Name: Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprenda electroforesis capilar para analizar anticuerpos monoclonales usando un capilar neutro. Este protocolo mejora las habilidades analíticas del personal de laboratorio en química analítica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen a Wiley por el permiso concedido para usar los conceptos de la siguiente publicación para este tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Análisis de anticuerpos monoclonales recombinantes por electroforesis de zona capilar. Electroforesis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Este trabajo contó con el apoyo de CONACyT, México, 230551.

1. Preparación de soluciones <ol><li> Preparar la solución de BGE. <ol><li> Preparar 100 ml de una solución compuesta de 0,05% (m / v) de celulosa hidroxi propil metil celulosa (HPMC), 200 mM ε-amino n-caproico (EACA) y acetato de litio 30 mM. NOTA: Como HPMC es un polímero viscoelástico, verter el polvo en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 80 ml de agua y, finalmente, añadir la barra de agitación. Continúe añadiendo los reactivos restantes como normalmente. Use gafas de seguridad al manipular acetato de litio, ya que puede causar irritación en los ojos. </li><li> Ajustar a pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) de ácido acético. Deje que la solución se estabilice durante 5 min y ajustar según sea necesario. </li><li> Añadir agua para completar hasta un volumen final de 100 ml en matraz aforado. </li><li> Filtrar a través de una membrana hidrófila con un tamaño de poro 0,2 micras. </li><li> Almacenar a 2-8 ° C durante un máximo de 7 días. </li></ol></li><li> Preparar el estándar interno. <ol><li> Preparar 1 mlde una solución compuesta de 1% (m / v) de histamina. </li><li> Filtrar a través de una membrana hidrófila con un tamaño de poro 0,2 micras. </li><li> Almacenar a 2-8 ° C durante un máximo de 1 día. </li></ol></li></ol> Preparación 2. Muestra <ol><li> Preparar 180 l de muestra mAb diluido con tampón Tris (tris 50 mM (hidroximetil) aminometano, pH 8,0) a una concentración final de 1 mg / ml. </li><li> Añadir 20 l de 1% (m / v) de histamina. </li><li> Mezclar y centrifugar a 1.000 xg durante 5 seg. </li><li> Colocar un vial micro dentro de un vial universal. </li><li> Transferir la muestra en el vial micro y tapar el vial universal. Dispensar la muestra hacia arriba con el fin de evitar la introducción de burbujas. </li><li> Almacenar a 2-8 ° C durante un máximo de 1 día. </li><li> Colocar el vial universal (con vial micro que contiene la solución de muestra) en la bandeja de entrada de muestra. </li></ol> 3. Preparación de Sistema CE. <ol><li> Limpieza del sistema de la CE. NOTA: J Conductaes el procedimiento por lo menos una vez a la semana con el fin de evitar la fuga de corriente eléctrica derivada de la acumulación de polvo y escombros. Sin embargo, dependiendo de la aplicación (por ejemplo, el uso de un BGE con el aumento de la viscosidad o con alta concentración de sal, las muestras con un aumento de viscosidad) electrodos y palancas de apertura puede requerir ser limpiado más frecuentemente para evitar la contaminación cruzada y el arrastre de muestra. <ol><li> Apague el interruptor de alimentación del instrumento CE y abrir la puerta principal. </li><li> Limpiar la superficie de la cubierta de la muestra, la muestra que contiene el sistema (tampón de muestra y bandejas), cubierta del cartucho, la barra de sujeción, bloque de interfaz y los electrodos con un material no tejido humedecido en agua y limpie. Repita el procedimiento con una mezcla de etanol-humedecido limpie y seque antes de su uso. </li><li> Enjuagar las palancas de apertura a fondo con agua. Limpiar su superficie con un trapo no tejido. Repita el procedimiento con una mezcla de etanol-humedecido limpie y seque antes de la instalación. </li><li> Limpiar los dos extremos del cable de fibra óptica cuidadoly con un paño de microfibra humedecido en agua. Repita el procedimiento con un paño humedecido con etanol. </li></ol></li><li> El conjunto de cartucho. <ol><li> Retirar un nuevo capilar neutro (50 micras de diámetro interno) de su envoltorio. </li><li> Pegue un extremo del tubo de protección capilar a la mesa de trabajo. Uncoil, enderezar y tire de la capilaridad hacia fuera del tubo. </li><li> Stick un trozo de cinta o papel para la mesa de trabajo y añadir marcas de medición de la siguiente manera: longitud al detector (30 cm), ventana capilar (0,2 cm) y la longitud al extremo de salida (10 cm) (es decir, longitud 40,2 cm total 30,0 cm de longitud efectiva). </li><li> Alinear la ventana capilar hasta la marca de medición de 0,2 cm en el documento de referencia. Fijar el capilar con cinta y marcar el capilar final: 2 mm fuera de las marcas de medición. </li><li> Cortar la tapa de protección en el extremo de entrada capilar (el extremo más alejado de la ventana) en un solo movimiento lineal utilizando el borde a ras de la piedra de escisión.