Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

El objetivo general de este procedimiento es administrar productos biológicos directamente en la arteria renal para inducir un efecto terapéutico localizado en el compartimento microvascular renal en ratas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la administración sistémica de fármacos antiinflamatorios o antifibróticos, es que la técnica de administración intrarrenal minimiza los posibles efectos secundarios sistémicos. Las implicaciones de esta técnica se extienden a una terapia de una variedad de patologías renales, ya que la función microvascular renal está involucrada en un amplio espectro de enfermedades renales.

Desempeña un papel clave en la progresión del daño renal. Para prepararse para la cirugía, comience por esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave. Después de anestesiar a una rata, de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera al animal a una almohadilla térmica controlada, para preservar la temperatura corporal del animal a 37 grados centígrados.

Use 1% a 2% de isofluorano en un litro por minuto de oxígeno para mantener la anestesia. Administrar un analgésico por vía subcutánea y aplicar ungüento ocular para prevenir la sequedad. Para compensar la pérdida de líquidos corporales, administrar 10 mililitros por kilogramo de suero fisiológico al 0,9% por vía subcutánea.

Luego, afeita el área abdominal y usa povidona yodada y almohadillas de etanol al 70% para limpiar la piel. Para comenzar la cirugía, asegúrese de que la profundidad de la sedación sea adecuada mediante el control de los reflejos físicos, como la retirada de un pellizco en el dedo del pie. Use una hoja de bisturí quirúrgico número 10 para realizar una laparotomía a través de una pequeña incisión en la línea media.

Con hisopos de algodón, tire del intestino y el colon hacia el lado derecho del abdomen y cúbralos con una gasa estéril, empapada en solución salina normal al 0,9% para mantener los órganos húmedos. Retraiga suavemente hacia arriba el bazo, el hígado, el estómago y el páncreas para exponer la aorta y la arteria renal izquierda. A continuación, bajo un microscopio quirúrgico, utilice pinzas curvas de disección roma con un movimiento abierto y cerrado repetido a lo largo de los vasos e hisopos de algodón estériles, para separar cuidadosamente la aorta abdominal por encima y por debajo del riñón izquierdo y la arteria renal izquierda de las venas, la grasa y el tejido conectivo circundante.

El uso de hisopos de algodón ayuda a evitar daños en los nervios y los vasos sanguíneos infectados, en particular en las venas de paredes delgadas. A continuación, coloque una sutura de seda 4-0 por debajo de la aorta y, mediante pinzas microvasculares, pinza la aorta por encima y por debajo de la bifurcación de la arteria renal. Ahora, con un catéter intravenoso de calibre 24, perfore la aorta a nivel de la bifurcación de la arteria renal izquierda y avance cuidadosamente el catéter hacia la arteria renal.

Debido al pequeño tamaño de la arteria renal, el catéter puede perforar el vaso. Es importante trabajar bajo un microscopio quirúrgico e insertar la aguja lo más paralela posible a la arteria. Luego, conecte una jeringa llena de solución farmacéutica o solución salina al catéter y profusa el riñón.

Inmediatamente después de la profusión, use un clip microvascular para pinzar la vena renal izquierda y el uréter izquierdo antes de retirar el catéter. A continuación, coloque un trozo de esponja de gelatina hemostática absorbible con una pequeña gota de adhesivo tisular sobre la zona perforada de la aorta y, con un intercambiador de algodón, aplique una presión suave. Al mismo tiempo, suelte la pinza de la aorta por debajo de la bifurcación de la arteria renal izquierda.

Después de cinco minutos, suelte la pinza de la vena renal y el uréter. Suelte con cuidado la pinza de la aorta por encima de la bifurcación de la arteria renal izquierda y permita que el riñón se reperfunda. La isquemia renal total no debe durar más de siete minutos.

Después de asegurarse de que no se produzca ningún sangrado activo, y de observar de cerca la zona durante 10 minutos más, utilice suturas reabsorbibles 4-0 y un patrón continuo para prevenir la infección, y cierre la incisión abdominal en dos capas. Aplique un ungüento antibiótico tópico sobre el área de la incisión para prevenir infecciones. Luego, transfiera a la rata a la jaula de observación en una almohadilla tibia hasta que se recupere por completo.

Después de completar todos los estudios, eutanasiar a los animales de acuerdo con el protocolo de texto. Se inyectaron dos dosis diferentes de VEGF recombinante de rata, o PBS como control, en ratas, y luego los animales fueron sacrificados ocho horas después de la cirugía para examinar la activación de la vía del VEGF. Como se ha visto aquí, mediante la tinción de H&E, el procedimiento quirúrgico no afectó a la morfología del riñón perfundido, en comparación con el órgano control.

Además, la tinción roja grave no mostró un aumento en la deposición de la matriz extracelular en respuesta al tiempo isquémico y la infusión de rrVEGF, en comparación con el tejido control. Finalmente, mediante el análisis de Western blot, se observó un aumento pequeño pero significativo en la expresión de proteínas involucradas en las vías del VEGF, incluyendo VEGF, FLK-1, Phospho-AKT y AKT, y Phospho-ERK y ERK. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unos 45 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante seguir las pautas institucionales y nacionales para el cuidado y uso del animal, en particular, para aliviar el dolor y las molestias mediante la administración de analgésicos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el Western blot o la tinción histológica del riñón para determinar la eficacia de diferentes terapias, así como la activación de vías específicas.