Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

El objetivo general de este procedimiento es determinar el tratamiento efectivo sobre la morfología de las neuronas dentro del cerebro de roedor. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la morfología normal y manipulada experimentalmente de las neuronas dentro de varias regiones del cerebro de los roedores. Esta técnica tiene la ventaja principal de aumentar la probabilidad de identificar y visualizar neuronas marcadas que están completamente contenidas dentro de muestras histológicas individuales.

Comience la tinción de Golgi-Cox colocando un cerebro de ratón fresco en un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros que contenga 17 mililitros de solución de Golgi-Cox. Proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 25 días. Una vez transcurrido el período de incubación, Cryo protege el cerebro colocándolo en 40 mililitros de crioprotector de sacarosa, e incuba en la oscuridad a 4 grados centígrados durante 24 horas.

Después de la incubación en sacarosa, el cerebro se puede congelar para su almacenamiento a largo plazo, o bloquearse inmediatamente para seccionarlo, como se muestra en la siguiente sección del video. Si se congela, sumerja todo el cerebro en 200 mililitros de isopentano que se ha preenfriado en hielo seco. A continuación, coloque el cerebro congelado en un tubo cónico de 50 mililitros y guárdelo en la oscuridad a menos 80 grados centígrados.

Para empezar, retira el cerebro de la sacarosa. Y use una hoja de afeitar para bloquearlo y seccionarlo cortando el cerebelo, dejando un borde plano en el extremo caudal restante del cerebro. El cerebro debe estar bloqueado en un ángulo preciso para asegurar que las neuronas de interés estén completamente contenidas dentro de las secciones resultantes.

Por ejemplo, usamos un plano coronal que es perfectamente perpendicular al eje caudal rostral para las neuronas piramidales de la corteza cerebral. A continuación, calienta el agar hasta que se derrita. Y déjalo enfriar hasta que esté ligeramente por encima de su punto de fusión.

A continuación, coloque el cerebro en un pequeño plato de pesaje desechable con el extremo caudal hacia abajo. Agregue agar derretido para cubrir el cerebro. Una vez que el agar se haya solidificado, recorte el exceso dejando aproximadamente de dos a cuatro mililitros alrededor del cerebro.

A continuación, utiliza una pequeña cantidad de cianoacrilato de etilo para pegar el cerebro a la etapa de un vibratomo con el extremo caudal hacia abajo. Llene el área de la etapa del vibratomo con suficiente crioprotector de sacarosa para cubrir el cerebro. A continuación, corte el cerebro en un grosor de corte de 400 a 500 micras, dependiendo de la región del cerebro que se vaya a examinar.

Con un pincel pequeño, coloque las secciones de cerebro en los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos que contenga inserciones de fondo de malla y esté precargada con tampón de fosfato M de sacarosa. Proteger de la luz durante el corte. Cuando termine de seccionar, incube las secciones en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche.

Usando los insertos inferiores de malla, transfiera las secciones del cerebro a un nuevo pozo que contenga cinco mililitros de paraformaldehído en tampón de fosfato. Incubar en un balancín moviéndose a baja velocidad a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Lave las secciones dos veces transfiriéndolas a pozos nuevos que contengan cinco mililitros de agua.

Proteger de la luz y lavar a velocidad moderada a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, transfiera las secciones a un nuevo pozo que contenga cinco mililitros de hidróxido de amonio. Mece lentamente en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Lave las secciones dos veces transfiriéndolas a pozos nuevos que contengan cinco mililitros de agua. Lavar en un balancín moviéndose a velocidad moderada en la oscuridad a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera las secciones a un nuevo pocillo que contenga cinco mililitros de fijador diluido A. Incube en un balancín moviéndose a baja velocidad en la oscuridad a temperatura ambiente durante 25 minutos.

Lave las secciones en agua dos veces como antes. Use un pincel pequeño para colocar las secciones en un portaobjetos de microscopio, luego use pinzas y un pañuelo pequeño para eliminar el exceso de agua y agar. Asegúrese de eliminar todo el agar antes de continuar con los pasos de deshidratación.

