Name: A largo plazo de imágenes en vivo Drosophila Disco de ojos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda a realizar imágenes en vivo de larga duración de discos imaginales de Drosophila para estudiar la diferenciación de fotorreceptores y la rotación ommatidial. Este método permite observar procesos celulares dinámicos durante 10 horas.

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Estamos muy agradecidos a Chun-lan Hsu y Yu-Chi Yang para la preparación de la comida marcha y el mantenimiento de las poblaciones de moscas, y para Su-Ping Lee y el IMB Imaging Core por su ayuda con la microscopía confocal. Este estudio fue apoyado por becas a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102 a 2321-B-001 -002, MOST 103 a 2311-B-001 -035 -MY3) del Consejo Nacional de Ciencia y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República de China.

Configuración 1. Pre-experimental <ol><li> Recoger un huevo de mosca que expresa la proteína verde fluorescente nuclear (GFP) bajo mδ0.5-Gal4 y de cultivo a 25 ° C durante 5 días. </li><li> Microondas 0,7 g de bajo punto de fusión de agarosa en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) hasta que la agarosa se disuelva completamente. Mantener el gel bajo punto de fusión 0,7% en una incubadora a 37 ° hasta su uso. </li><li> Esterilizar todo el equipo, incluyendo fórceps, tijeras, 42 mm cubreobjetos x 0,17 mm, una placa de punto de vidrio 9-bien, y una cámara de cultivo magnético, con 70% de etanol durante más de 12 h. </li><li> Preparar el medio de cultivo 3: medio Drosophila de Schneider suplementado con 2% de suero bovino fetal (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina y 1,25 mg / ml de insulina. Para evitar la contaminación, preparar el medio en una campana de cultivo de células. Almacenar el medio de cultivo preparado a 4 ° C y se utiliza dentro de un mes. </li><li> Limpiar la plataforma de disección y el experimentador&#39;s manos con etanol al 70% antes de comenzar la disección. </li></ol> Disección 2. Disco <ol><li> Aire seco en todo el equipo de 70% de etanol. </li><li> Seleccione una larva de tercer estadio de un vial mosca. Para evitar la contaminación del vial mosca, lavar la larva en 1x PBS 3x para eliminar los residuos. </li><li> Diseccionar la larva limpiado en 1 ml de medio de cultivo (a temperatura ambiente) en la placa de punto de vidrio 9-bien bajo un microscopio de disección. </li><li> Agarre la larva con un par de pinzas en alrededor de un tercio de la distancia desde el extremo posterior y otros fórceps en el gancho de la boca. Tire de las dos pinzas en direcciones opuestas para liberar los tejidos internos. <ol><li> Retire las glándulas salivales, la grasa corporal, y la cutícula del complejo ojo-cerebro en el gancho de la boca. Si el cordón nervioso ventral está todavía conectado, se corta con tijeras. </li></ol></li><li> Utilice un par de pinzas para agarrar el gancho de la boca y un par de fórceps para retirar una pieza de tejido que connects los cerebros y discos de los ojos en la parte dorsal. NOTA: Si no se elimina este tejido, los dos discos de ojo-antenal estarán cerca uno del otro y el cerebro. Los discos de los ojos entonces no estar planos sobre el cubreobjetos porque este tejido, el cerebro, y el disco de ojo-antenal formarán un triángulo. </li><li> Girar todo el complejo a una posición ventral hacia arriba. Retire el filamento que conecta el gancho o el disco al cerebro. NOTA: Si no se elimina el filamento, el disco ojo-antenal se dividirá en dos piezas cuando se retira el gancho de la boca. <ol><li> Retire el gancho de la boca. Tenga cuidado de no dañar el ojo de disco durante el proceso. NOTA: El disco ojo es ahora libre en el medio y sólo conectado a cerebro por el tallo óptico. </li></ol></li></ol> 3. montaje <ol><li> Aire seco y montar los componentes de la cámara con un 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos. Adjuntar una doble capa de juntas tóricas para el centro de la hoja de la cubierta para mantener ºe agarosa. </li><li> Montar la cámara con cubreobjetos. Ponga la 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos sobre el aceptor etapa. Coloque la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. Coloque la base. Bloquear el armario de sellado y colocar la cubierta (Figura 1). </li><li> transferir cuidadosamente el complejo ojo-cerebro diseccionado al centro de la junta tórica usando una micropipeta 20! l con una punta de 10-200 l. </li><li> Eliminar la mayor parte del medio y añadir 12 l de 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión (a 37 ° C) a la muestra. NOTA: La posición del ojo de disco puede ser cambiada con unas pinzas antes de la solidificación de la agarosa. La agarosa se solidificará dentro de 5 min. <ol><li> Añadir 1 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente al centro de la junta tórica; cada junta tórica puede cargar hasta 4 muestras. Asegúrese de que la agarosa se pega a la junta tórica para evitar la deriva de la muestra. NOTA: No se aireación o circulación del medio es necesario. </li></ol></li></ol>4. Microscopía Confocal <ol><li> Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar la temperatura. Esto puede evitar que la deriva del eje Z durante la formación de imágenes. </li><li> Antes de imágenes en vivo a largo plazo, puede comprobar si el tejido está intacto por diferencial microscopía de contraste de interferencia. </li><li> Para evitar la fototoxicidad, utilice una fuente de láser por debajo de 2 mW. Utilice un objetivo de 40X para la imagen. </li><li> Adquirir 62 micras imágenes Z en pila en 12 min en un intervalo óptico de 1 m. Adquirir 40 ciclos de exploraciones en un total de 10 h. Asegúrese de que cada ciclo contiene 12 min de formación de imágenes y 3 min de reposo. </li></ol>

