Name: La esporulación eficiente de Saccharomyces cerevisiae En un formato de 96 multipocillos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a esporular eficientemente Saccharomyces cerevisiae en formato de 96 pocillos para cribado de alto rendimiento. Este método optimiza la aireación y permite estudios genéticos a gran escala de manera rentable.

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Este trabajo fue apoyado por una beca Joseph P. Healey de la Universidad de Massachusetts Boston (LSH) y R15 GM86805 de los NIH (LSH). SMP es apoyado en parte por una beca de Sanofi-Genzyme en la Universidad de Massachusetts, Boston.

1. Preparación para la esporulación Nota:. Los medios descritos en este protocolo se realizan utilizando las recetas y los métodos estándar 13,17 La tabla 1 muestra la formulación de 1 l de los diferentes medios utilizados en este protocolo. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bacto peptona </td><td style="width: 50px;"> Extracto de levadura </td><td style="width: 50px;"> Bacto Agar </td><td style="width: 60px;"> Dextrosa </td><td style="width: 70px;"> Acetato de potasio </td><td style="width: 60px;"> Glicerol </td><td style="width: 60px;"> ddH2O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> placas YPG </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> placas de YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> líquido YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> líquido YPA </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> medios de esporulación </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Formulaciones de medios montos son dados con 1 l de medio. Específicamente acerca de los mediosingredientes se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. <ol><li> Si todas las células en esporulación será el mismo genotipo, siga este procedimiento: <ol><li> Descongelar la cepa de levadura que se utiliza en una placa de YPG (YPGlycerol). Crecer la levadura de 12-16 horas a 30 ° C. Es importante destacar que también están preparados células SK1 esporular, por lo cepas SK1 no se deben dejar demasiado tiempo en placas YPG, o pueden esporular en el plato. Nota: Se prefiere una cepa recientemente descongelado crecido en YPG, como la utilización de glicerol como fuente de carbono requiere la fosforilación oxidativa, y por lo tanto selecciona para células que tienen ADN mitocondrial funcional. células SK1 tienen una tendencia a perder el ADN mitocondrial funcional y convertirse petites. se necesita ADN mitocondrial funcional para la esporulación. </li><li> levadura consecutivas de la placa YPG sobre una placa de YPD (YPDextrose) para colonias individuales. Crecer la levadura en la placa YPD 24-28 horas a 30 ° C. </li><li> Después de alrededor de 36-48 h de crecimiento en YPD medios sólidos, iniciar un cultivo de 25 ml de YPD utilizando una sola coloniade la placa de YPD. Crecer este cultivo hasta que las células son aproximadamente DO600 = 4,0 a 7,0. Realice este paso a 30 ° C durante la noche en una incubadora con agitación, agitando a 220 rpm. </li><li> A partir del cultivo YPD, utilice una cantidad adecuada de células para iniciar 1.000 ml de YPA cultivo (YPAcetate) que es OD 600 = 0,1 para cada necesidad placa de 96 pocillos en la Sección 2. crecer la levadura en una incubadora de agitación 30 ° C (con agitación a 220 rpm) hasta que el cultivo OD 600 es entre 1,3 a 1,5. Nota: inocular 100 ml de cultivo YPA para cada placa de múltiples pocillos 96 que se proyectarán en la Sección 2. Por ejemplo, si el examen de cuatro placas de múltiples pocillos 96, serán necesarios 400 ml de cultivo YPA. A partir de 10% volumen extra en la cultura YPA es necesaria para proteger contra la pérdida de volumen por evaporación. Por lo general, se tardará entre 12-16 horas para que las células alcanzan la densidad óptica apropiada 600; la cantidad de tiempo puede variar dependiendo del genotipo de la cepa de levadura. YPA es los medios de comunicación presporulation. Pregrowthen acetato de ayuda a inducir la expresión de genes (como IME1) necesarios para la esporulación eficiente y síncrono 6. </li><li> Centrifugado a 1.800 xg en una centrífuga de mesa durante 5 minutos para sedimentar las células cultivadas en YPA. Lavar las células 1 vez con 0,5 volúmenes de agua desionizada estéril tratada en autoclave. Girar de nuevo, y desechar lavar. Resuspender las células en medios volumen esporulación 1x. Continúe con la Sección 2. </li></ol></li><li> Si el uso de células de esporulación que son de diferentes genotipos, (es decir, transformadas con plásmidos diferentes o que contienen diferentes mutaciones, normalmente obtenidos y almacenados como reservas congeladas), células de agrupación de los diferentes genotipos en un formato de múltiples pocillos 96. A continuación, siga este procedimiento: <ol><li> Use un frogger 96 puntas estériles para transferir las células procedentes de las existencias congeladas