Name: La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate Ciona intestinalis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende microinyección y electroporación en embriones de Ciona intestinalis para estudiar regulación génica y desarrollo de cordados. Este método permite investigar redes regulatorias y mecanismos conservados en biología evolutiva.

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Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Innsbruck, Austria, y la Academia Austriaca de Ciencias (ÖAW).

1. Preparativos para la microinyección y electroporación en Ciona Huevos y cigotos <ol><li> Preparar 10 L de agua de mar artificial con HEPES (ASWH) para el cultivo de embriones. Disolver mM NaCl 420, 9 mM KCl, 10 mM de CaCl2 · 2H 2 O, mM MgCl 24,5 2 · 6H 2 O, 25,5 mM de MgSO4 · 7H 2 O y 2,15 mM de NaHCO3 en agua doblemente destilada (ddH2O) por agitación durante la noche. Añadir 5 mM HEPES pH 8,0, y verificar / ajustar el pH a 8,0. Almacenar el ASWH a 4 ° C. Deje que se caliente a 18 ° C y filtrar con papel de filtro antes de su uso. </li><li> Preparar 20x solución dechorionation inactivada: 20% tioglicolato de sodio, 1% en pronasa ASWH. Almacenar 500 ml de alícuotas a -20 ° C, y se diluye hasta un volumen final de 10 ml ASWH antes de su uso. </li><li> Preparar 15 a 20 placas de cultivo de los huevos / embriones. Verter fundida de agarosa al 1% en ASWH en 3,5, 5, 9 ó 15 cm de petri platos, recubrimiento con una capa delgada de 1-2 mm.Deje que la agarosa solidifique y cubrir las placas con ASWH. Existencias de las mismas a 4 ° C durante 1-2 semanas como máximo. Vuelva a colocar la ASWH antes de su uso. </li><li> Preparar platos especiales de inyección. <ol><li> Verter una capa gruesa de 5-7 mm de fundido 1% de agarosa en una placa de Petri de 5 cm, y colocar un molde en la agarosa (tal como un cierre de bloqueo de cremallera, pegada a una hoja de la cubierta de plástico) para producir una muesca a la solidificación de la agarosa que pueden contener los huevos. Preparar 4 a 5 platos de inyección y cubrir con ASWH. Almacenar a 4 ° C y reemplazar con ASWH fresca antes de su uso. Utilice únicamente placas nuevas para inyección (máximo un día de edad). </li></ol></li><li> Preparar β-galactosidasa (LacZ) tampón de tinción: mM MgCl 1 2 · 6H 2 O, 3 mM de K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] en tampón fosfato- de solución salina (PBS) con Tween (PBT) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 0,05% de Tween). i tiendan la oscuridad a 4 ° C. Preparar sustrato LacZ ß-D-galactopiranósido 5-Bromo-4-cloro-3-indolilo (X-gal, 10 U / ml) en alícuotas de 40 mg / ml en dimetilformamida (DMF) y las existencias almacenar a -20 ° C hasta utilizar. </li><li> Remojar pipetas Pasteur de grifo agua durante la noche para evitar que los embriones se peguen. </li><li> Preparar agujas de inyección. <ol><li> Configurar un extractor de micropipeta en condiciones tales como calor 425, tire 75, la velocidad y la hora 75 200 (a partir de un ensayo de la rampa de filamento de 415). </li><li> Tire de 4 a 5 capilares de vidrio que contiene filamentos para producir 8 a 10 agujas largas y finas normalmente cerrados en la punta. Almacenar las agujas en la caja de aguja libre de polvo, que se adjunta para doblar la cinta adhesiva sobre un soporte elevado, para evitar romper las puntas y que es conveniente para el llenado de la aguja. NOTA: Prueba de las agujas obtenidos mediante la inyección de un par de huevos con colorante vital verde (como se describe en la sección 6) y ajustar la aguja tirando de las condiciones para obtener una forma de punta que permite afinado y repetitive inyección como se describe en 6.6. </li></ol></li><li> Preparar la solución de inyección. Preparar 4 l de solución de inyección, por ejemplo, compuesto de 1 l de MO 2 mM, 2 l de 10 mg / l colorante vital verde y 1 l ddH2O Añadir una concentración final de 0,05 a 0,5 g / l capsulado mRNA o 20 ng / l de ADN plásmido de acuerdo con la pregunta experimental. Mezclar bien. Mantener en hielo si la solución contiene ARNm. </li></ol> 2. Recolección de gametos <ol><li> Dissect Ciona adultos en un 18 ° C enfriaron habitación embrión. Utilice pequeñas tijeras y empezar desde el extremo que se opone a los sifones en el lado de la exhalación (más corto) de sifón según el cual el oviducto y el tramo de conducto de esperma. </li><li> Exponer el oviducto y delicadamente hacer una incisión en el oviducto usando la punta de las tijeras. Caída de los huevos que fluye hacia fuera directamente en una placa de 6 pocillos que contiene ASWH presionando suavemente el oviducto con las tijeras cerradas despojándose de la p.ej.gs. La transferencia de los huevos restantes con una pipeta Pasteur pre-aclaró con ASWH. </li><li> Depositar los huevos de diferentes animales en diferentes pozos. Observe la calidad de los huevos bajo el microscopio de disección. NOTA: los huevos bien desarrollados son redondos y de color rosa con un color ligeramente amarillento. Están rodeados por una capa vitelina no celular, el corion que se forma un espacio perivitelino bien definido alrededor del huevo. El corion se asocia con células de prueba en sus células del folículo dentro y en forma de estrella en su exterior. Huevos de baja calidad a menudo carecen del espacio perivitelino o las células del folículo. Aparecen menos redonda, más granular o de diferente color. ovocitos inmaduros son más pequeños y tienen un color blanco plateado. </li><li> Cortar el conducto de espermatozoides con las tijeras y recoger esperma concentrado en un tubo de 1,5 ml usando una pipeta Pasteur separada. En común el esperma de diferentes animales (al menos dos) en el mismo tubo. espermatozoides se almacenan a 4 ° C durante varios días. </li></ol> 3.Fertilización <ol><li> Recoger esperma y los huevos a 18 ° C como se describe en el paso 2. </li><li> Activar el esperma. <ol><li> Preparar 1 ml ASWH en un tubo de 1,5 ml y se mezcla con 50 l de 1 M Tris pH 9,5. A continuación, añadir 20 l de esperma concentrado y mezclar suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Verificar la activación de espermatozoides en