La esporulación eficiente de Saccharomyces cerevisiae En un formato de 96 multipocillos

El objetivo general de este protocolo es esporular la levadura en ciernes de manera eficiente en un formato de 96 pocillos. Aunque se han llevado a cabo muchos cribados a gran escala de la levadura en ciernes, los estudios de alto rendimiento que analizan la meiosis y la esporulación han sido limitados. La técnica descrita en este video tiene la ventaja de esporular la levadura de manera eficiente y rentable en un formato de 96 pocillos compatible con el cribado de alto rendimiento.

Primero se me ocurrió la idea de este método porque quería usar una biblioteca de plásmidos de dos micras en mosaico para detectar supresores de alta copia de un mutante que no podía formar esporas refractiles. Inicialmente, mis eficiencias de esporulación fueron pobres en el formato de 96 pocillos. Descubrí que esto se debía a una aireación inadecuada.

Comience este procedimiento descongelando la cepa de levadura SK1 en una placa de extracto de levadura, peptona, glicerol o YPG. Use una varilla estéril para raspar una pequeña cantidad de células del vial del congelador que contiene el caldo de glicerol y extiéndalo en un plato de YPG. Cultive la levadura durante 12 a 16 horas a 30 grados centígrados.

A continuación, raye la levadura de la placa YPG en una placa de extracto de levadura peptona dextrosa, o YPD, para colones individuales. Cultive la levadura en la placa YPD durante 24 a 48 horas a 30 grados centígrados. Después de 24 a 48 horas de crecimiento en medios sólidos YPD, comience un cultivo de YPD de 25 mililitros utilizando una sola colonia de la placa YPD.

Cultive este cultivo durante la noche en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados a 220 RPM hasta que las células alcancen un OD600 de 4.0 a 7.0. Al día siguiente, utilice una cantidad adecuada de células del cultivo de YPD para iniciar un cultivo de 125 mililitros en acetato de peptona de extracto de levadura, o YPA, con una OD600 de 0,1. Cultive el cultivo en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados a 220 RPM hasta que el OD600 esté entre 1,3 y 1,5.

Transfiera el cultivo a tubos de centrífuga y centrifuga a 1800X G en una centrífuga de mesa durante cinco minutos para granular las células. Lave las células una vez con un volumen de 0,5 de agua desionizada estéril esterilizada en autoclave. Vuelve a girar y desecha el agua.

Vuelva a suspender las células en un volumen 1X de medios de esporulación. Para preparar células de diferentes genotipos, primero se transfieren células de existencias congeladas descongeladas en una placa de 96 pocillos múltiples a medios sólidos YPG. Flamee una rana de 96 puntas y luego enfríela momentáneamente en una placa de medio sólido antes de tocarla con las colonias de levadura.

Cultive la levadura durante la noche a 30 grados centígrados. Al día siguiente, transfiera las células de los medios sólidos YPG al YPD o a los medios sólidos selectivos, según el genotipo de la cepa. YPD se utiliza en esta demostración.

Cultive la levadura a 30 grados centígrados hasta que se formen colonias para cada cepa. Alícuota de 1,2 mililitros de medio líquido YPD en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de profundidad. Transfiera las células del medio sólido al medio líquido.

Cubra la placa con una tapa de plástico de una placa de Petri rectangular y sostenga la tapa en su lugar con un trozo de cinta adhesiva para restringir mínimamente la circulación de aire. Haga crecer las células durante la noche en un agitador de 30 grados centígrados a 220 RPM. Al día siguiente, centrifugar a 1800X G durante cinco minutos.

Vierta el medio y agregue 500 microlitros de YPA a cada pocillo. Y volver a suspender las células peletizadas. Cubra el plato con una tapa de plástico sujeta con cinta adhesiva.

Haga crecer las células durante 15 horas en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados a 220 RPM. Para proporcionar una aireación adecuada para una esporulación eficiente, agregue en cada pocillo de una placa de 96 pocillos una perla de vidrio sólido estéril de tres milímetros o una barra de agitación magnética estéril de cinco milímetros por dos milímetros. Si todas las células son del mismo genotipo, se introducen 500 microlitros de células más medios en cada pocillo de la placa de 96 pocillos múltiples.

Cubra el plato con una tapa de plástico sujeta con cinta adhesiva. Si las células son de diferentes genotipos, haga girar las células que están en YPA a 1800X G durante cinco minutos y vierta el medio. Agregue 500 microlitros de medio de esporulación a cada pocillo.

Y volver a suspender las células peletizadas en el medio de esporulación. Cubra el plato con una tapa de plástico sujeta con cinta adhesiva. Si usa perlas de vidrio, coloque las muestras en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y agite a 220 RPM para obtener esporulación.

Si utiliza barras de agitación magnéticas, coloque las muestras en una placa de agitación dentro de una incubadora de 30 grados Celsius para la esporulación. La velocidad exacta de agitación de las barras magnéticas no es muy importante, siempre y cuando todas las barras se muevan enérgicamente y el cultivo esté aireado. 36 horas después, recupere las muestras para controlar la progresión a través de la esporulación.

Extraiga seis microlitros de células de cada cultivo de esporulación y agréguelos a 24 microlitros de medios de esporulación en una placa de cubreobjetos de 96 pocillos. Deje que las células se asienten durante cinco minutos antes de examinarlas con un microscopio invertido. En estas imágenes de células visualizadas con un objetivo de 63X en un microscopio invertido se muestra una esporulación representativa de dos cepas diferentes.

Las tétradas refractiles, indicadas por las puntas de flecha, se pueden ver en el cultivo de tipo salvaje. Pero no en el cultivo que contiene las células eliminadoras smk1 deficientes en esporulación. Se realizaron comparaciones entre las eficiencias de esporulación de las células esporuladas en placas multipocillos y las células esporuladas utilizando volúmenes mayores en matraces.

El uso de placas de pocillos múltiples no logró la alta eficiencia que se observa rutinariamente cuando se utiliza el protocolo más típico de esporulación en matraces. La esporulación en placas de pocillos múltiples con una aireación adecuada puede lograr eficiencias de esporulación suficientes superiores al 50% con los mejores resultados obtenidos utilizando una barra de agitación de cinco milímetros. Sin embargo, dado el alto costo de las barras agitadoras pequeñas, las eficiencias obtenidas con perlas de vidrio son comparables.

Aunque las barras de agitación de cinco milímetros y siete milímetros caben dentro del pocillo de una placa de 96 pocillos múltiples, el uso de una barra de agitación de siete milímetros resultó en una eficiencia de esporulación deficiente. La barra de agitación de siete milímetros en un pozo tiende a interactuar con una barra de agitación en un pozo adyacente. Evitando que las barras se agiten correctamente y proporcionando una aireación adecuada al cultivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo esporular de manera eficiente células de levadura en cultivo líquido en el formato de 96 pocillos. Una vez dominado, este proceso puede completarse en seis días, si se hace correctamente. Este procedimiento se puede utilizar para detectar diferentes cepas mutantes, plásmidos o inhibidores de moléculas pequeñas por su efecto sobre la meiosis y la esporulación.

Tras su desarrollo, esta técnica se utilizó para estudiar la regulación del ciclo celular meiótico y cómo la citocinesis y la meiosis se acoplan en la esporulación en Saccharomyces cerevisiae.