<ol><li> Sumergir el extremo capilar en un vial tapado universales lleno de agua a fin de evitar daños permanentes en el revestimiento interno capilar. Repita este procedimiento cada vez que el extremo capilar se expone al ambiente durante más de 1 min. </li></ol></li><li> Insertar el extremo de entrada capilar en el lado de salida del cartucho. </li><li> Empujar y tirar del capilar a través del cartucho como sea necesario hasta que la ventana está centrada capilar a la ventana cartucho. </li><li> Inserte la clavija del orificio (100 micras x 200 micras) en la ventana del cartucho. NOTA: Confirme que la luz blanca pasa a través de la ventana cuando se expone a una fuente de luz blanca. Si la luz que pasa a través de tiene una apariencia de color marrón, realice los ajustes necesarios. </li><li> Insertar el capilar en el tubo de refrigerante preformada para una longitud total de 40,2 cm capilar (con la tuerca de la tubería pre-instalado, casquillo y la junta tórica en ambos extremos en ese orden). </li><li> Empuje el capilar a través de la coolant tubo como sea necesario hasta que el capilar aparece en el otro lado de la tubería. </li><li> Insertar el extremo del tubo de refrigerante en el lado de salida del cartucho y apretar la tuerca de la tubería. </li><li> Insertar el extremo de entrada capilar en el lado de entrada del cartucho. </li><li> Empuje y tire del capilar a través del cartucho según sea necesario hasta que el capilar aparece en el lado de entrada del cartucho. </li><li> Insertar el extremo del tubo de refrigerante en el lado de entrada del cartucho y apretar la tuerca de la tubería. </li><li> Cortar la tapa de protección en el extremo de salida capilar (el extremo más cercano de la ventana) en un solo movimiento lineal utilizando el borde a ras de la piedra de escisión. </li><li> Inserte los clips de foca-retención sobre los extremos de los capilares y presione hasta que encaje en su posición. inspeccionar visualmente los extremos del capilar. Si no lo son, incluso, repita el procedimiento. </li><li> Coloque la plantilla capilar de longitud en el borde de la mesa de trabajo. </li><li> Coloque el cartucho hacia abajo against la plantilla capilar de longitud y alinear el capilar termina con las líneas de referencia en la plantilla. Si las marcas de medición capilar (véase 3.2.4) no se alinean con las líneas de referencia, realice los ajustes necesarios. </li><li> Mantenga el capilar contra la plantilla capilar de longitud y corte ambos extremos del capilar utilizando el borde a ras de la escisión de piedra 2 mm por debajo de las líneas de referencia de la plantilla. </li><li> inspeccionar visualmente el capilar termina con una lupa. Si extremos de los capilares no son lisas, bruñido utilizando la cara suave de la piedra de escisión. </li><li> Inserte la junta tórica abertura en el orificio del tapón de apertura utilizando la herramienta de inserción junta tórica. </li><li> Instalar viales tapados universales llenas de agua en la vaina del cartucho y el cartucho lugar en caso inmediatamente con extremos capilares insertados en viales. Para el almacenamiento a corto y largo plazo, mantener a 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de bandejas de amortiguamiento. <ol><li> Llenar y colocar tapados universAL viales en la entrada de la memoria intermedia y bandejas de salida (Figura 1). posiciones de los viales de repetición en los carriles 2, 3, 4 y 5 de acuerdo con el número de muestras a analizar, la colocación de un carril por cada seis inyecciones de muestra. NOTA: no mojar los tapones de los viales con el fin de evitar la fuga de corriente. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Figura 1: Posición y el nivel de llenado de viales universales en las bandejas de entrada y de salida de amortiguación. Llenar los niveles: 1/1 = 1.400 l, 3/4 = 1.300 l y 1/2 = 1000 l. Abreviaturas: W = agua, HCl = ácido clorhídrico 0,1 M. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> Sistema de montaje de componentes del CE. <ol><li> Instalar el detector de UV. </li><li> Instalar la palanca de aperturapresionando hacia arriba en el bloque de interfaz. </li><li> Instalar el cable de fibra óptica. Inserte el extremo correspondiente a la barra de sujeción y, manteniendo ambos extremos, gire hacia la derecha. Conectar el otro extremo al detector UV. NOTA: Maneje el cable de fibra óptica con cuidado durante este procedimiento, ya que podría causar la flexión de su fractura. </li><li> Coloque la muestra y las bandejas de amortiguamiento en el sistema de retención de la muestra y encajen en su posición. </li><li> Coloque el cartucho capilar en el bloque de interfaz y, mientras presiona la barra de sujeción en ambos extremos, apretar los botones. </li></ol></li></ol> 4. Métodos de configuración del instrumento <ol><li> Crear el acondicionamiento, el funcionamiento y los métodos de instrumentos de apagado de acuerdo con los siguientes parámetros y en la Tabla 1: Tensión, max: 30,0 kV; Actual, máxima: 300,0 mu; Cartucho de temperatura: 20.0 ° C; temperatura de almacenamiento de la muestra: 10,0 ° C; detector UV condiciones iniciales: Longitud de onda: 214 nm; Velocidad de datos: 4 Hz; Filtro: normal; anchura del pico (Puntos): 16-25; señal de absorbancia: Directo. NOTA: velocidad de adquisición de datos se puede aumentar hasta 25 Hz con el fin de mejorar la cobertura de zonas de separación estrechos. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> programa de tiempo método acondicionado </td></tr><tr><td> Tiempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valor </td><td> Duración </td><td> vial de entrada </td><td> vial de salida </td><td> Resumen </td><td> comentarios </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante </td> &lt;td&gt; Agua </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Separada - Tensión </td><td> 15.0 KV </td><td> 10,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa Min, polaridad normal </td><td> Separar </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2758 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> Espere </td><td> - </td><td> 0.0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> consejos de enjuague </td></tr><tr><td colspan="8"> Ejecución del programa de tiempo método </td></tr><tr><td> Tiempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valor </td><td> Duración </td><td> vial de entrada </td><td&gt; vial Outlet </td><td> Resumen </td><td> comentarios </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante, Entrada / Salida inc vial 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante, Entrada / Salida inc 6 vial </td><td> Agua </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante, Entrada / Salida inc vial 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Inyectar - Presión </td><td> 34 mbar </td><td> 20.0 seg </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Anular, Adelante </td><td> inyección de la muestra </td></tr><tr><td> - </td><td> Espere </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> Entrada / Salida inc vial 6 </td><td> consejos de lavado </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Separada - Tensión </td><td> 15.0 KV </td><td> 30,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa mínima, polaridad normal, de entrada / salida inc vial 6 </td><td> La separación de la muestra </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> Cero automático </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> Deja de datos </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adelante, Entrada / Salida inc vial 6 </td><td> Agua </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> Espere </td><td> - </td><td> 0.0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> Entrada / Salida inc vial 6 </td><td> consejos de enjuague </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> Fin </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Fin </td></tr><tr><td colspan="8"> programa de tiempo método shutdown </td></tr><tr><td> Tiempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valor </td><td> Duración </td><td> vial de entrada </td><td> vial de salida </td><td> Resumen </td><td> comentarios </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> Adelante </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjuague - Presión </td><td> 2068 mbar </td><td> 6,0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> Adelante </td><td> Agua </td></tr><tr><td> - </td><td> Lámpara - Off </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Espere </td><td> - </td><td> 0.0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> consejos de enjuague </td></tr></tbody></table> Tabla 1: acondicionado, correr y programas de tiempo de apagado. 5. Adquisición de Datos y Procesamiento <ol><li> Programar el conjunto de la muestra. <ol><li> Programar el capilar para el acondicionamiento usando el método acondicionado instrumento. Cuando el capilar se utiliza por primera vez, el programa de cuatro repeticiones; de lo contrario programar sólo dos repeticiones del método acondicionado. </li><li> Programar las muestras a ser analizadas utilizando el método de funcionamiento del instrumento. </li><li> Programar el capilar de almacenamiento mediante el método de apagado del instrumento y repita el procedimiento indicado en el apartado 3.2.22. </li></ol></li><li> Ejecutar el experimento. </li><li> Exportar la electropherograms. </li><li> Calcular el tiempo de migración y el contenido porcentual de, un principal básicond isoformas ácidas usando integración de la línea de caída vertical del perfil de electroferograma. </li></ol>