una gota de esperma se coloca sobre una cubierta de una pequeña placa de Petri o un portaobjetos de vidrio y observar bajo el microscopio de disección. Los espermatozoides deben nadar frenéticamente. </li></ol></li><li> Añadir 100 a 200 l de la solución de esperma activado a cada pocillo de huevos (que contienen entre 100 y 1.000 huevos), se mezclan bien pipeteando arriba y abajo, por lo que los huevos están flotando en el medio. Esperar durante 10 minutos sin mover los embriones. </li></ol> 4. dechorionation de huevos y embriones <ol><li> Diluir una alícuota de 500 l de solución de dechorionation 20x a 10 ml en ASWH. Activar la solución dechorionation mediante la adición gota a gota 200 l de 2.M NaOH 5 a la solución dechorionation 10 ml 1x. se forma un precipitado lechoso. mezclar suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Recoger los huevos o zigotos (después de la 10 min esperar en el paso 3.3) en tubos de vidrio usando una pipeta Pasteur. Agrupar los huevos de 2 a 3 animales en un tubo (alrededor de 1.000-5.000 huevos / tubo). Los sedimentos con una centrífuga mano haciendo girar a alta velocidad (1.200 xg) durante aproximadamente 20 segundos para formar un pellet de embriones en la parte inferior del tubo. suspenderlo en forma gradual la centrífuga y retire la ASWH con una pipeta Pasteur. </li><li> Añadir 4 ml de solución dechorionation activado para los huevos / cigotos sedimentadas en cada tubo. Suspender los huevos / cigotos pipeteando suavemente arriba y abajo con una pipeta Pasteur del grifo tratada con agua rematado con una pequeña pera de goma. La solución debe girar amarillento después de 1-3 min. </li><li> Siga el dechorionation mediante la eliminación de una pequeña alícuota de la suspensión de huevos dechorionating / cigoto con la pipeta Pasteur. Depositar una gota en un portaobjetos y observar bajo la s diseccióncapa pluvial. Mantenga el pipeteado de huevos / cigotos arriba y abajo y comprobar cada 20-30 segundos. NOTA: Las primeras células del folículo se desprenden, a continuación, el corion se vuelve amarillo y opaco, y, finalmente, que se separe de los zigotos. Pink dechorionated huevos / cigotos se hundirán hasta el fondo del tubo de vidrio. El dechorionation no debería tomar más de máx. 5 minutos. </li><li> Llenar el tubo con ASWH vez el 50% de los huevos / cigotos se dechorionated. NOTA: Muy suavemente centrífuga (8 x g) durante aproximadamente 10-15 segundos correspondiente a una velocidad muy baja lo suficiente para sedimentar los huevos / embriones dechorionated. detener lentamente la centrífuga como para no perturbar el pelet de huevos / cigotos en la parte inferior del tubo. </li><li> Retirar casi todo el líquido desde el tubo de vidrio que incluye el material flotante con huevos / cigotos incompletamente dechorionated y reemplazar con ASWH. Lentamente pipetear arriba y abajo para lavar y centrifugar suavemente de nuevo como en el paso 4.2. Como alternativa, espere cigotos que se establecen por la gravedad. Lavar una vez más hasta que no haya residuos corion es lEFT. </li><li> Huevos / cigotos de transferencia a placas de cultivo utilizando una pipeta Pasteur recién enjuagarse. Mantenga los cigotos (no huevos) a baja densidad (alrededor de 200 embriones por placa de 10 cm) para evitar que se peguen entre sí. La cultura de los embriones a la etapa deseada a temperaturas entre 13 y 20 ° C. Alternativamente, electroporate los cigotos (paso 5) o inyectar los huevos no fecundados (Paso 6). </li></ol> 5. La electroporación <ol><li> Fertilizar los huevos y dechorionate los cigotos a 18 ° C como en las secciones 3 y 4. Proporcionan entre 50 y 400 huevos por muestra electroporación. </li><li> Preparar 50 l de ADN plásmido en un tubo de 1,5 ml (máx. 100 g de ADN plásmido en 50 l de ddH2O) y añadir 200 l 0,95 M manitol. Mezclar bien con un vórtex. </li><li> Despacho y la gravedad sedimentan los cigotos dechorionated en siliconados tubos de 1,5 ml. Retire el ASWH hasta la marca de 100 l en el tubo. </li><li> Procederá, de forma consecutiva, para cada tubo cigoto de la siguiente manera: añadirsolución de ADN / manitol usando una pipeta Pasteur. Mezclar suavemente con los cigotos y de inmediato tomar el manitol suspensión cigoto ADN / / y la transferencia a una cubeta de electroporación de 4 mm. </li><li> Colocar la cubeta inmediatamente en el soporte de la electroporación y dar un único pulso de 16 ms a 50 V. </li><li> Retire los cigotos de la cubeta utilizando la misma pipeta Pasteur y los extendió sobre una placa de cultivo que contiene ASWH fresca y filtrada. Pipetear los cigotos antes de empezar a escindir alrededor de 1 hora después de la fecundación (HPF) a 18 ° C. </li><li> Enjuague la pipeta entre las muestras en un vaso de precipitados de ASWH. </li><li> Cultura los cigotos a 15-20 ° C a baja densidad suficiente de alrededor de 200 embriones por placa de 10 cm para evitar que se peguen entre sí. </li></ol> 6. La microinyección <ol><li> Preparar dechorionated huevos para la inyección. <ol><li> Dechorionate los huevos por separado, a partir de 2-4 animales, tal como se describe en la sección 4. Mantener el no fertilizado y dechorionated correoGGS en placas de cultivo recubiertas de agarosa pequeña separados. Lavar los huevos varias veces en los platos para remover los escombros. </li><li> Prueba de fertilizar pequeños lotes de los huevos dechorionated (alrededor de 50) de cada individuo. Use un plato separado 5 cm para cada lote y aplicar 2 l de esperma activado (paso 3.2). Mezclar bien por agitación los platos y hacia fuera los huevos en el plato moviendo los platos de lado. Mantener el esperma y los huevos juntos durante unos 10 minutos sin moverse. </li><li> Eliminar a un máximo de esperma de la siguiente manera: transferir los huevos fertilizados de una placa de cultivo fresco o enjuagar dos veces con ASWH fresco. Deje los embriones de escisión no perturbadas hasta la fase de 32 células (a 18 ° C durante aproximadamente 3 horas después de la fecundación). Elija los huevos de la mejor desarrollo de lotes (mejor porcentaje de la fecundación y la mayor división patrón regular) para la