Deje que las secciones se sequen al aire a temperatura ambiente, protegidas de la luz. El tiempo de secado adecuado es crítico y debe determinarse para cada laboratorio. Un tiempo demasiado corto puede hacer que las secciones se caigan de los portaobjetos durante las etapas de deshidratación, y un tiempo demasiado largo puede provocar que las secciones se agrieten.

Después del secado, primero coloque los portaobjetos en el agente limpiador durante cinco minutos. Coloque los portaobjetos en etanol al 100% durante cinco minutos. A continuación, muévase a través de una serie de concentraciones decrecientes de etanol durante dos minutos cada una.

Después de la serie de alcohol, coloque los portaobjetos en agua durante cinco minutos. A continuación, teñir con violeta de cresilo al 0,5% en agua durante siete minutos. Después de la mancha violeta cresyl, coloque los portaobjetos en agua durante dos minutos.

A continuación, deshidratar las secciones a través de una serie de concentraciones crecientes de alcohol durante dos minutos cada una. A continuación, dos lavados en etanol al 100% durante cinco minutos. Coloque en el agente de compensación durante cinco minutos.

Finalmente, agregue un medio de montaje anhidro y coloque un cubreobjetos sobre las secciones. Deje que los portaobjetos se sequen horizontalmente en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos cinco días. Para capturar pilas de imágenes de alta resolución del área que contiene la neurona de interés, primero seleccione un objetivo de inmersión en aceite de silicona 30X 1.05 NA en el microscopio.

A continuación, aplique de tres a cuatro gotas de aceite de inmersión de silicona en el portaobjetos. Coloque el objetivo sobre la corredera, asegurando el contacto entre el objetivo y el aceite. Enfoque la imagen y ajuste la configuración de la cámara, incluida la exposición y el balance de blancos en el software de imagen.

A continuación, establezca los límites superior e inferior de la pila de imágenes centrándose en la parte superior de la sección y, a continuación, seleccionando establecer junto a la parte superior de la pila dentro de la ventana de adquisición de imágenes. A continuación, concéntrese en la parte inferior de la sección y seleccione establecer junto a la parte inferior de la pila. Establezca la distancia de paso a una micra introduciendo una micra junto a la distancia entre imágenes dentro de la ventana de adquisición de imágenes.

Por último, capture la pila de imágenes seleccionando adquirir pila de imágenes dentro de la ventana de adquisición de imágenes. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superpongan al menos un 10% en los ejes X e Y. Esta imagen de la corteza cerebral es una proyección Z fusionada de pilas de imágenes adquiridas de una sección de 500 micras de espesor utilizando un objetivo 10X.

El tejido de esta imagen se procesó utilizando el protocolo principal de productos frescos. El área indicada por el cuadrado rojo se fotografió utilizando un objetivo de inmersión en aceite de silicio 30X y se adquirió una pila de imágenes de proyección Z fusionada de mayor resolución. La flecha roja muestra la proyección Z bidimensional de una neurona que se trazó a partir de la pila de imágenes 30X de alta resolución.

En este caso, se utilizó la variante de protocolo fresco con tinción con violeta de cresilo. Esta imagen de mayor resolución muestra la sección teñida de violeta cresyl. Y este es el trazado neuronal obtenido.

Finalmente, este tejido se procesó utilizando la variante del protocolo en la que los cerebros se congelan después de la impregnación de Golgi-Cox. Aquí, el tejido previamente congelado se ve con mayor resolución. Y una vez más se obtiene una proyección Z bidimensional de alta calidad del trazado de neuronas.

Esta técnica se puede completar en un mes y los pasos de procesamiento e imagen se completan en la última semana. Alternativamente, los cerebros se pueden congelar después de la impregnación de Golgi-Cox, lo que permite que el procesamiento y la obtención de imágenes se completen en una fecha posterior. Siguiendo este procedimiento, los neurocientíficos pueden utilizar las imágenes capturadas para realizar análisis morfológicos detallados, como la complejidad de las dendritas o la densidad de la columna vertebral, con el fin de determinar cómo una manipulación experimental puede alterar la estructura de las neuronas dentro del cerebro.