descongeladas en placas de 96 pocillos (s) de múltiples pocillos en medios sólidos YPG. Crecer durante la noche de levadura a 30 ° C. </li><li> El uso de un frogger 96 prong estéril, la transferencia de células de YPG medios sólidos en medios sólidos YPD o selectivamedios sólidos (es decir, medios mínimos sintéticos carece de los aminoácidos, si las células contienen plásmidos que requieren la selección). Crecer levadura a 30 ° C hasta que las colonias se forman para cada cepa, típicamente 1 día en YPD y 2 días si los medios de comunicación selectiva es necesario. </li><li> Alícuota de 1,2 ml de medio líquido YPD o medios líquidos selectivos en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos de 96 profundas 2 ml. La transferencia de células a partir de medios sólidos en medios líquidos utilizando un frogger, cubrir con una tapa de plástico en su lugar por cinta, y crecen durante la noche a 30 ° C agitador, agitación a 220 rpm. Nota: Para minimizar la contaminación, placas de cubierta utilizando las tapas de plástico de una placa de Petri rectangular. Mantenga las tapas en su lugar con un trozo de cinta, por lo que la circulación de aire está restringido mínimamente. </li><li> placas de centrifugar a 1800 xg durante 5 min, utilizando una cubeta oscilante centrífuga con adaptadores para acomodar placas de 96 pocillos. Retirar los medios de comunicación de las células; añadir 500 YPA l a cada pocillo y resuspender las células sedimentadas en el YPA. Cubrircon tapa de plástico en su lugar por cinta. </li><li> Se cultivan las células durante 15 horas a 30 ° C en una incubadora con agitación, agitando a 220 rpm. Continúe con la Sección 2. </li></ol></li></ol> 2. Las células esporuladas en un formato de 96 multipocillos <ol><li> Añadir o bien un talón sólida estéril 3 mm de vidrio o una estériles 5 mm x 2 mm barra de agitación magnética en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con 1,3 ml pozos. (Ver resultados representativos de abajo para una discusión sobre la conveniencia de utilizar un cordón o una barra de agitación.) </li><li> Si todas las células que se proyectarán son del mismo genotipo, ir a 2.2.1. Si las células que se proyectarán son de diferentes genotipos, ir a 2.2.2. <ol><li> Tomar células de la etapa 1.1.5 y alícuota de 500 l de células más medios de comunicación en cada pocillo de la placa de múltiples pocillos 96. Cubra con una tapa de plástico en su lugar por cinta. Proceder a 2,3. </li><li> Centrifugar las células que se encuentran en YPA de 1.2.4 a 1800 xg durante 5 min, utilizando una cubeta oscilante centrífuga con adaptadores para acomodar placas de 96 pocillos. verter def medios de las células. Añadir 500 l de medios de esporulación a cada pocillo y resuspender las células sedimentadas en los medios de esporulación. Cubra con una tapa de plástico en su lugar por cinta. Proceder a 2,3. </li></ol></li><li> Si se utiliza una cuenta de vidrio, colocar las muestras en una incubadora de agitación a 30 ° C y agitar a 220 rpm durante la esporulación. Si se utiliza una barra de agitación magnética, colocar las muestras en una placa de agitación en el interior de una incubadora a 30 ° para la esporulación. Nota: La velocidad de agitación exacto para las barras de agitación magnéticas no es muy importante, siempre y cuando todas las barras se mueven con energía y la cultura se airea. </li><li> Para controlar la progresión a través de la esporulación, retirar muestras de la cultura de esporulación para la visualización, Añadir 6 l de células de los cultivos a las 24 esporulación l de medios de esporulación en una placa de 96 pocillos cubreobjetos (dilución 1: 5). Deja células que conformarse con 5 min antes de examinar las células usando un microscopio invertido. Nota: En las células de tipo salvaje SK1, esporas maduras compactos formarán un 36 horas después de la transferencia al medio de esporulación. La progresión a través de esporulación puede ser monitoreada por microscopía utilizando marcadores fluorescentes, tales como un marcador nuclear (es decir, HTB2-mCherry 18) para examinar la división meiótica o un marcador de membrana prospore (es decir, G20 19) para examinar la morfogénesis de esporas. Alternativamente, la formación de esporas refráctiles se puede ver usando microscopía de Nomarski DIC a partir de 12 h después de la transferencia al medio de esporulación. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí se presenta un protocolo para la esporulación de levadura SK1 en un formato de múltiples pocillos 96. La aireación es clave para la esporulación eficiente, que requiere el uso de cualquiera de una barra de agitación o una perla de vidrio en cada pocillo. Cuando las células son esporulados en una placa de múltiples pocillos 96 en una incubadora de agitación sin ya sea un cordón o una barra de agitación, las células no esporulan eficiente. Sólo un pequeño aumento en la eficiencia de la esporulación se ve cuando se es...