microinyección. </li></ol></li><li> Configurar las agujas de inyección. <ol><li> Rellene 4 agujas de inyección en una posición vertical para permitir la gravedad flow a lo largo del filamento. Depósito de 0,5 l solución inyectable (paso 1.8) que contiene colorante vital verde en la parte de atrás de las agujas que se colocan punta abajo aguja. Esperar a que el líquido para llenar la punta de la aguja en la parte inferior. </li><li> Volver a colocar las agujas en horizontal y rellenar con aceite mineral utilizando un metal fino y largo o puntas de pipeta de plástico. superponer lentamente la solución de inyección con aceite mineral expulsando todas las burbujas de aire mientras se llena la aguja. </li></ol></li><li> Configuración del Micromanipulador en un 18 ° C refrigerado por habitación. <ol><li> Conectar el tubo de plástico del soporte de la aguja a una jeringa de vidrio de 10 ml lleno de aceite mineral. Rellene el tubo y el soporte de la aguja con aceite y expulsar cualquier burbuja de aire. </li><li> Insertar la aguja en el soporte de la aguja y la posición del soporte en el micromanipulador. </li><li> Ajustar el movimiento de soporte de la aguja a lo largo de una línea recta en un ángulo de 45 ° respecto a la superficie. </li></ol></li><li> Orientar la dechorionahuevos TED a lo largo de la muesca de agarosa del plato de inyección de modo que los huevos se pueden inyectar uno a uno bajo el microscopio de disección. </li><li> Romper la punta de la aguja, si es necesario, empujando suavemente la aguja contra la agarosa o en contra de un pedazo de hoja de la cubierta de vidrio colocado en la agarosa. presionar ligeramente el mando de la jeringa para comprobar que la punta de la aguja está abierta (contenidos de agujas verdes expulsarán). </li><li> Inyectar el huevos no fecundados de uno en uno mediante la introducción primero la aguja en el huevo y ligeramente aspiración para romper la membrana del huevo seguido de la inyección. Inyectar solución de inyección verde en medio del huevo a un máximo de 1/3 del diámetro de la célula. (Esto corresponde a aproximadamente 30 pl para un diámetro de los huevos de 140 micras). </li><li> La transferencia de los huevos no fertilizados inyectados a una placa de cultivo fresco y incubarlos a 15-18 ° C hasta el momento de la fecundación. </li><li> Fertilizar los óvulos inyectados con espermatozoides recién activado como en las fertilizaciones de prueba (paso 6.1.2). Eliminatea máximo de los espermatozoides mediante la transferencia de los cigotos a una placa de cultivo fresco. Extender los embriones y no perturbar ellos durante las etapas de escisión (hasta la fase de 32 células). </li><li> Cultura los embriones a la etapa deseada a una temperatura comprendida entre 13 y 20 ° C. </li><li> Recoger los embriones de remolinos de ellos en el centro de la placa y transferir los mismos en siliconados tubos de 1,5 ml. Corregir o mancha, o monte (Pasos 7 y 8). </li><li> Comparar los fenotipos obtenidos para los embriones de control inyectado. NOTA: Se inyecta un segundo que no se solapan MO, que se dirige a la misma transcripción para obtener fenotipos idénticos. Rescatar el fenotipo MO específica (s) con un ARNm modificado que codifica su proteína de interés, pero que no es reconocido por el OM. MO inyectar un control que no da ningún fenotipo. </li></ol> 7. LacZ tinción <ol><li> Recoger los embriones en una etapa deseada en siliconados tubos de 1,5 ml y fijarlos en glutaraldehído al 0,2% en 1 ml de 15 ASWHa 30 min como máximo. </li><li> Lavar 2x 10 min con 1 ml de 1x PBT. </li><li> Enjuagar una vez en 500 l de tampón de tinción de LacZ. Reemplazar con sustrato X-Gal complementado tampón de tinción 1 ml (utilizar 10 l / ml de 40 mg / ml de solución madre de X-Gal). La transferencia de los embriones en una placa de 12 pocillos para una mejor observación de la tinción. </li><li> Incubar en la oscuridad. Variar la incubación de 0,5 hr a durante la noche a 4 ° C, a temperatura ambiente o a 37 ° C dependiendo de la fuerza del conductor que expresa LacZ. </li><li> Lavar los embriones hasta 4 veces en 1 ml de 1X PBT para eliminar tampón de tinción. </li><li> Después de la corrección durante 10 minutos a temperatura ambiente con 2% de paraformaldehído (PFA) en 1 ml de 1x PBT o glutaraldehído al 0,2% en 1 ml 1x PBT para la interpretación y visualización de los embriones teñidos. </li></ol> 8. Montaje de manera fluorescente etiquetadas Wmbryos <ol><li> Fijar los embriones de una etapa de desarrollo deseada durante 20 min en un 2% PFA en 1 ml ASWH. </li><li> Lavar los embriones 2x en 1 ml 1x PBT. Evitar cualquier exposiciones de luzUre al mantener los embriones en condiciones de oscuridad. </li><li> Transferir hasta 50 embriones a una diapositiva. Retirar un máximo de PBT en primer lugar con una pipeta y cuidadosamente con una toalla de papel. </li><li> Añadir 20-25 l de medio de montaje. </li><li> Añadir un cubreobjetos posicionándolo en un ángulo (de un lado primero) y baje lentamente con un objeto punzante (agujas, pinzas, puntas de pipeta) evitando las burbujas hasta que la muestra se cubre. Fijar el portaobjetos en sus bordes utilizando puntos de un esmalte de uñas transparente. </li><li> Sellar todo el cubreobjetos con un esmalte de uñas después del secado. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Hay dos técnicas principales para generar embriones transgénicos Ciona: microinyección de ARN o ADN y la electroporación de ADN. Estas técnicas para la perturbación de genes en embriones Ciona se utilizaron por primera vez en la década de 1990 y 7,8 a partir de entonces mejoraron sucesivamente, y ahora utilizan en Ciona (y otros géneros ascidia) 20 en todo el mundo. Los pasos críticos en el protocolo Transgénesis éxito en gametos Ciona que se recogen fácilmente de animales adultos depende de una serie de factores críticos. La calidad de los gametos depende de la época de desove (en general, de mayo a diciembre en el Atlántico Norte, que cambia con la temperatura del agua y la oxigenación), sobre la calidad del agua de mar en los acuarios (en la salinidad correcta, adultos sanos durante 2-4 semanas) y, finalmente, en la correcta manipulación de los gametos sobre la extracción de los adultos, como se detalla a continuación para los diversos pasos en elprotocolo. Durante las etapas de preparación, la incubación de pipetas Pasteur con agua del grifo evitará que los embriones se peguen y agua de mar pre-incubación de placas de Petri de agarosa recubiertas de eliminará sustancias tóxicas liberadas de la agarosa. En general, los platos se pueden preparar hasta 2 semanas antes de su uso, almacenados a 4 ° C para evitar el crecimiento bacteriano y se aclararon justo antes de su uso. Un día de edad, pequeños platos parece mejor para inyecciones. La eficiencia y la longitud de dechorionation es un paso crucial en el protocolo como el tratamiento prolongado de huevos / embriones dañará el desarrollo. La preparación cuidadosa (sin agitación) y el almacenamiento correcto (a 4 ° C durante un máximo de una semana) preservan la calidad de la solución dechorionation. Proteasas en la solución pierden eficacia si, ya sea mezclado con demasiada violencia en la preparación o el paso del tiempo, sobre todo si se mantiene a temperatura ambiente durante largos horas / días. Hemos optimizado este paso crítico mediante el uso de una solución fresca convenientemente dechorionationpreparado a partir de alícuotas congeladas de 20x solución madre. La correcta manipulación de los frágiles huevos / embriones dechorionated es esencial y cizallamiento o punzante de los embriones durante el pipeteado será perjudicial. Cuando pipeteado, los embriones se mantienen lo más posible en suspensión (por suavemente &#39;soplado&#39; líquido a girar hacia arriba seguido de suave pero rápido de pipeteo), mientras sostiene la pipeta de vidrio en vertical en lugar de horizontal. Tal cuidado aplica a todos los pasos de pipeteado para el lavado, resuspensión y transferencia de huevos / embriones dentro y fuera de los tubos, cubetas o placas, antes y después de la fijación. Tras la fijación, cuidados especiales también se debe tomar para pipetas separadas para los embriones vivos versus sujetos para evitar la toxicidad de los restos de fijadores. La microinyección es bastante complicado en Ciona huevos / embriones debido a su pequeño tamaño y la resistencia de la membrana vitelina y críticamente depende de un tamaño de la boquilla optimizada dela aguja de inyección, un ángulo perfecto de la inyección (movimiento de la aguja en una línea, a lo largo del radio de huevo) y un afinado, rotura manual de la membrana vitelina (por succión antes de la aspiración por inyección). Esta última sólo es posible si las burbujas de aire están completamente eliminados de la tubería de inyección que contiene aceite mineral para suavizar la presión de succión / inyección. Además, las piezas más pequeñas de polvo o restos de huevos va a obstruir la aguja, y son fácilmente evitado por las condiciones de trabajo limpio y pasos de lavado de los huevos antes de su transferencia en el plato de la inyección. después de la inyección, la transferencia de huevos en platos frescos evitará los efectos tóxicos de los embriones muertos no haber sobrevivido al procedimiento de inyección. Solución de problemas Los problemas potenciales en el procedimiento pueden ser abordadas por las siguientes soluciones. Las bajas tasas de fertilización pueden surgir de la activación de los espermatozoides insuficiente, baja la limpieza de huevo o de volúmenes grandes de fertilización. utilice freshly agruparon y menos diluyó esperma. Verificar el movimiento de los espermatozoides después de la activación. Lavar los huevos con ASWH antes de la fertilización como se describe en el paso 4.2. Reducir el volumen de agua y reducir la cantidad de huevos por plato fertilización / pocillo. La pérdida de embriones durante las etapas de preparación se pueden evitar mediante la adición de una gota de solución dechorionation para centrifugar de manera más eficiente hacia abajo los huevos / embriones undechorionated. Dechorionation tiempo debe ser optimizado como los huevos parcialmente dechorionated será no sedimentos y dechorionation prolongada es tóxico, causando los embriones para explotar. desarrollo asincrónico puede surgir de esperma residual liberado durante la disección. Mantener los lotes de huevos separados de diferentes animales para evitar incontrolada fertilización cruzada. El desarrollo anormal puede tener varias causas. Al principio y al final de la temporada, después de mantener el embrión de diferentes individuos separados, se pueden seleccionar los mejores lotes. Debe evitar las interrupciones de los embriones para la10 minutos que siguen a la fertilización para evitar la interferencia con su segregación ooplasmic. Asegúrese de que los embriones no comenzaron dividiendo mientras se transfiere en forma de pipeteado separa los blastómeros hermanas y los resultados en embriones parciales. Use menos espermatozoides para los huevos para evitar dechorionated polyspermy. Utilice platos recién preparados de agarosa, pero se aclararon. Asegúrese de que el dispositivo de pipeta es libre de fijador. Mantener control de los embriones que no fueron dechorionated y no a electroporación para detectar por lo cual el desarrollo paso fue interrumpido. Complementar los embriones con antibióticos si se produce contaminación y descomposición. Si el dispositivo de inyección ha &#39;tapado&#39;, la abertura de la aguja de inyección puede ser verificada mediante la expulsión de algunos de sus contenidos manchado. material de obstrucción puede ser borrado arrastrando con cuidado la punta de la aguja a través de la agarosa. Las burbujas de aire en el tubo de inyección y / o la aguja debe ser eliminado. Cambie la aguja para un mejor control del volumen de inyección como el neepunta dle puede romper o atascar a lo largo de la inyección. Lavar los huevos y colocarlos en una placa de inyección estéril si los desechos se han acumulado en el plato. Centrifugar la solución de inyección antes de llenar agujas frescas con el fin de sedimentar las partículas pequeñas o cristales. También es útil la inyección está practicando solamente con colorante vital. Verificar la técnica de inyección