La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

El objetivo general de este protocolo inmunoquímico es evaluar la distribución espacial de formas modificadas de citosina en diversos contextos tisulares y celulares mediante el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y la amplificación de la señal de tiramida. Este método supera la limitación de otras técnicas que no proporcionan la información espacial necesaria para comprender la función biológica de las formas modificadas de citosina. Además, este método permite la detección conjunta de formas modificadas de citosina con marcadores de linaje de proteínas y puede emplearse para estudiar su localización nuclear.

Para comenzar este procedimiento, fije secciones de tejido rehidratado de embriones de ratón CD1 de tipo salvaje y tejidos cerebrales adultos colocándolos en 4% de PFA o 4% de FA congelados durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el exceso de fijador lavando las secciones en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, permeabilice las secciones de tejido colocándolas en un frasco de Coplin lleno de PBX durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, retire el exceso de PBX lavando las secciones brevemente en PBT. Ahora, coloque las secciones permeabilizadas en HCl 2 N durante 60 minutos a temperatura ambiente para la depurinación del ADN. Luego, transfiera las secciones a Tris-Hcl de 10 milimolares durante 30 minutos a temperatura ambiente para neutralizar el HCl.

Alternativamente, lave las secciones tres veces durante cinco minutos cada una en PBS. Incubar las secciones en PBT durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de eso, retire con cuidado el líquido del área que rodea las secciones de tejido.

Mientras tanto, mantenga húmedas las secciones de tejido. Use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para rodear las secciones sin tocarlas. Posteriormente, incubar las secciones en 100 microlitros de solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

A continuación, incubar las secciones de tejido en 100 microlitros de una dilución 1:5000 de un anticuerpo primario monoclonal anti-5hmC de ratón y una dilución 1:1000 de un anticuerpo primario policlonal anti-5caC de conejo en solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. Alternativamente, realice la incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, elimine el exceso de anticuerpos lavando las secciones en un frasco de Coplin lleno de PBT tres veces durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente.

A continuación, retire el exceso de PBT y, si es necesario, vuelva a rodear las secciones con un rotulador de barrera hidrofóbica, ya que el PBT contiene detergente que puede debilitar la barrera hidrofóbica. A continuación, haga una dilución 1:400 de anticuerpo conjugado HRP anti-conejo de cabra y una dilución 1:400 de anticuerpo conjugado 555-anti-ratón de burro en solución de bloqueo. A continuación, incubar las secciones de tejido en 100 microlitros de la mezcla secundaria de anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

Luego, lave las secciones de pañuelo en un frasco Coplin lleno de PBT tres veces durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente. A continuación, transfiera las secciones de tejido a 100 microlitros de tiramida con una dilución de 1:200 en el tampón de amplificación de señal de tiramida durante dos minutos a temperatura ambiente. El tiempo de incubación de la solución de tiramida debe optimizarse experimentalmente para cada lote individual del kit de amplificación de señal de tiramida donde se observa una relación lineal entre la intensidad de la señal y la duración de la amplificación de la señal basada en tiramida.

Inmediatamente después, retire el exceso de solución de tiramida lavando los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno en PBT. Retire con cuidado el exceso de PBT e inmediatamente cubra las secciones con una gota de medio de montaje. Coloque suavemente un cubreobjetos en las secciones de pañuelos y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas.

A continuación, mantenga las secciones de tejido a cuatro grados centígrados durante varias horas antes del examen microscópico. Para determinar la distribución de 5hmC en secciones de tejido cerebral, se realizó la codetección de esta modificación epigenética con un marcador de neuronas postmitóticas, NeuN. El análisis inmunohistoquímico reveló que, mientras que la tinción prominente de 5hmC colocalizada con células NeuN positivas, las células gliales negativas para NeuN poseían niveles más bajos de 5hmC genómica.

Para determinar la distribución de 5caC en células madre neurales en diferenciación, se realizó la visualización de este marcador con un marcador glial, GFAP, en los cultivos fijados de células madre neurales tres días después de la inducción de la diferenciación glial. A diferencia de las células madre neurales o los astrocitos maduros, se observó una fuerte señal de 5caC en una gran proporción de células que expresan GFAP. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas ocho horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener todos los reactivos y materiales junto con sus muestras listas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar imágenes confocales para responder preguntas adicionales sobre la distribución nuclear de las formas modificadas de citosina. Esto puede contribuir a descifrar su posible función biológica.

No olvide que trabajar con 2 N Hcl puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el gabinete de seguridad y el uso de ropa protectora al realizar este procedimiento.