<ol><li>Cohen, S. M. Imaginal disc development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).</li>
<li>Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744(2016).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Development of Drosophila Melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).</li>
<li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li>
<li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li>
<li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li>
<li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK%2FPnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe%2FAF6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li>
<li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li>
<li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li>
<li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li>
<li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li>
<li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este estudio, proporcionar un protocolo detallado para un experimento de imágenes en vivo a largo plazo en los discos imaginales de Drosophila. Pasamos mucho tiempo practicando la disección cuidadosa para evitar el daño del disco y para permitir la fijación del disco cerca de los cubreobjetos. Tratamos de poli-L-lisina (PLL) y bajo punto de fusión de agarosa para mantener el tejido; al final, la agarosa de bajo punto de fusión mostró una mejor capacidad para mantener el tejido. Aunque se usó sólo el ojo disco en el presente documento para demostrar la ocurrencia normal de la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial durante el período de formación de imágenes en vivo 10 h, este método también se puede aplicar a al menos otro disco, el disco del ala, como se demuestra en una 3 estudio previo. Por otra parte, la preparación de medio de cultivo y la configuración de imágenes en vivo son simples y no requieren aireación o circulación del medio. imágenes en vivo continua puede proporcionar una clara secuencia temporal de la víspera biológicaNTS. En nuestro informe anterior de la diferenciación de células gliales y la migración en el ojo de disco, hemos proporcionado una prueba directa de que la glía envolver diferencian de glía existente después de migrar a la parte anterior del ojo disco 3. Cultivo a largo plazo ex vivo permite el etiquetado por láser activado específica de células, como la foto-conversión de la proteína fluorescente KAEDE, a seguir sus comportamientos 3. También puede acomodar el ensayo de productos químicos que se añaden directamente al medio de cultivo; Por lo tanto, se puede utilizar como una plataforma de cribado de fármacos. Dado que algunos proceso dinámico se produce en cuestión de minutos o segundos, se requiere una alta resolución temporal. Para mejorar la resolución temporal, microscopía de lámina de luz 15, 16 o girando la microscopía disco 17 puede ser una buena opción. La condición de la cultura actual no es perfecto. No es compatible con el crecimiento del disco. p celularroliferation sólo se admite para un máximo de 12 h 3. Después de 12 h en cultivo ex vivo, la tasa de diferenciación de los fotorreceptores comienza a disminuir 3. Esto puede ser debido a la falta de ciertos nutrientes u hormonas. Dado que la principal diferencia en este medio de cultivo es la alta concentración de la insulina, la insulina de mamífero puede ser parcialmente imitando la función de los péptidos endógenos similares a la insulina. La adición de extracto de mosca, el insecto trehalosa azúcar en la sangre, y diversas concentraciones de la hormona de la muda 20 hidroxiecdisona, no fueron beneficiosos 3. Sin embargo, el periodo de cultivo de 12-18 h es suficiente para estudiar muchos procesos de desarrollo. Métodos de cultivo alternativos para el cultivo de discos imaginales larvas se han comparado 3, y nuestra condición de cultivo y de imagen proporciona la ventana de tiempo más largo y claridad para imágenes en vivo. Aunque los discos dentro de larvas vivas y pupas se pueden visualizar directamente18, 19, 20, 21, 22, la ventana de resolución y el tiempo para las observaciones son limitados. Late larvas y pupas discos pueden cultivarse durante mucho tiempo 23, 24, pero los discos se someten a la morfogénesis significativo. Para aprovechar las ventajas de los discos de larvas planas, 2D, nuestro método de cultivo y la imagen es la mejor solución hasta el momento.