mediante la fertilización de los huevos inyectados y no inyectados. Por último, el consultar con un colega con experiencia puede ser útil para mejorar la técnica de inyección. Para controlar los efectos fuera de la meta un segundo que no se solapan MO y rescate con un ARNm modificado que no es reconocido por los OM puede descartar fielmente efectos fenotípicos inespecíficos en Ciona. Microinyección: significado y limitaciones La microinyección en Ciona se utilizó para generar el primero modelo para una red de regulación de genes embrión conjunto (GRN) en un cordado 11. Sin embargo, a pesar de una rema taleslogro rkable, microinyección en embriones de Ciona tiene limitaciones, debido al tamaño relativamente pequeño (0,14 mm de diámetro) de los huevos de Ciona. En comparación con los de otras especies de cordados, donde ADN extraño / ARNm se introduce mediante microinyecciones, huevos Ciona son relativamente difíciles de manejar y la tasa de embriones Ciona inyectados por experimento sigue siendo baja (una media de 30 a 50 embriones por experimento), impidiendo análisis cuantitativos. Sin embargo, para factores maternos perturbadores en Ciona, la microinyección de las OM es el método de elección también para estudiar su implicación en la aparición cigóticos de desarrollo de la célula de 16 a 32 etapas 15. Además, es posible aunque mucho más difícil de microinyectar blastómeros individuales hasta la etapa de 16 a 32 células. Por último, la microinyección sigue siendo la técnica más eficiente para la producción de embriones transgénicos (por mRNA o la inyección de ADN) en especies distintas de ascidia Ciona, para lo cual totalmente optimino existen protocolos de electroporación Zed. La electroporación: significado y limitaciones Para superar los números bajos y otras condiciones de la microinyección, la mayor parte de la comunidad Ciona ha utilizado la electroporación de ADN plásmido desde que fue desarrollado y publicado como un protocolo optimizado y estandarizado por Zeller et al. En 2004 9. De hecho, miles de embriones Ciona transgénicos puede ser generada dentro de una hora con hasta 500 embriones electroporadas simultáneamente en una cubeta usando una sola 50 V de pulso de 16 mseg. El enfoque de generar un número masivo de embriones transgénicos sigue siendo único entre los organismos modelo cordados. Esto ha llevado a Ciona ser rápidamente reconocido como un poderoso sistema modelo para la realización de los análisis in vivo de potenciales regiones cis-regulador y localización celular / subcelular, como se ejemplifica aquí. Aunque electroporatien cigotos en Ciona ha revolucionado el campo de investigación fundamentalmente cordado GRN, la técnica, sin embargo, se enfrenta a algunos límites. En primer lugar, los plásmidos se introducen de forma transitoria en embriones de Ciona y es más probable heredan como extracromosómicos arrays, por lo que la estabilidad del plásmido de ADN a electroporación especulativo. Por otra parte, es muy difícil, incluso imposible, controlar las copias de plásmidos electroporación que serán absorbidos por cigoto, lo que resulta en fluctuaciones fenotípicas. Un problema adicional que hace que sea difícil de interpretar los resultados de electroporación es un fenómeno que llamamos mosaicismo. ADN plásmido electroporación puede ser tomado en diferentes posiciones de la etapa de embrión de una célula; que determina cuáles y cuántos cuartos del cigoto recibirán plásmido para ser heredado por los descendientes blastómeras. Tales variaciones claramente hacen que la interpretación de los efectos cuantitativos más difícil. Sin embargo, la mayoría de los problemas que vienen con electroporavariabilidad ción son resueltos por una cantidad apropiada de muestras biológicas, con el conteo y estadísticas de LacZ (o GFP) células positivas, que es fácil de obtener en un solo lote. La versatilidad y el potencial de electroporación para la ingeniería genética Electroporación, finalmente, permite la detección de mitad de rendimiento de las posibles regiones cis-regulador y análisis cuantitativos de la función de genes clonados en vez de actas o de plásmidos de expresión. Debido al genoma Ciona compacto, la identificación y clonación de posibles regiones reguladoras es bastante sencillo 3. Una estrategia para el uso de la gran cantidad de datos de la comunidad se demuestra en la Figura 2A. La clonación de genes informadores y plásmidos que codifican se facilita aún más la generación de Ciona adaptado, Gateway Suites vector compatible 19 y una longitud total compatibles biblioteca ORF 18. Ambas herramientas están disponibles para la comunidad ypermitir la restricción de la recombinación eficiente, libre de enzimas de los conductores reguladoras y regiones de codificación, como se muestra en la Figura 2B. En los últimos años, la electroporación fue adaptado con éxito para lograr la manipulación dirigida de genes de tejidos con plásmidos que expresan las herramientas de edición de genes como los componentes CRISPR / Cas9 bajo el control de controladores específicos de tejido 21,22. Tales enfoques avanzarán rápidamente nuestra comprensión de la dinámica de GRNs y los mecanismos de señalización potencialmente conservadas, incluyendo códigos de factor de transcripción implicados en la formación de tejidos y la salida escalonada de pluripotencia. Por otra parte, deficitaria de tejidos específicos o enfoques de ganancia de función (por CRISPR / Cas9 o por la sobreexpresión) mediante electroporación serán fundamentales para el estudio de los genes ortólogos Ciona asociadas a la enfermedad humana. De hecho, los catálogos de ortólogos de Ciona genes de enfermedades humanas y su longitud ORF clones de codificación son fácilmente disponLe para el análisis en Ciona 1 8. Debido a la amplia duplicaciones del genoma en los vertebrados, la mayoría de los genes humanos poseen parálogos funcionalmente redundantes que complican los análisis de la función del gen 1. Ciona ser un sistema más simple con la disposición típica tejido cordado en larvas debe descubrir papeles fundamentales de tales genes importantes, a menudo conservadas funcionalmente.

