A largo plazo de imágenes en vivo Drosophila Disco de ojos

El objetivo general de este método es mostrar la imagen en vivo de discos imaginales, que son sujetos experimentales populares para el estudio de una amplia variedad de fenómenos biológicos, incluida la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la competencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la morfología celular y la migración en tejidos específicos. La principal ventaja de esta técnica es que las imágenes continuas pueden mostrar más información que el tejido fijo, como la migración celular.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la disección y el montaje son difíciles. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la etapa de rotación y transferencia es difícil de aprender porque una disección incorrecta da como resultado resoluciones deficientes. Para comenzar el protocolo, desinfecte el equipo con etanol al 70% y deje que el equipo se seque al aire.

A continuación, seleccione una larva de tercer estadio de un vial para moscas y lave la larva con solución salina tamponada con fosfato 1X, o PBS, para evitar la contaminación del vial de moscas. Coloque la larva limpia en un mililitro de medio de cultivo a temperatura ambiente en una placa de vidrio de nueve pocillos bajo un microscopio de disección. Agarre la larva con un par de pinzas a 1/3 del extremo posterior y, con otra pinza, agarre el gancho bucal.

Tire de las dos pinzas en direcciones opuestas para liberar los tejidos internos. Luego, retire las glándulas salivales, el cuerpo graso y la cutícula del complejo ojo-cerebro unido al gancho bucal. Si el cordón nervioso ventral todavía está unido, córtelo con unas tijeras.

Use un par de pinzas para agarrar el gancho bucal. Use el otro par de pinzas para extraer el tejido que conecta el cerebro y los discos oculares en la región dorsal. A continuación, gire todo el complejo para que el lado ventral quede hacia arriba.

Retira el filamento que conecta el gancho o disco con el cerebro. Luego, retire el gancho bucal, teniendo cuidado de no dañar el disco ocular durante el proceso. El disco ocular ahora está libre en el medio y solo está conectado al cerebro por el tallo óptico.

Coloque una capa doble de juntas tóricas en el centro de un cubreobjetos de 42 milímetros por 0,17 milímetros para sujetar la agarosa. A continuación, ensamble la cámara con el cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos en el aceptador de escenario.

A continuación, coloque la junta tórica de silicona en el cubreobjetos. Luego, coloque la base, bloquee el casillero de sellado y coloque la cubierta. Usando una micropipeta de 20 microlitros con una punta de 10 a 200 microlitros, transfiera cuidadosamente el complejo ojo-cerebro diseccionado al centro de la junta tórica.

Retire la mayor parte del medio y agregue 12 microlitros de agarosa al 0,7% de bajo punto de fusión y 37 grados Celsius a la muestra. Verticalmente el extremo del agar a la muestra puede mantener el tejido cerca de un cubreobjetos y evitar que se desprenda de la muestra. Agregue un mililitro de medio de cultivo a temperatura ambiente en el centro de la junta tórica.

Asegúrese de que la agarosa esté pegada a la junta tórica para evitar que la muestra se desplace. Coloque la cámara preparada en la platina de un microscopio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar la temperatura. Antes de la obtención de imágenes en vivo a largo plazo, verifique si el tejido está intacto mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial.

Cambie el objetivo a 40x para obtener imágenes. Por último, adquiera imágenes de pila Z de 62 micrómetros en 12 minutos a un intervalo óptico de un micrómetro. Adquiera 40 ciclos de exploraciones durante un total de 10 horas y asegúrese de que cada ciclo contenga 12 minutos de imágenes y tres minutos de descanso.

R3 y R4 se marcaron con GFP. Al comienzo de la sesión de imágenes en vivo de 10 horas, había ocho filas de grupos omatidiales y, al final, 14 filas de grupos omatidiales. Sobre la base de las posiciones relativas de R3 y R4, se produjo una rotación omatidial en el disco cultivado ex vivo durante la obtención de imágenes en vivo.

Al principio, el eje R3/R4 parece ser perpendicular al ecuador. Luego, parece rotar 15 grados en tres horas, 30 grados en seis horas y 45 grados en nueve horas, lo que sugiere que este método puede mantener la diferenciación de fotorreceptores durante 10 horas de imágenes en vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar correctamente el disco ocular de Drosophila y realizar la imagen en vivo.