Los discos imaginales de Drosophila larvas han sido un sistema experimental favorecido para el estudio de una amplia variedad de mecanismos biológicos. Estos discos se invaginan desde el epitelio embrionario y se convierten en estructuras en forma de saco como construido por dos capas epiteliales, peripodial Epitelio (PE) y el disco adecuada (DP) 1, 2. Las células del disco imaginal proliferan y se diferencian progresivamente durante las etapas de larva y pupa y eventualmente se convierten en las estructuras del cuerpo adulto. Debido a la estructura de dos capas plana y simple de los discos imaginales, que son fáciles de observar cuando disecados de larvas. Sin embargo, a pesar de varios esfuerzos de muchos grupos, los métodos actuales para el cultivo a largo plazo de los discos imaginales no han sido satisfactorios. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo que pueda sostener el desarrollo normal de múltiples discos imaginales para un máximo de 18 horas y que permite obtener imágenes en vivo 3 </sarriba&gt;. El método de cultivo puede apoyar la diferenciación celular y la migración, pero que puede soportar la proliferación celular por sólo 7-12 h y no puede soportar el crecimiento del disco. La principal diferencia en el medio de cultivo es la alta concentración de insulina 3. El método es simple, y no se requiere aireación especial o circulación del medio. Uno de los discos imaginales mejor estudiados es el ojo de disco-antenal. El ojo de Drosophila se construye de aproximadamente 800 ommatidia. Cada ommatidium se compone de ocho células fotorreceptoras (R1-R8). En el disco ojo larval, las células fotorreceptoras diferenciar siguiendo el paso de la morfogenética Surco (MF), que barre a través del disco ojo de posterior a anterior 4, 5. Los fotorreceptores en un ommatidium diferencian en secuencia, comenzando con R8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, y R7 6. El ommatidia en el dorsal y VEmitades ntral del disco ojo se someten a una rotación de 90 ° en direcciones opuestas, lo que resulta en quiralidad opuesta 7, 8. El proceso de rotación se produce en dos etapas: primero, una rotación de 45 ° comienza en y se completa en el sexto ommatidia fila detrás de la MF; la segunda rotación de 45 ° se completa en alrededor de fila 16 9, 10. Este estudio utilizó rotación ommatidial, marcado por el R3 / 4-específica mδ0.5-GA4 11, para demostrar la diferenciación celular normal y la dinámica que puede ser observado a través de este método a la cultura y vivir-imagen del disco ojo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>AMRESCO&nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0,17 mm cubreobjetos&nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medio&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de cultivo&nbsp;</td><td>Sistema</td><td>de cultivo celular PECON</td><td></td> POC-R2</tr><tr><td>40X objetivo</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objetivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cepa de mosca:nls. GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

a largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; drosophila</em&gt; disco de ojos

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Imágenes en vivo ofrece la posibilidad de rastrear continuamente los procesos celulares y de desarrollo dinámicos en tiempo real. Drosophila discos imaginales de larvas se han utilizado para estudiar muchos procesos biológicos, tales como la proliferación celular, la diferenciación, el crecimiento, la migración, la apoptosis, la competencia, la señalización célula-célula, y la formación de límite compartimental. Sin embargo, los métodos para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales no han sido satisfactorios, a pesar de muchos esfuerzos. Recientemente, hemos desarrollado un método para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales para un máximo de 18 h. Además de utilizar una alta concentración de insulina en el medio de cultivo, una agarosa de bajo punto de fusión también se utilizó para incrustar el disco para evitar que la deriva durante el período de formación de imágenes. Este informe utiliza los discos ojo-antenal como un ejemplo. expresión mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 se siguió para demostrar que fotorreceptor differenciación y rotación ommatidial pueden ser observados durante un período de formación de imágenes en vivo 10 h. Este es un protocolo detallado que describe este método simple.