Recientemente, la secuencia del genoma y repertorios de genes transcritos se han hecho accesibles en una serie de organismos modelo. Determinar enlaces funcionales de genes, sin embargo, y cómo estas conexiones están cableados en el ADN para ejecutar la actividad transcripcional a través del tiempo y el espacio embrionario, siendo un reto importante, especialmente en los vertebrados. La complejidad de las interacciones reguladoras y la complejidad de los genomas de 1,2, en particular en los vertebrados, ralentizan análisis funcionales eficientes, en particular a nivel del ADN in vivo. De hecho, ningún GRN se analiza la actualidad desde la fertilización hasta el estado final, diferenciación terminal del organismo en desarrollo. La ascidia C. intestinalis representa un organismo modelo en el que tan completa GRN analiza puede ser posible. Tiene un genoma no duplicado típico de invertebrados con poca redundancia génica. Vertebrados, por el contrario han sido objeto de dos rondas de duplicaciones del genoma que have genera grandes familias de genes y la diversificación funcional, sino también la redundancia entre parálogos. Las secuencias cis-regulador compactas (las unidades de control de GRNs) de C. intestinalis, y un linaje embrionario invariable con pocas células son una reminiscencia de C. elegans. Por otra parte, su posición filogenética única como un grupo hermano de invertebrados a los vertebrados dentro de los cordados permite la observación del desarrollo, con una resolución celular, del plan corporal cordado formando 3-6. La cuestión clave que garantiza el éxito futuro de la genómica funcional en organismos modelo es la generación de un gran número de embriones para cuantitativos en vivo perturbaciones. El desarrollo de la técnica de microinyección en huevos Ciona 7, y la posibilidad de obtener rápidamente muchos animales transgénicos transitoriamente por electroporación in vivo en cientos de Ciona cigotos 8,9 ha sido un gran avance en <em&gt; Genómica funcional Ciona. Aquí, primero presentamos la técnica de microinyección más laborioso para la orientación genes individuales que sigue siendo el método de elección para morfolino (MO) desmontables gen mediada, en particular de los transcritos maternos. oligos MO suelen centrarse en el iniciador ATG o los sitios de empalme de ARN e interfieren con la traducción de proteínas. A continuación, muestran cómo la electroporación en huevos fertilizados de Ciona permite un gran número de embriones para ser analizados de una manera cuantitativa, abriendo así las vías de análisis eficiente de los potenciadores in vivo y de ganancia-específica de tejido o pérdida de función de los enfoques, con el posibilidad de manipulaciones y análisis simultáneos. Además, demuestran cómo se utilizan las herramientas de la comunidad Ciona para la predicción in silico de las regiones reguladoras y la clonación eficiente de los marcos de lectura abierta (ORFs) completos en vectores de expresión. Por último, demostrar diferenciales localizaciones subcelulares de fluorescencia etiquetadoso proteínas a la sobreexpresión marcada por electroporación.

<table><tbody><tr><td>Laboratorio con temperatura constante (~18 &deg; C)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Para el trabajo con embriones</td></tr><tr><td>Ciona intestinalis adultos</td><td>UPMC - Station Biologique, Roscoff, Francia</td><td></td><td>Para la recolección de gametos</td></tr><tr><td>NaCl Roth</td><td></td><td>3957.1</td><td>Para ASWH</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td>Para ASWH</td></tr><tr><td>CaCl2x2H2O</td><td>Roth</td><td>A119.1</td><td>para ASWH</td></tr><tr><td>MgCl2x6H2O</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td>para ASWH</td></tr><tr><td>MgS04x7H2O</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>para ASWH</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>6885.1</td><td>para ASWH</td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td>para</td></tr><tr><td>tioglicolato de sodio ASWH &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MZ-6</td><td>para pronase de descorionación</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0632-100G</td><td>para decorionación</td></tr><tr><td>D-manitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G</td><td>para</td></tr><tr><td>ADN plasmídico de electroporación (prep >1&micro; g/&micro; l)</td> <td>Macherey-Nagel</td><td>740410.100</td><td>Para electroporación o microinyección</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td>Para el recubrimiento de placas de cultivo de embriones</td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>VWR</td><td>612-2079</td><td>Recubierto con 1% de Agarosa en ASWH, cubierto con ASWH</td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td>Para la disección de gametos</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Roth</td><td>6771.1</td><td>Para activar la solución de decorionación</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Roth</td><td>5429.3</td><td>1 M pH 9.5, para la activación de espermatozoides</td></tr><tr><td>pipetas Pasteur&nbsp;</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td>Tratada por inmersión en agua del grifo durante al menos 12 horas</td></tr><tr><td>Centrífuga manual</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>1011</td><td>Utilizar tubos de centrífuga de vidrio de</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos Eppendorf Sigma</td><td></td><td>T3406-250EA</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tubos Eppendorf</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador cuadrado</td><td>Bio Rad Gene Pulsador Xcell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación 4 mm</td><td>Eurogentec</td><td>CE-0004-50</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Sto