La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

El objetivo general de este protocolo inmunoquímico es evaluar la distribución espacial de formas modificadas de citosina en diversos contextos tisulares y celulares, basándose en el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y amplificación de señal mediante tiaramida. Este método supera la limitación de otras técnicas que no proporcionan la información espacial necesaria para comprender la función biológica de las formas modificadas de citosina. Además, este método permite la detección simultánea de formas modificadas de citosina junto con marcadores proteicos de linaje y puede emplearse para estudiar su localización nuclear.

Para comenzar este procedimiento, fije cortes de tejido rehidratados de embriones de ratón CD1 de tipo salvaje y tejidos cerebrales adultos colocándolos en PFA al 4 % o FA al 4 % frío durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, elimine el fijador en exceso lavando los cortes con PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, permeabilice los cortes de tejido colocándolos en un frasco de Coplin lleno con PBX durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, elimine el exceso de PBX lavando brevemente las secciones en PBT. A continuación, coloque las secciones permeabilizadas en HCl 2 N durante 60 minutos a temperatura ambiente para la despurinación del ADN. Luego, transfiera las secciones a Tris-HCl 10 milimolar durante 30 minutos a temperatura ambiente para neutralizar el HCl.

Alternativamente, lave las secciones tres veces durante cinco minutos cada una en PBS. Incube las secciones en PBT durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después, retire cuidadosamente el líquido del área que rodea las secciones de tejido.

Mientras tanto, mantenga las secciones de tejido húmedas. Utilice un rotulador de barrera hidrofóbica para rodear las secciones sin tocarlas. Posteriormente, incube las secciones en 100 microlitros de solución bloqueadora durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

A continuación, incubar las secciones de tejido en 100 microlitros de una dilución 1:5000 de un anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-5hmC y una dilución 1:1000 de un anticuerpo primario policlonal de conejo anti-5caC en solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. Alternativamente, realizar la incubación durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, eliminar los anticuerpos en exceso lavando las secciones en un frasco Coplin lleno con PBT tres veces durante cinco minutos cada vez a temperatura ambiente.

Luego, elimine el exceso de PBT y, si es necesario, rodee nuevamente los cortes con un marcador de barrera hidrofóbica, ya que el PBT contiene detergente que puede debilitar la barrera hidrofóbica. A continuación, prepare una dilución 1:400 de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP y una dilución 1:400 de anticuerpo secundario de asno anti-ratón conjugado con 555 en la solución de bloqueo. Incube entonces los cortes tisulares en 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

Posteriormente, lave las secciones de tejido en un frasco Coplin lleno con PBT tres veces durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente. Luego, transfiera las secciones de tejido a 100 microlitros de tiramida en una dilución 1:200 en el tampón de amplificación de señal con tiramida durante dos minutos a temperatura ambiente. El tiempo de incubación en la solución de tiramida debe optimizarse experimentalmente para cada lote individual del kit de amplificación de señal con tiramida, en el que se observa una relación lineal entre la intensidad de la señal y la duración de la amplificación de señal basada en tiramida.

Inmediatamente después, elimine el exceso de solución de tiramida lavando los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada vez en PBT. Retire cuidadosamente el exceso de PBT e inmediatamente cubra las secciones con una gota de medio de montaje. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre las secciones de tejido y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas.

Luego, mantenga las secciones de tejido a cuatro grados Celsius durante varias horas antes del examen microscópico. Para determinar la distribución de 5hmC en secciones de tejido cerebral, se realizó la codetección de esta modificación epigenética junto con un marcador para neuronas posmitóticas, NeuN. El análisis inmunohistoquímico reveló que, si bien la intensa tinción de 5hmC se colocalizaba con células positivas para NeuN, las células gliales negativas para NeuN poseían niveles más bajos de 5hmC genómico.

Para determinar la distribución de 5caC en células madre neurales en diferenciación, se realizó una tinción doble de este marcador junto con un marcador astrocítico, GFAP, en cultivos fijados de células madre neurales tres días después de la inducción de la diferenciación glial. A diferencia de lo observado en células madre neurales o astrocitos maduros, se detectó una señal intensa de 5caC en una gran proporción de células que expresaban GFAP. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente ocho horas si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener todos los reactivos y materiales junto con sus muestras preparadas. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar imágenes confocales para responder preguntas adicionales sobre la distribución nuclear de las formas modificadas de citosina. Esto puede contribuir a descifrar su posible función biológica.

No olvide que trabajar con HCl 2 N puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de una cabina de seguridad y equipo de protección, al realizar este procedimiento.