<html> En este ejemplo, los fotorreceptores R3 / R4 se marcaron con mδ0.5-GA4 para monitorizar la diferenciación de los fotorreceptores. mδ0.5-GA4 impulsa fuerte expresión en R4 y la expresión más débil en R3 11, por lo que es un excelente marcador para R3 y R4, así como para el proceso de rotación ommatidial. En la película 1, R3 y R4 se marcaron con GFP. Al comienzo de la 10 h sesión de formación de imágenes en vivo, había 8 filas de grupos ommatidial (Figura 2A y de película 1) y 14 filas de grupos ommatidial en el extremo (Figura 2B). La tasa de diferenciación ommatidial fue de 1,67 h por fila, que está cerca de la velocidad de 1,5-2 h / fila de discos en vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Sobre la base de las posiciones relativas de R3 y R4, rotación ommatidial ocurrió en el disco ex vivo se cultivaron durante de imágenes en vivo (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39;, y B &#39;&#39;). Un clúster sola R3 / R4 se marcó con una esfera blanca en el primer fotograma de la película 2. En el principio, el eje R3 / R4 parece ser perpendicular al ecuador (Figura 2C y Película 2). A continuación, parece girar 15 °, 30 °, y 45 ° en 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;), y 9 (Figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, respectivamente. Estos datos sugieren que este método puede sostener la diferenciación de los fotorreceptores durante la proyección de imagen en directo 10 h. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrama esquemático de conjunto de la cámara. Diagrama esquemático del conjunto de la cámara: (1) Coloque el cubreobjetos unido-O-ring de doble capa en el aceptor etapa. (2) Colocar la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. (3) Colocar la base. (4) Bloquear el armario de sellado. (5) Cargar la muestra en el centro de la junta tórica y coloque la cubierta. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: imágenes en vivo de R3 / R4 Diferenciación y Rotación. R3 / R4 marcado con mδ0.5-Gal4 expresando-forma nuclear GFP durante 10 h de formación de imágenes en vivo. Todas las figuras se capturaron a partir de la película 1. (A) La imagen captada por el principio. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A &quot;) Imagen ampliada del área de la caja a la izquierda ( A &#39; ) y derecha ( A&quot; ). ( B ) Imagen tomada al final del período de 10 h. ( B&#39;-B ) Imagen ampliada del área de la caja de la izquierda ( B &#39; ) y la derecha ( B &quot; ). ( CC &#39;&#39; &#39; ) Un solo par R3 / R4 (marcado con una flecha en A&#39;) se sigue a través del tiempo para mostrar la rotación del par R3 / R4. Barras de escala = 15 μm, 10 μm y 5 μm en A, B y C, respectivamente. Todas las figuras son proyecciones z de intensidad máxima. La escala de tiempo se muestra en h: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Película 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Haga clic aquí para descargar esta película. <img alt="película 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Película 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