Premium</td><td>PR248212600</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>de vidrio VWR</td><td>ECN 613-1551</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma</td><td>G6257-10ML</td><td>Para la fijación en la tinción LacZ</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148-500G</td><td>Para la fijación de muestras fluorescentes</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>Para el montaje de muestras fluorescentes</td></tr><tr><td>X-Gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil &szlig;-D-Galactopiranósido)</td><td>Roth</td><td>2315.2</td><td>LacZ sustrato; stock en 40 mg/ml DMF (Dimetilformamida)</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6&#8226; 3H2O</td><td>Merck</td><td>4984</td><td>para tampón de tinción LacZ</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Merck</td><td>4973</td><td>para tampón de tinción LacZ</td></tr><tr><td>Na22HPO4</td><td>Roth</td><td>4984.2</td><td>para</td></tr><tr><td>PBT KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Para interpolación de PBT</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBJ5103V</td><td>para</td></tr><tr><td>aceite mineral</td> PBT <td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Cultivo de embriones probado</td></tr><tr><td>Green Vital Dye</td><td>Fast Green Sigma&nbsp;</td><td>F7251</td><td>para microinyección; 10&micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas (flameado/marrón)</td><td>Sutter Instruments</td><td>modelo P-97</td><td>Para tirar de agujas de inyección</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato GC100TF-10</td><td>Harvard Apparatus Ltd. Reino Unido</td><td>30-0038</td><td>1,0 mm de diámetro exterior x 0,78 mm de diámetro interior, que contiene filamento, para microinyección</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MWS-2</td><td>Sistema hidráulico de aceite de tres ejes; para el movimiento fino en 3D durante la inyección</td></tr><tr><td>Soporte de inyección</td><td>Narishige</td><td>1M-H1</td><td>Para sujetar agujas de inyección, todo el sistema lleno de aceite mineral</td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio</td><td>Walter Graf & Co GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>Nº 95199.10427A4</td><td>10 ml FortunaOptima; relleno de aceite mineral, para el ajuste fino de la presión de microinyección&nbsp;</td></tr><tr><td>Morfolinos&nbsp;</td><td>GeneTools LLC, Pilomath, OR, EE. UU</td><td></td>. <td>Inyección a 0.25-0.5 mM</td></tr><tr><td>ARNm tapado</td><td>Ambion mMessage mMashine kit</td><td></td><td>Inyección a 0.05-0.5&micro; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr>Inyección de ADN <td></td><td></td><td>plasmídico</td><td>a 20 ng/& l</td></tr><tr><td>Kit de clonación de recombinación</td><td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td><td>11789-013</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación de recombinación</td><td>Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA anticuerpo de etiqueta</td><td>abcam</td><td>ab9110</td><td>para inmunofluorescencia, uso 1:400 en 3% BSA/PBT</td></tr><tr><td>Tritc anticuerpo anti-conejo de cabra</td><td>Jackson</td><td>111-025-144</td><td>para inmunofluorescencia, use 1:300 en 3% BSA/PBT</td></tr></tbody></table>

la microinyección de embriones y la electroporación en el chordate<em&gt; ciona intestinalis</em

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Los organismos modelo simples son fundamentales para los estudios in vivo de los procesos de desarrollo y diferenciación celular. En la actualidad, la distancia evolutiva al hombre de los sistemas convencionales de modelos de invertebrados y la complejidad de los genomas de los vertebrados son desafíos críticos para modelar las condiciones normales y patológicas humanas. El cordado Ciona intestinalis es un cordado invertebrado que surgió de un ancestro común con los vertebrados y puede representar características en la interfaz entre invertebrados y vertebrados. Un plan corporal común con una composición celular y genómica mucho más simple debería revelar enlaces de redes reguladoras de genes (GRN) y lecturas de genómica funcional que expliquen los fenómenos en la condición de los vertebrados. El genoma compacto de Ciona, un linaje embrionario fijo con pocas divisiones y células grandes, combinado con herramientas comunitarias versátiles, fomenta análisis funcionales de genes eficientes en este organismo. Aquí, presentamos varios métodos cruciales para este prometedor organismo modelo, que pertenece al grupo hermano más cercano a los vertebrados. Presentamos protocolos para la transgénesis transitoria por electroporación, junto con la eliminación de genes mediada por microinyección, que en conjunto proporcionan los medios para estudiar la función génica y los elementos reguladores genómicos. Ampliamos nuestros protocolos para proporcionar información sobre cómo se utilizan las bases de datos comunitarias para el diseño in silico de experimentos reguladores o funcionales de genes. Un ejemplo de estudio demuestra cómo se puede obtener información novedosa sobre la interacción, y su cuantificación, de factores neuronales seleccionados conservados entre Ciona y el hombre. Además, mostramos ejemplos de localización subcelular diferencial en células embrionarias, tras la electroporación del ADN en cigotos de Ciona. Finalmente, discutimos el potencial de estos protocolos para adaptarse a la interferencia de genes específicos de tejido con métodos emergentes de edición de genes. Los enfoques in vivo en Ciona superan las principales deficiencias de los organismos modelo clásicos en la búsqueda de desentrañar los mecanismos conservados en el programa de desarrollo de cordados, relevantes para la investigación con células madre, el descubrimiento de fármacos y la posterior aplicación clínica.

