplex y altamente eficiente de los objetivos de la OMG.

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.

Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

El presente trabajo describe los pasos para producir qPCR lista para usar para la detección de ADN de T. cruzi que puede precargarse en el recipiente de reacción y almacenarse en el refrigerador durante varios meses.

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