La esporulación en la levadura en ciernes ha sido estudiado para proporcionar información sobre muchos aspectos de la biología, incluyendo el control de la segregación de cromosomas durante la meiosis 1, los mecanismos de recombinación genética 2, el control del desarrollo de células de señalización 3, control nutricional de desarrollo 4, la transcripción regulación del desarrollo 5, y el examen de la formación de esporas 6. La formación de esporas incluye una novela caso la división celular que implica la formación de nuevos compartimentos de membrana dentro de la célula madre seguido de la deposición de una pared de la espora de protección 6. Estos estudios que examinan células esporuladas a menudo se aprovechan de la cepa de levadura rápida esporulación SK1, que puede someterse al proceso de esporulación en aproximadamente 24 hr de una manera relativamente eficiente 7,8. Aunque optimización de las condiciones de esporulación de levadura en ciernes se han descrito 9-13, estos experimentoss examinó la esporulación en medios sólidos o en cultivos líquidos de mayor escala, donde la esporulación se lleva a cabo utilizando tubos de cultivo o frascos. Aquí se describe un método para la esporulación de levadura en un formato de placa de múltiples pocillos 96. Encontramos que para este método, la aireación es crítica para la esporulación síncrono y eficiente, y hemos ideado técnicas para asegurar la suficiente esporulación un formato de múltiples pocillos de pequeño volumen. Esporulación en un formato de 96 placa de múltiples pocillos permite para las células para ser examinadas usando técnicas de alto rendimiento optimizados y reactivos para un formato de placa de múltiples pocillos, como la detección de altos supresores de copias deseado con una biblioteca de azulejos 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1,3 ml Placas</td><td>DeepWell ThermoScientific 260251</td><td></td><td>Utilizado para la esporulación</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml Placas DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Se utiliza para el crecimiento de la presporulación, paso 1.2.3</td></tr><tr><td>Perla de vidrio de 3 mm</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Utilizada para la esporulación</td></tr><tr><td>Barra agitadora de 5 mm x 2 mm, paquete de 12</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Utilizado para la esporulación</td></tr><tr><td>96 pozo frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td><td>necesario para la</td></tr><tr><td>copiadora de biblioteca</td> del paso 1.2 <td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>necesario para el paso 1.2; para ser utilizado con la</td></tr><tr><td>placa de Petri rectangular</td><td>Frogger ThermoScientific</td><td>264728</td><td>necesario para el paso 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>necesarios para los medios</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td>necesario para los medios</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>necesarios para los medios</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>necesario para los medios</td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>necesario para los medios</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>necesario para los medios</td></tr><tr><td>Placa inferior de vidrio negra de 96 pocillos</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>necesaria para el paso 2.4</td></tr></tbody></table>

la esporulación eficiente de<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; en un formato de 96 multipocillos

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Durante épocas de estrés nutricional, Saccharomyces cerevisiae sufre gametogénesis, conocida como esporulación. Las células de levadura diploides que están hambrientas de nitrógeno y carbono iniciarán el proceso de esporulación. El proceso de esporulación incluye meiosis seguida de formación de esporas, donde los núcleos haploides se empaquetan en esporas resistentes al medio ambiente. Hemos desarrollado métodos para la esporulación eficiente de levadura en gemación en 96 placas de pocillos múltiples, para aumentar el rendimiento de las células de levadura de cribado para fenotipos de esporulación. Estos métodos son compatibles con el cribado con plásmidos que contienen levaduras que requieren selección nutricional, cuando se utilizan medios mínimos adecuados, o con el cribado de levaduras con alteraciones genómicas, cuando se utiliza un régimen de preporulación rico. Encontramos que para este método, la aireación durante la esporulación es crítica para la formación de esporas, y hemos ideado técnicas para asegurar una aireación suficiente que sean compatibles con el formato de placa multipocillo 96. Aunque estos métodos no logran el nivel típico de esporulación de ~ 80% que se puede lograr en experimentos basados en matraces de gran volumen, estos métodos lograrán de manera confiable un nivel de esporulación de alrededor del 50-60% en placas de pocillos múltiples de pequeño volumen.