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

Los autores Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz y Emilio Medina-Rivero son empleados de Probiomed S.A. de C.V., que desarrolla, fabrica y comercializa productos biosimilares. Todos los autores están involucrados en el desarrollo de productos biosimilares para Probiomed.

En este tutorial, destacamos la importancia de las prácticas adecuadas cuando se realizan los análisis de CZE de anticuerpos monoclonales con el fin de aumentar la probabilidad de tener éxito. Sin embargo, cuando se utiliza CZE de forma rutinaria, los problemas surgen inevitablemente 12. Para obtener los mejores resultados, es importante seguir las notas que se incluyeron durante todo el protocolo, ya que ayudarán al analista para superar y resolver problemas de pasos difíciles. U...

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son proteínas bioterapéuticos con creciente interés debido a su capacidad para actuar contra varias enfermedades crónicas y degenerativas 1. Al igual que otras biomoléculas, mAbs son propensos a someterse a varias modificaciones fisicoquímicas en todas las etapas de su ciclo de vida (es decir, desde la biosíntesis en el producto final). Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a: la desamidación, glicosilación, oxidación, ciclación, isomerización, la agregación y la escisión proteolítica 2. Por lo tanto, se necesitan técnicas analíticas capaces de resolver isoformas intrínsecas para supervisar mAbs heterogeneidad y la estabilidad con el fin de establecer las especificaciones de calidad. La electroforesis capilar (CE) es una tecnología de separación de alto rendimiento realizado outinside de un tubo de sílice fundida estrecho (rango de micras) lleno de un electrolito de fondo (BGE). Tras la aplicación de un campo eléctrico (hasta 30,000 V), molécula cargadas migran hacia el electrodo con carga opuesta (es decir, la separación electro-driven). El uso de altas tensiones en CE permite análisis rápidos y aumento de la eficiencia, que son superiores a electroforesis en gel clásico. Electroforesis de zona capilar (CZE) es una técnica basada en la CE se utiliza rutinariamente en la industria biofarmacéutica para la evaluación de la calidad del producto 3-9. A diferencia de otros modos de CE (por ejemplo, electroforesis en gel capilar, isoeléctrico capilar de enfoque) o métodos basados en la cromatografía, CZE puede llevarse a cabo sin el uso de desnaturalizantes o interfaces en fase sólida, lo que permite el análisis de la heterogeneidad inherente de mAbs cerca de su estado nativo 10 . Separación CZE de isoformas de mAb se produce en el interior de un capilar de sílice fundida cubierto con un polímero hidrófilo (capilar neutro) y se basa en su movilidad electroforética diferente, que es gobernado por la carga, la masa, el tamaño y la forma (o volumen hidrodinámico) 11. restos de mAb se detectan cuandose movilizan y pasan a través de la ventana de detección, que es detectado por un detector de ultravioleta (UV) de la absorbancia a 214 nm 4. La implementación exitosa de esta técnica analítica dependerá de la debida atención a los detalles antes y durante el experimento. Actuar de otra manera se incrementará el costo y el tiempo para llevar a cabo el análisis, en última instancia conduce a la insuficiencia constante y frustración. A continuación, presentamos una guía paso a paso para llevar a cabo un análisis exitoso de mAb heterogeneidad mediante CZE través de la explicación detallada de la preparación de soluciones y muestras, la preparación del sistema de la CE, los métodos de instrumentos creados, la