El objetivo general de este método es mostrar la imagenología en vivo de discos imaginales, que son sujetos experimentales populares para el estudio de una amplia variedad de fenómenos biológicos, incluyendo la proliferación celular, diferenciación, apoptosis y competencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la morfología celular y la migración en tejidos específicos. La principal ventaja de esta técnica es que la imagenología continua puede mostrar más información que el tejido fijado, como la migración celular.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la disección y el montaje son complicados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la etapa de rotación y transferencia es difícil de aprender, dado que una disección inadecuada da como resultado resoluciones deficientes. Para comenzar el protocolo, desinfecte el equipo con etanol al 70 % y deje que el equipo se seque al aire.A continuación, seleccione una larva de tercer estadio de un frasco de moscas y lave la larva en solución salina tamponada con fosfato 1X, o PBS, para evitar contaminación proveniente del frasco de moscas. Coloque la larva limpia en un mililitro de medio de cultivo a temperatura ambiente en una placa de vidrio con nueve pocillos bajo un microscopio de disección. Sujete la larva con un par de pinzas a un tercio del extremo posterior y, con otra pinza, tome el gancho bucal.Estire los dos fórceps en direcciones opuestas para liberar los tejidos internos. Luego, retire las glándulas salivales, el cuerpo graso y la cutícula del complejo ojo-cerebro unido al gancho bucal. Si aún está unido el cordón nervioso ventral, córtele con tijeras.Utilice un par de pinzas para sujetar el gancho bucal. Utilice el otro par de pinzas para eliminar el tejido que conecta el cerebro y los discos oculares en la región dorsal. A continuación, gire todo el complejo de manera que el lado ventral quede orientado hacia arriba.Retire el filamento que conecta el gancho o el disco al cerebro. Luego, retire el gancho bucal, teniendo cuidado de no dañar el disco ocular durante el proceso. El disco ocular ahora está libre en el medio y solo está conectado al cerebro por el pedúnculo óptico.Coloque una doble capa de anillos O en el centro de un cubreobjetos de 42 milímetros por 0,17 milímetros para sujetar el agarosa. A continuación, arme la cámara con el cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos sobre el receptor del portaobjetos.Luego, coloque la junta tórica de silicona sobre el cubreobjetos. A continuación, coloque la base, asegure el cierre hermético y coloque la tapa. Utilizando una micropipeta de 20 microlitros con una punta de 10 a 200 microlitros, transfiera cuidadosamente el complejo ojo-cerebro disecado al centro de la junta tórica.Retire la mayor parte del medio y agregue 12 microlitros de agarosa al 0,7 % de punto de fusión baja a 37 grados Celsius a la muestra. Incline ligeramente el extremo del agar para que la muestra permanezca cerca de una cubreobjetos y evite que se desprenda. Añada un mililitro de medio de cultivo a temperatura ambiente al centro del anillo O.Asegúrese de que el agarosa esté pegado al anillo O para evitar que la muestra se desplace. Coloque la cámara preparada sobre la platina de un microscopio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar la temperatura. Antes de la adquisición de imágenes en vivo a largo plazo, verifique si el tejido está intacto mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial.Cambie el objetivo a 40x para la adquisición de imágenes. Finalmente, adquiera imágenes de Z-stacks de 62 micrómetros en 12 minutos con un intervalo óptico de un micrómetro. Adquiera 40 ciclos de escaneos durante un total de 10 horas, y asegúrese de que cada ciclo contenga 12 minutos de adquisición de imágenes y tres minutos de reposo.R3 y R4 fueron marcados con GFP. Al comienzo de la sesión de imágenes en vivo de 10 horas, había ocho filas de cúmulos ommatidiales, y al final, 14 filas de cúmulos ommatidiales. Basado en las posiciones relativas de R3 y R4, ocurrió la rotación ommatidial en el disco cultivado ex vivo durante la adquisición de imágenes en vivo.Al principio, el eje R3/R4 parece ser perpendicular al ecuador. Luego, parece rotar 15 grados en tres horas, 30 grados en seis horas y 45 grados en nueve horas, lo que sugiere que este método puede mantener la diferenciación de fotorreceptores durante 10 horas de imagen en vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar adecuadamente el disco ocular de Drosophila y realizar la imagen en vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Se describe una nueva proteína fluorescente roja (RFP) periodista que se expresa específicamente en...

Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila</em

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)El video muestra una técnica de imagen en vivo para estudiar el patrón de ojos en una pupa de Drosophila melanogaster. Los marcadores marcados con proteína fluorescente verde (GFP) permiten la visualización de la organización y diferenciación celular durante la formación de la estructura ocular en desarrollo.

Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

El método de tomate / GFP-FLP / FRT implica la visualización de las células fotorreceptoras de mosaico en Drosophila que viven. Se puede utilizar para seguir destinos celulares de los fotorreceptores individuales en la retina durante días o semanas. Este método es ideal para los estudios de degeneración de la retina y enfermedades neurodegenerativas o el desarrollo de las células fotorreceptoras.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

Aquí, se presenta un protocolo para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo de la pata de Drosophila durante la etapa de pupa, que implica la eliminación completa del pupario. Este protocolo también se puede aplicar a otros tejidos.

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Aprenda a realizar imágenes en vivo de larga duración de discos imaginales de Drosophila para estudiar la diferenciación de fotorreceptores y la rotación ommatidial. Este método permite observar procesos celulares dinámicos durante 10 horas.

A largo plazo de imágenes en vivo

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