<html> Para evaluar este protocolo, las eficiencias de esporulación obtenidos de esporulación las células en placas de pocillos múltiples (como se describió anteriormente) se compararon a las células esporulados utilizando volúmenes más grandes en matraces (Tabla 2). El uso de placas de múltiples pocillos no alcanzó la alta eficiencia se ve cuando esporulación en frascos, donde la eficiencia ~ 80% se puede ver de forma rutinaria. Esporulación en placas de pocillos múltipl...

Aquí, la esporulación de Saccharomyces cerevisiae se lleva a cabo en un formato de 96 pocillos múltiples.

La esporulación eficiente de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; En un formato de 96 multipocillos

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

El objetivo general de este protocolo es esporular levaduras por gemación de manera eficiente en un formato de 96 pocillos. Aunque muchos estudios a gran escala se han realizado en la levadura por gemación, los estudios de alto rendimiento que analizan la meiosis y la esporulación han sido limitados. La técnica descrita en este video tiene la ventaja de esporular levaduras de manera eficiente y rentable en un formato de 96 pocillos compatible con ensayos de alto rendimiento.Obtuve la idea de este método porque quería utilizar una biblioteca de plásmidos en mosaico de dos micrómetros para realizar una selección de supresores de alta copia de un mutante que no podía formar esporas refringentes. Inicialmente, mis eficiencias de esporulación eran bajas en el formato de 96 pocillos. Descubrí que esto se debía a una aeración inadecuada.Comience este procedimiento descongelando la cepa de levadura SK1 en una placa de extracto de levadura, peptona y glicerol (YPG). Utilice un asa estéril para raspar una pequeña cantidad de células del vial congelado que contiene el stock de glicerol y extiéndalas sobre una placa YPG. Incube la levadura durante 12 a 16 horas a 30 grados Celsius.A continuación, siembre la levadura de la placa YPG en una placa de extracto de levadura peptona dextrosa, o placa YPD, para obtener colonias aisladas. Incube la levadura en la placa YPD durante 24 a 48 horas a 30 grados Celsius. Tras 24 a 48 horas de crecimiento en medio sólido YPD, inicie un cultivo de 25 mililitros de YPD utilizando una colonia aislada de la placa YPD.Cultive esta cepa durante la noche en un incubador agitador a 30 grados Celsius y 220 RPM hasta que las células alcancen una DO600 de 4,0 a 7,0. Al día siguiente, use una cantidad adecuada de células de la cultura YPD para iniciar una cultura de 125 mililitros en acetato de peptona extracto de levadura, o YPA, con una DO600 de 0,1. Cultive la muestra en un incubador agitador a 30 grados Celsius y 220 RPM hasta que la DO600 esté entre 1,3 y 1,5.Transfiera el cultivo a tubos de centrífuga y centrifugue a 1800X G en una centrífuga de mesa durante cinco minutos para obtener el sedimento celular. Lave las células una vez con un volumen de 0,5 de agua desionizada estéril autoclaveada. Vuelva a centrifugar y deseche el agua.Re-suspender las células en un volumen 1X de medio de esporulación. Para preparar células de diferentes genotipos, se transfieren primero células de stocks congelados descongelados en una placa de 96 pocillos a un medio sólido YPG. Flamear un porta-pocillos de 96 puntas y luego enfriarlo momentáneamente sobre una placa de medio sólido antes de tocar con él las colonias de levadura.Cultive la levadura durante la noche a 30 grados Celsius. Al día siguiente, transfiera las células desde el medio sólido YPG al medio sólido YPD o selectivo, dependiendo del genotipo de la cepa. En esta demostración se utiliza YPD.Cultive la levadura a 30 grados Celsius hasta que se formen colonias para cada cepa. Aliquote 1,2 mililitros de medio líquido YPD en cada pocillo de una placa de 96 pocillos profundos. Transfiera las células desde el medio sólido al medio líquido.Cubra la placa con una tapa de plástico de una placa de Petri rectangular y sujete la tapa en su lugar usando un trozo de cinta para restringir mínimamente la circulación de aire. Incube las células durante la noche en un agitador a 30 grados Celsius a 220 RPM. Al día siguiente, centrifugue a 