adquisición de datos, y el procesamiento. Para el propósito de este tutorial, un factor de necrosis antitumoral recombinante alfa totalmente humano (anti-TNF) mAb se utiliza como modelo de proteína; Sin embargo, este protocolo se puede personalizar fácilmente para el análisis de otras proteínas considerando breves modificaciones. UNdicionalmente, una serie de recomendaciones para mitigar los posibles problemas se proponen. Se invita al lector a seguir estrictamente el protocolo propuesto, como la probabilidad de tener éxito se incrementará.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico de grado ACS</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de histamina</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr> <tr><td>(Hidroxipropil) metilcelulosa&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-aminocaproico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tampón Tris, 50,0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Sistema de análisis farmacéutico</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Capilar neutro&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>vial, micro, 200 y micro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de viales universales</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Viales universales</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Cable, óptica, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>Módulo detector UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>Kit</td> de montaje de cartucho 144733<td></td></tr><tr><td>, en blanco</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

electroforesis capilar la separación del anticuerpo monoclonal isoformas el uso de un capilar neutral

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Las proteínas bioterapéuticas, como los anticuerpos monoclonales (mAbs), son alternativas viables para el tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas. La actividad biológica de estas proteínas depende de sus propiedades fisicoquímicas. Se ha descrito el uso de técnicas de alta rendimiento como la cromatografía y la electroforesis capilar para el análisis de la heterogeneidad fisicoquímica de los mAbs. Hoy en día, la técnica de electroforesis de zona capilar (CZE) constituye uno de los ensayos más resolutivos y sensibles para el análisis de biomoléculas. Además, la separación electroaccionada en CZE está gobernada por extensas propiedades de la materia y ofrece la ventaja de analizar proteínas cerca de su estado nativo. Sin embargo, la implementación exitosa de esta técnica para el análisis de rutina depende de las habilidades del analista en los pasos críticos durante la preparación de muestras y sistemas. El propósito de este tutorial es detallar los pasos para tener éxito en el análisis CZE de mAbs. Además, este protocolo se puede utilizar para el desarrollo y la mejora de las habilidades del personal involucrado en los laboratorios de química analítica de proteínas.

La Figura 2 muestra el perfil de corriente eléctrica típica de un EACA 200 mM, acetato de litio 30 mM, pH 4,8 BGE con muestra de anti-TNFa mAb diluido con tampón de Tris (50 mM, pH 8,0). Como se puede observar, la corriente es estable durante todo el análisis y puede oscilar entre los valores de 30 a 35 mu. Figura 3 muestra el electroferograma CZE de una muestra en blanco en el que el pico detectado se corresponde con el patrón interno de histamina. Se e...

Aquí, presentamos un protocolo completo de electroforesis de zona capilar para la evaluación de la heterogeneidad fisicoquímica intrínseca de los anticuerpos monoclonales como un atributo de calidad.

Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

En la actualidad, la técnica de electroforesis capilar de células constituye uno de los métodos más resolutivos y sensibles para el análisis de biomoléculas como los anticuerpos monoclonales. Sin embargo, la implementación exitosa de esta técnica depende del conocimiento y de las habilidades del analista en las etapas críticas durante la preparación de las muestras y del sistema. Este tutorial tiene como objetivo explicar cómo realizar un análisis exitoso, con una descripción verdaderamente detallada de la preparación de soluciones y muestras, la preparación del sistema de electroforesis capilar, la configuración del método en los instrumentos, y la toma de decisiones y el procesamiento de datos.En general, este protocolo puede utilizarse para el desarrollo y mejora de las habilidades del personal implicado en la preparación de laboratorios de química analítica. Pese la cantidad de HPMC para obtener una concentración final de 0,05 por ciento en 100 mililitros. Dado que el HPMC es un polímero elástico básico, como primer paso vierta el polvo en un vaso de precipitados de vidrio y agregue lentamente 80 mililitros de agua para desagregar el polvo.Luego, enjuague la bandeja de humectac

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe una técnica de cromatografía de afinidad para purificar anticuerpos monoclonales 2F5 utilizando los ligandos DsRed-2F5-Epitope o DFE. Los anticuerpos monoclonales 2F5 purificados son fármacos esenciales en inmunoterapia.

Cromatografía de afinidad basada en DFE: una técnica para la purificación de anticuerpos monoclonales 2F5 a partir de una muestra cruda utilizando condiciones de elución basadas en alta fuerza iónica

Este video muestra una técnica para purificar anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo obtenido de un cultivo celular productor de anticuerpos. El proceso implica el uso de una matriz de perlas de agarosa reticuladas con proteína A conjugada, que inmoviliza los anticuerpos en el sobrenadante de las perlas, lo que permite una separación efectiva de los contaminantes. Al aplicar un tampón de elución con pH bajo, se afloja la interacción proteína-anticuerpo, lo que facilita la...

Una técnica de cromatografía de afinidad para la purificación de anticuerpos monoclonales

Este video muestra un protocolo de inmunoensayo de electroforesis capilar para detectar un biomarcador de proteínas asociado con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) a partir de plaquetas de la sangre humana. La confirmación de la presencia de la proteína biomarcador de ELA se logra mediante la separación basada en el tamaño de las proteínas plaquetarias seguida de una detección quimioluminiscente.

Un inmunoensayo de electroforesis capilar para la detección de biomarcadores de proteínas

Se demuestra un inmunoensayo de capilar usando una plataforma comercial para medir las proteínas blanco de preparaciones de proteínas totales. Además, parámetros de ensayo del tiempo de exposición, concentración y dilución de anticuerpo están optimizados para un sistema de modelo de cultivo celular.

Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.

Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Se ha descrito un protocolo detallado para la purificación y posterior análisis posterior de un anticuerpo monoclonal a partir del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF) de microbiorreactores automatizados. También se presenta el uso de análisis para determinar los atributos de calidad críticos (CQA) y maximizar el volumen de muestra limitado para extraer información vital.

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Se presenta un protocolo para perfiles metabólicos de muestras biológicas mediante electroforesis capilar de espectrometría de masas utilizando un diseño de interfaz de punta porosa sheathless.

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

Este artículo describe un protocolo simple y rápido para evaluar el estado oligomérico de la proteína GTPasa MxA similar a la dinamina a partir de lisados de células humanas utilizando una combinación de PAGE no desnaturalizante con análisis de Western blot.

Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

Este protocolo describe la producción de un anticuerpo terapéutico en un sistema de expresión de mamífero. Los métodos descritos incluyen la preparación del ADN del vector, transfección estable y la adaptación libre de suero de una línea celular de riñón embrionario humano 293, puesta en marcha de cultivos a gran escala y la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Aprenda electroforesis capilar para analizar anticuerpos monoclonales usando un capilar neutro. Este protocolo mejora las habilidades analíticas del personal de laboratorio en química analítica.

Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral

Explorar más videos