El Visual detección colorimétrica de polimorfismos de múltiples nucleótidos en una plataforma de manipulación de neumático de la gotita

El objetivo general de este procedimiento es combinar un método simple para detectar visualmente polimorfismos de múltiples nucleótidos con una plataforma neumática de manipulación de gotas. La plataforma de detección de ADN se encuentra en una superficie abierta y es fácil de usar para los investigadores bioquímicos. Investigamos una herramienta sencilla para detectar repetidamente mutaciones genéticas y enfermedades genéticas.

Tiene un mayor potencial para ayudarnos a comprender cómo la variación genética conduce a la enfermedad. Combinamos dos métodos novedosos y sencillos. El polimorfismo multinucleótido se puede detectar en la plataforma neumática de manipulación de gotas a simple vista y sin ningún instrumento adicional.

El método para detectar el polimorfismo multinucleótido será demostrado por Tzu-Ming Wang, el postmédico de nuestro grupo. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de 100 micromolares de ADN de sonda como se indica en el protocolo de texto. Luego, agregue el ADN de la sonda a una solución de nanopartículas de oro de un OD por mililitro.

Llevar la concentración final de SDS a 0,01% y de PBS a 0,01 molar. Deje que la solución se incube durante 20 minutos. A continuación, aumente la concentración de cloruro de sodio a 0,05 molar añadiendo una solución de cloruro de sodio de dos molares y PBS de 0,01 molares.

Mantenga la concentración de SDS al 0,01% y deje que la solución se incube durante 20 minutos. Aumente la concentración de cloruro de sodio en incrementos de 0,1 molar en intervalos de 20 minutos hasta alcanzar una concentración final de un molar. Incubar la solución a 23 grados centígrados durante la noche en un rotor.

Después de que las muestras de ADN y las nanopartículas de oro se hayan conjugado, centrifugue la solución a 7.000 veces g durante 30 segundos. Retire el sobrenadante. A continuación, prepare una solución de sonda de nanopartículas de oro de 25 nanomolares resuspendiendo el pellet en agua desionizada.

Prepare las muestras de ADN objetivo como se describe en el protocolo de texto. Agregue seis microlitros de solución de sonda de nanopartículas de oro en cada muestra de ADN con cloruro de sodio. Con un mezclador de vórtice, agite cada solución de muestra durante cinco minutos a 23 grados centígrados.

A continuación, añada seis microlitros de 400 milimolares de hidroxilamina y seis microlitros de ácido cloroáurico 25,4 milimolar a cada solución de muestra de ADN. Deje estas muestras a un lado, ya que se producirá un cambio constante en la coloración durante la próxima hora. el tamaño, las propiedades ópticas dependientes de la forma de la nanopartícula, el número de desajustes en un fragmento de ADN de muestra típico se pueden discernir a simple vista.

Para comenzar a fabricar la plataforma de manipulación de gotas, utilice una máquina de control numérico por computadora equipada con una broca de 0,5 milímetros para producir moldes maestros a base de PMMA con microestructuras. Para el taladro, use una velocidad de avance de siete milímetros por segundo y una velocidad de rotación de 26,000 rpm, e inspeccione los moldes después de perforar. Utilice un soplador de aire y agua desionizada para limpiar la superficie de los moldes maestros y eliminar cualquier residuo de PMMA.

Después de esto, prepare una mezcla de 10 a uno de base de PDMS y agente de curado. Desgasifique la mezcla en un desecador hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. A continuación, vierte la mezcla de PDMS en el molde maestro.

Hornee durante tres horas a 60 grados centígrados para obtener las microestructuras inversas en las cámaras de aire y canales de aire. Una vez finalizado el horneado, retire la capa de PDMS del molde maestro y perfore agujeros para las entradas de succión de aire. Utilice un sistema de tratamiento con plasma de oxígeno para limpiar la membrana y la capa de PDMS.