Presentamos la transgénesis y transitoria gen desmontables en Ciona intestinalis, un grupo hermano cordado a los vertebrados, utilizando técnicas de microinyección y electroporación. Tales métodos facilitan la genómica funcional en este sencillo de invertebrados que cuenta con características rudimentarias de vertebrados, incluyendo notocorda y epitelios sensoriales cabeza, y muchos ortólogos de genes de enfermedades humanas asociadas.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

El objetivo general de las técnicas de transfección transitoria en embriones de Ciona es estudiar la regulación y función génica necesarias para formar larvas con aspecto de renacuajo, aprovechando su linaje celular invariable y su genoma invertebrado compacto, con el fin de obtener información sobre los orígenes de los cordados invertebrados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética molecular, como los mecanismos conservados del programa de desarrollo de los cordados que son relevantes para la investigación de células madre y para el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que, mediante la electrotransferencia en embriones, se pueden manipular cientos o miles de embriones sincronizados en un solo día.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la descorionación del embrión frágil y porque es complicado desarrollar una técnica eficiente de microinyección. Comience por diseccionar adultos de Ciona en una sala de embriones refrigerada a 18 grados Celsius. Utilice tijeras pequeñas para hacer una incisión en el extremo opuesto a los sifones y en el lado del sifón más corto, debajo del cual se encuentran el oviducto y el conducto espermático.Alargue la incisión para exponer el oviducto. Luego, use la punta de las tijeras para realizar una incisión precisa en el oviducto. Presione suavemente el oviducto con las tijeras cerradas y desprenda los huevos.Deje que los huevos caigan directamente en una placa de seis pocillos que contenga agua de mar artificial con HEPES. Utilice una pipeta de Pasteur, previamente enjuagada con ASWH, para recoger y transferir los huevos restantes. Para recolectar el esperma, corte el conducto espermático con las tijeras y luego use una pipeta de Pasteur separada para recoger esperma concentrado y transfiéralo a un tubo de 1,5 mililitros.Activear los espermatozoides combinando un mililitro de ASWH y 50 microlitros de Tris en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, añadir 20 microlitros de espermatozoides concentrados, cerrar la tapa y mezclar suavemente invirtiendo el tubo o utilizando una pipeta de Pasteur. A continuación, añadir de 100 a 200 microlitros de la solución de espermatozoides activados a cada pocillo con óvulos y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo, de modo que los óvulos floten en el medio.Inicie la descorionación recolectando los cigotos y dispensándolos en tubos de vidrio. Con la centrífuga manual, centrifugue los cigotos a docecientas veces G durante aproximadamente 20 segundos, luego detenga lentamente la centrífuga. Retire el ASWH de los sedimentos con una pipeta de Pasteur.Añada cuatro mililitros de solución activada de descorionación al precipitado en cada tubo. Suspenda los cigotos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta Pasteur tratada con agua corriente y provista de una perilla de goma pequeña. La solución debe volverse amarillenta después de 1 a 3 minutos.Durante la descorionación, retire una pequeña alícuota de la suspensión descorionante utilizando la pipeta de Pasteur. Coloque una gota sobre un portaobjetos y obsérvela bajo el microscopio estereoscópico. Aspire y expulse la suspensión de cigotos varias veces con la pipeta y revise el portaobjetos cada 20 a 30 segundos.Primero, las células foliculares se separan; luego, el corión se vuelve amarillo y opaco, y finalmente, se desprende de los cigotos. Los cigotos descorionados de color rosa se hundirán hasta el fondo del tubo de vidrio. Una vez que más del 50 % de los cigotos estén descorionados, llene el tubo con ASWH.Centrifugar muy suavemente durante aproximadamente 10 a 15 segundos, solo lo suficiente para sedimentar los cigotos descorionados. Detener la centrifuga lentamente. Retirar casi todo el líquido del tubo de vidrio, incluyendo cualquier material flotante, y reemplazarlo con ASWH.Pipetee lentamente hacia arriba y hacia abajo para lavar, y luego centrifugue suavemente como antes. Lave nuevamente hasta que no quede ningún residuo de corión. Sedimente por gravedad el lavado hacia cigotos desprovistos de corión en tubos de 1,5 mililitros silanizados.Después de la sedimentación, retire el ASWH hasta la marca de 100 microlitros en el tubo. Ahora use una pipeta de Pasteur para agregar 250 microlitros de ADN previamente preparado en solución de manitol a un tubo de cigotos. Mezcle suavemente e inmediatamente transfiera la mezcla a una cubeta de electroforesis de cuatro milímetros.Coloque la cubeta en el soporte de electroforesis y aplique un solo pulso de 16 milisegundos a 50 voltios. Luego, retire los cigotos de la cubeta utilizando la misma pipeta de Pasteur y expúlselos en una placa de cultivo que contenga ASWH fresco y filtrado. Agite la placa para distribuir los cigotos.Lave la pipeta en un vaso de precipitados con ASWH y luego pase a la siguiente muestra. Después de electroporar todos los cigotos, cultive los cigotos a entre 15 y 20 grados Celsius. Configure el micromanipulador en una habitación refrigerada a 18 grados Celsius.Conecte el tubo de plástico y el portaagujas a una jeringa de vidrio de 10 mililitros llena con aceite mineral. Llene con aceite el tubo y el portaagujas desde atrás y expulse cualquier burbuja de aire. Inserte la aguja de inyección que contiene 0,5 microlitros de solución de inyección con colorante verde vital en el portaagujas.Y coloque el soporte en el micromanipulador. Ajuste el portaagujas para que se mueva a lo largo de una línea recta con un ángulo de 45 grados respecto a la superficie. Oriente los huevos descorionados en una pequeña placa de cultivo recubierta con agarosa a lo largo de una muesca, de modo que los huevos puedan inyectarse uno por uno bajo el microscopio de disección.Si es necesario, rompa la punta de la aguja presionándola suavemente contra un trozo de cubreobjetos de vidrio colocado sobre el agarosa. Aplique una ligera presión para verificar que la punta de la aguja esté abierta. Inyecte los huevos no fertilizados uno por uno, introduciendo primero la aguja en el huevo y aspirando ligeramente para romper la membrana del huevo.Luego, inyecte la solución de inyección verde en el centro del huevo, hasta un máximo de un tercio del diámetro celular. Después de inyectar todos los huevos, retire la aguja, transfiera los huevos inyectados y no fertilizados a una placa de cultivo fresca e incube a 15-18 grados Celsius hasta la fertilización. Se utilizó microinyección para estudiar la regulación del factor de transcripción de mielina de Ciona intestinalis o MyT, en la etapa de gástrula de embriones de Ciona.Monitoreada mediante hibridación in situ, la expresión endógena se observa en los precursores de la placa neural de la sexta fila en tipo salvaje. La microinyección de morfolinos para silenciar factores embrionarios tempranos, como Forkhead box A, un factor de transcripción, elimina por completo la expresión de MyT. Por el contrario, la expresión de MyT se activa ectópicamente tras la regulación negativa de nodal, lo que sugiere que nodal normalmente reprime la expresión de MyT en estos precursores del cordón nervioso lateral.El factor de transcripción GATAa fue marcado con una etiqueta Venus y electro porado en blastómeros ectodérmicos con un impulsor pfog. Como se observa aquí, GATAa se localiza principalmente en los núcleos, tal como se esperaría para un factor de transcripción. Mientras que la expresión de Venus es ubicua.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la transfección transitoria mediante electroforesis en cigotos sincronizados de Ciona, cómo manipular los embriones descorionados frágiles y cómo encontrar el ángulo correcto para la microinyección. Tras su desarrollo, estas técnicas han allanado el camino hacia la genómica funcional. Para explorar la función génica, las redes reguladoras de genes y conservar los módulos del desarrollo, importantes para la formación de tejidos también en humanos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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