La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate Ciona intestinalis

El objetivo general de las técnicas de transfección transitoria en embriones de Ciona es estudiar la regulación y la función de los genes necesarios para formar larvas similares a renacuajos, aprovechando su linaje celular invariante y su genoma compacto de invertebrados, con el fin de obtener información sobre los orígenes de los invertebrados cordados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética molecular, como los mecanismos conservados del programa de desarrollo de cordados que son relevantes para la investigación con células madre y para el descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que con la electroporación embrionaria se pueden manejar cientos o miles de embriones sincronizados en un día.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, debido a la frágil decorionación del embrión y porque es complicado desarrollar una técnica de microinyección eficiente. Comience por diseccionar a los adultos de Ciona en una habitación de embriones enfriada a 18 grados centígrados. Use tijeras pequeñas para hacer una incisión en el extremo opuesto de los sifones y en el lado del sifón más corto, debajo del cual corre el oviducto y el conducto de espermatozoides.

Alarga la incisión para exponer el oviducto. Luego, use la punta de las tijeras para hacer una incisión precisa en el oviducto. Presione suavemente el oviducto con las tijeras cerradas y retire los huevos.

Deje que los huevos caigan directamente en una placa de seis pocillos que contiene agua de mar artificial con HEPES. Utilice una pipeta pasteur, previamente enjuagada con ASWH, para recoger y transferir los huevos restantes. Para recolectar espermatozoides, corte el conducto de espermatozoides con las tijeras, luego use una pipeta pasteur separada para recolectar espermatozoides concentrados y transfiéralos a un tubo de 1,5 mililitros.

Active los espermatozoides combinando un mililitro de ASWH y 50 microlitros de Tris en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, añada 20 microlitros de esperma concentrado, cierre el tapón y mezcle suavemente invirtiendo el tubo o utilizando una pipeta pasteur. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de la solución de esperma activada a cada pocillo de óvulos y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo, de modo que los óvulos floten en el medio.

Comience la descorionación recogiendo los cigotos y dispensándolos en tubos de vidrio. Con la centrífuga manual, haga girar los cigotos a mil doscientas veces G durante unos 20 segundos, luego detenga lentamente la centrífuga. Retire el ASWH de los gránulos con una pipeta pasteur.

Agregue cuatro mililitros de solución de descorionación activada al pellet en cada tubo. Suspenda los cigotos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta pasteur tratada con agua del grifo, cubierta con una pequeña pera de goma. La solución debe volverse amarillenta después de 1 a 3 minutos.

Durante la descorionación, retire una pequeña alícuota de la suspensión descorionante con la pipeta pasteur. Deposite una gota en un portaobjetos y obsérvela bajo el microscopio de disección. Pipetea la suspensión del cigoto hacia arriba y hacia abajo, y revisa el deslizamiento cada 20 a 30 segundos.

Primero se desprenden las células del folículo, luego el corion se vuelve amarillo y opaco y, finalmente, se separa de los cigotos. Los cigotos descorionados rosados se hundirán hasta el fondo del tubo de vidrio. Una vez que más del 50% de los cigotos estén descorionados, llene el tubo con ASWH.

Centrifugar muy suavemente durante unos 10 a 15 segundos, lo suficiente para sedimentar los cigotos decorionados. Detenga la centrífuga lentamente. Retire casi todo el líquido del tubo de vidrio, incluido cualquier material flotante, y reemplácelo con ASWH.

Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo para lavar, y luego centrifugar suavemente como antes. Lavar de nuevo hasta que no queden restos de corion. La gravedad sedimenta el lavado a cigotos decorionados en tubos siliconados de 1,5 mililitros.

Después de la sedimentación, retire el ASWH hasta la marca de 100 microlitros en el tubo. Ahora use una pipeta pasteur para agregar 250 microlitros de ADN previamente preparado en una solución de manitol a un tubo de cigotos. Mezcle suavemente e inmediatamente transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación de cuatro milímetros.

Coloque la cubeta en el soporte de electroporación y dé un solo pulso de 16 milisegundos a 50 voltios. A continuación, retire los cigotos de la cubeta con la misma pipeta de pasteur y expúsquelos a una placa de cultivo que contenga ASWH fresco y filtrado. Agita el plato para esparcir los cigotos.

Enjuague la pipeta en un vaso de precipitados de ASWH y, a continuación, pase a la siguiente muestra. Después de electrocroporar todos los cigotos, cultive los cigotos a 15 a 20 grados centígrados. Coloque el micromanipulador en una habitación refrigerada a 18 grados centígrados.

Conecte el tubo de plástico y el soporte de la aguja a una jeringa de vidrio de 10 mililitros llena de aceite mineral. Rellene el tubo y el portaagujas con aceite y expulse las burbujas de aire. Inserte la aguja de inyección, contenga 0,5 microlitros de solución inyectable con tinte vital verde en el soporte de la aguja.

Y coloque el soporte en el micromanipulador. Ajuste el portaagujas para que se mueva a lo largo de una línea recta en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie. Oriente los huevos decorionados en una pequeña placa de cultivo recubierta de agarosa a lo largo de una hendidura, de modo que los huevos puedan inyectarse uno por uno bajo el microscopio de disección.

Si es necesario, rompa la punta de la aguja empujándola suavemente contra un trozo de cubreobjetos de vidrio, colocado sobre la agarosa. Aplique una ligera presión para verificar que la punta de la aguja esté abierta. Inyecte los óvulos no fertilizados uno por uno, introduciendo primero la aguja en el óvulo y aspirando ligeramente para romper la membrana del huevo.

Luego, inyecte la solución de inyección verde en el centro del huevo, hasta un máximo de un tercio del diámetro de la celda. Después de inyectar todos los óvulos, retire la aguja, transfiera los óvulos inyectados y no fertilizados a una placa de cultivo fresca e incube a 15 a 18 grados centígrados hasta la fertilización. La microinyección se utilizó para estudiar la regulación del factor de transcripción de mielina de Ciona intestinalis o, MyT, en la etapa de gástrula de los embriones de Ciona.

Monitoreado por hibridación in situ, se observa expresión endógena en los precursores de la placa neural de la sexta fila en el tipo salvaje. La microinyección de morfolinos para eliminar los factores embrionarios tempranos, como la caja A de Forkhead, un factor de transcripción, elimina la expresión general de MyT. Por el contrario, la expresión de MyT se activa ectópicamente con la regulación negativa del nódulo, lo que sugiere que el ganglial normalmente reprime la expresión de MyT en estos precursores del cordón nervioso lateral.

El factor de transcripción GATAa se marcó con una marca Venus y se electroporó en blastómeros ectodérmicos con un controlador pfog. Como se ve aquí, GATAa se localiza principalmente en núcleos, como se espera para un factor de transcripción. Mientras que la expresión de Venus es ubicua.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la transfección transitoria por electroporación en cigotos Ciona sincronizados, cómo manejar los frágiles embriones decorionados y cómo encontrar el ángulo correcto de microinyección. Tras su desarrollo, estas técnicas han allanado el camino hacia la genómica funcional. Explorar la función de los genes, las redes reguladoras de genes y conservar los módulos de desarrollo, importantes para la formación de tejidos también en los seres humanos.