1800X G durante cinco minutos.Vierta el medio y agregue 500 microlitros de YPA a cada pocillo. Y resuspenda las células en el sedimento. Cubra la placa con una tapa de plástico sujeta con cinta.Cultive las células durante 15 horas en un incubador agitador a 30 grados Celsius y 220 RPM. Para proporcionar una aireación adecuada que favorezca la esporulación eficiente, agregue en cada pocillo de una placa de 96 pocillos ya sea una perla de vidrio sólida estéril de tres milímetros o una barra magnética estéril de cinco milímetros por dos milímetros. Si todas las células son del mismo genotipo, distribuya alícuotas de 500 microlitros de células más medio en cada pocillo de la placa de múltiples pocillos de 96.Cubra la placa con una tapa de plástico sujeta con cinta. Si las células son de diferentes genotipos, centrifugue las células que están en YPA a 1800X G durante cinco minutos y deseche el medio. Añada 500 microlitros de medio de esporulación a cada pocillo.Y resuspenda las células en el sedimento en el medio de esporulación. Cubra la placa con una tapa de plástico sujeta con cinta. Si se utilizan perlas de vidrio, coloque las muestras en un incubador agitador a 30 grados Celsius y agite a 220 RPM para la esporulación.Si se utilizan barras magnéticas de agitación, coloque las muestras sobre una placa agitadora dentro de un incubador a 30 grados Celsius para la esporulación. La velocidad exacta de agitación de las barras magnéticas no es muy importante, siempre que todas las barras se muevan con energía y el cultivo esté aerado. 36 horas después, recupere las muestras para monitorear el progreso durante la esporulación.Retire seis microlitros de células de cada cultivo en esporulación y añádalos a 24 microlitros de medio de esporulación en una placa de 96 pocillos con cubreobjetos. Deje que las células sedimenten durante cinco minutos antes de examinarlas utilizando un microscopio invertido. En estas imágenes se muestra una esporulación representativa de dos cepas diferentes, visualizadas mediante un objetivo de 63X en un microscopio invertido.Tétradas refringentes, indicadas por las flechas, pueden observarse en el cultivo de tipo salvaje, pero no en el cultivo que contiene las células deficientes en esporulación con deleción de smk1. Se realizaron comparaciones entre las eficiencias de esporulación de células esporuladas en placas de pocillos múltiples y células esporuladas utilizando volúmenes mayores en matraces.El uso de placas de pocillos no logró la alta eficiencia que habitualmente se observa al emplear el protocolo más típico de esporulación en matraces. La esporulación en placas de pocillos con una adecuada aireación puede alcanzar eficiencias de esporulación suficientes, superiores al 50 %, obteniéndose los mejores resultados utilizando una barra de agitación de cinco milímetros. Sin embargo, dada la elevada costo de las barras de agitación pequeñas, las eficiencias obtenidas con bolas de vidrio son comparables.Aunque tanto las barras de agitación de cinco milímetros como las de siete milímetros caben dentro del pocillo de una placa de 96 pocillos, el uso de la barra de agitación de siete milímetros dio como resultado una eficiencia de esporulación deficiente. La barra de agitación de siete milímetros en un pocillo tiende a interactuar con la barra de agitación de un pocillo adyacente, lo que impide que las barras agiten adecuadamente y proporcionen una aireación suficiente al cultivo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo esporular eficientemente células de levadura en cultivo líquido en formato de placa de 96 pocillos. Una vez dominado, este proceso puede completarse en seis días, si se realiza correctamente. Este procedimiento puede utilizarse para analizar diferentes cepas mutantes, plásmidos o inhibidores de moléculas pequeñas en cuanto a su efecto sobre la meiosis y la esporulación.Después de su desarrollo, esta técnica se utilizó para estudiar la regulación del ciclo celular meiótico y cómo la citocinesis y la meiosis están acopladas en la esporulación de Saccharomyces cerevisiae.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

Investigación

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