Después del tratamiento, una la membrana de PDMS y la capa de PDMS, y luego perfora agujeros en esta estructura conjugada. A continuación, pegue el PDMS y el sustrato de vidrio con una placa calefactora a 90 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez que las capas estén unidas, coloque la placa compuesta en una máquina de corte por láser PDMS con la membrana hacia arriba.

Importe el archivo dwg para definir el área súper hidrofóbica y tenga en cuenta que esto se grabará directamente en la membrana PDMS. Limpie la superficie superhidrofóbica recién grabada con agua desionizada. Esto eliminará cualquier residuo carbonizado.

Una vez que se haya limpiado la superficie, conecte la entrada de succión de aire y la bomba de vacío a través de una válvula solenoide. Luego, conecte la válvula solenoide a una computadora para controlarla con un módulo USB de E/S digital. Una vez que se haya configurado la plataforma neumática de manipulación de gotas, agregue 10 microlitros de ADN objetivo de 0,5 micromolares en el área superhidrofóbica.

A continuación, agregue 10 microlitros de solución de sonda de nanopartículas de oro de 25 nanomolares recién hibridada junto a la gota de ADN objetivo. Utilice un programa simple para controlar la succión de aire a la plataforma a través de una válvula solenoide. Ajuste la presión a menos 80 kilopascales y la frecuencia de conducción a cinco hercios.

Proporciona succión a lo largo de las trayectorias de vibración de la gota, lo que hace que choquen y se fusionen. A continuación, mezcle la gota fusionada manipulando la succión para hacer rodar la muestra durante tres minutos. Agregue dos microlitros de hidroxilamina de 400 milimolares y dos microlitros de ácido cloroáurico de 25,4 milimolares al área superhidrofóbica de la plataforma de manipulación de gotas neumáticas.

Manipula la succión para que las gotas choquen y se fusionen. Luego, mezcle la gota fusionada rodándola durante un minuto. Observa el color de la gota final a simple vista.

En este estudio, los polimorfismos de múltiples nucleótidos se detectan colorométricamente utilizando el crecimiento mediado por hibridación de ADN de sondas de nanopartículas de oro. Aquí, las muestras de ADN poseen diferentes afinidades con el ADN de la sonda, lo que provoca diferencias en el crecimiento de las nanopartículas de oro, visto como un cambio de color. La muestra de ADN no coincidente de tres pares de bases tiene menos hibridación que el ADN totalmente complementario, lo que puede verse como distinciones notables en el color, especialmente en concentraciones más altas.

El ADN no coincidente de seis bases tiene una afinidad de hibridación débil con la sonda y, por lo tanto, el tamaño de crecimiento de las nanopartículas de oro fue pequeño. Se ha demostrado que este análisis colorométrico es repetible cuando las muestras se manipulan a través de una plataforma de succión neumática, ya que los resultados de la discordancia del ADN son fácilmente observables a simple vista. Una vez dominado, todo el procedimiento dura menos de cinco minutos desde la adición de la muestra y el reactivo hasta el resultado de los mismos, lo que es mucho más rápido que el método tradicional.

El total en cada operación es de solo 10 microlitros, que es significativamente menos de lo que se requiere en un sistema grande. Siguiendo este procedimiento, una vez que se confirma que la variación de la secuencia del espacio del fragmento de ADN es responsable de una enfermedad específica. El producto específicamente diseñado se puede utilizar para adquirir una serie de discrepancias de la muestra de ADN.

La plataforma neumática de manipulación de gotas es más biocompatible que otros métodos como el peso óptico, la electrofluorescencia del tinte, el electropeso y la actuación capilar de shoomoo. El método de detección de polimorfismo multinucleótido propuesto se llevó a cabo bajo una plataforma neumática de manipulación de gotas, lo que significa que las muestras y los reactivos se pueden cargar y recoger directamente con una pipeta. Tras su desarrollo, esta técnica tiene un alto potencial para el cribado de ADN y otras aplicaciones químicas y biomáticas.