Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

El objetivo general de este experimento es observar los comportamientos de las células durante la progresión del linaje de las células madre neurales a las neuronas o células gliales. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo del neurodesarrollo, como el papel de las divisiones celulares simétricas y asimétricas, el alargamiento del ciclo celular y las tasas de crecimiento celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite la observación del linaje celular durante largos períodos.

Esto permite observar el cambio de la neurogénesis a la génesis glial dentro de un solo linaje y una composición directa de progenitores neuronales y gliales sublineales. Comience extrayendo los cerebros de 5 a 10 embriones e14 en una placa de Petri con medio de disección frío. Use fórceps para extraer cuidadosamente la piel y el cráneo y aislar el cerebro.

Mientras trabaja bajo el microscopio estereoscópico, use pinzas de disección para extirpar las meninges. Luego, divide el telencéfalo por la mitad para separar los hemisferios. Para aislar el telencéfalo dorsolateral, corte a lo largo de la curva dorsomedial y el límite del palio y el subpalio.

Transfiera los telencéfalos dorsolaterales a un tubo de 2 ml con medio de disección en hielo hasta que se disecen todos los cerebros. Después de la microdisección del telencéfalo dorsolateral, coloque el tejido en un tubo cónico de 15 ml. A continuación, centrifugar el tubo que contiene el tejido recogido en medio de disección frío durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y 340 veces G para precipitar el tejido.

Después del centrifugado, retire el sobrenadante con una pipeta y agregue 1 ml de 37 grados centígrados 0,05% de tripsina-EDTA para la digestión química. Incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue 2 ml de medio de proliferación para inhibir la actividad de Trypsim.

A continuación, pula la punta de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un quemador de gas o un mechero bunsen durante unos segundos para estrechar ligeramente la apertura. Asperar FCS para cubrir la punta de la pipeta. A continuación, disocie mecánicamente las células con la pipeta Pasteur pulida al fuego y recubierta con FCS pipeteando hacia arriba y hacia abajo con cuidado para evitar la generación de burbujas.

Centrifugar las células disociadas durante cinco minutos a cuatro grados centígrados a 340 veces G. Retire el sobrenadante con una pipeta, luego agregue un milímetro de medio de proliferación y vuelva a suspender las células con una pipeta. Retire el PBS de la placa pretratada con Poly-D-Lisina. Luego dibuje un signo en la parte inferior de la placa que se pueda usar como referencia para determinar el punto cero.

Después de resuspender las células en el medio de proliferación por segunda vez, prepare una dilución uno a uno de la suspensión celular utilizando una solución de azul de tripano al 0,4%. Cargue en los portaobjetos de la cámara de conteo y cuente el número de células viables sin teñir. Las células no viables serán azules.

Diluir las células en medio de proliferación para obtener de 10 a la sexta célula por milímetro. Agregue 500 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para obtener imágenes de células transducidas por retrovirus, coloque la placa de cultivo de tejidos en una cámara de imágenes conectada a controladores de temperatura y dióxido de carbono para mantener las células en condiciones constantes de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Seleccione una posición en el eje xy para que sirva como punto cero y calibre el punto cero. Seleccione de 10 a 15 posiciones por pocillo para obtener imágenes con un aumento de 10 veces. Configure el software para que requiera imágenes de contraste de fase cada cinco minutos e imágenes de fluorescencia cada tres horas para disminuir la fototoxicidad.

Verifique y ajuste el enfoque en las primeras tres horas del experimento, ya que puede cambiar mientras la temperatura se equilibra. Después de siete días, se detiene la adquisición y se procede a la inmunocitoquímica posterior a la imagen. Inicie el software de seguimiento de celulares y elija un nombre de usuario.

Haga clic en elegir su nombre de usuario y continúe. Examine y seleccione la carpeta de trabajo de tTt para guardar los árboles de linaje, las estadísticas y las imágenes exportadas. A continuación, seleccione el experimento que se va a analizar y cargar.

Si las imágenes fueron convertidas previamente por el convertidor tTt, haga clic en convertidor de archivos de registro y especifique el número de segundos entre dos puntos de tiempo consecutivos en la ventana del convertidor de archivos de registro. Haga clic en convertir archivos de registro para todo el experimento. Seleccione y cargue las imágenes deseadas manualmente o utilizando la opción que se muestra en el programa.

Seleccionar archivo, abrir, nueva colonia. Haga clic en seguimiento, seguido de iniciar seguimiento para iniciar el seguimiento en la posición elegida. Aparecerá una ventana de película.

Seleccione la celda usando el círculo de seguimiento y presione la tecla cero. El software pasará al siguiente fotograma. Mantenga la posición del círculo de seguimiento alrededor de la celda de seguimiento con el ratón y haga clic en cero en cada fotograma para agregar una marca de seguimiento en la celda.

Utilice las teclas uno y tres para pasar al fotograma anterior o siguiente. Para eliminar una marca de pista, simplemente haga clic en la posición correcta para marcar y presione cero. Si la celda se ha dividido, seleccione seguimiento, motivo de detención, división y continúe rastreando una celda secundaria seleccionando una de las celdas en la ventana del editor de celdas, luego seleccione seguimiento, inicie el seguimiento.

Para realizar un seguimiento de la segunda celda secundaria, selecciónela en el editor de celdas y presione F2. Si la célula murió durante la microscopía de video, seleccione apoptosis. Si la celda abandona el campo de observación o se entremezcla con las celdas vecinas impidiendo el seguimiento, seleccione perdido. Para detener el seguimiento y continuar más tarde, haga clic en interrumpir.

En la ventana del editor de celdas, se generará un árbol durante el seguimiento. Para guardar el árbol de linaje, seleccione archivo, guardar, árbol actual en la ventana del editor de celdas. Para exportar la película con los datos de seguimiento, desactive el modo de seguimiento y, en la ventana de la película, seleccione exportar película.

Configure el rango de formato de fotogramas, el número de fotogramas por segundo y la velocidad de bits. Haga clic en iniciar exportación. Las siguientes fotomicrografías muestran el contraste de fase en imágenes fluorescentes GFP de un cultivo primario de células de corteza cerebra.

La expresión de GFP está ausente durante las primeras horas de toma de imágenes. El número de células que expresan GFP aumenta con el tiempo y la intensidad de la fluorescencia de GFP aumenta, como lo indica la flecha amarilla en estas imágenes. Esta imagen de mayor aumento en la región en caja de la imagen anterior muestra las células que expresan GFP en detalle.

Estas imágenes de contraste de fase muestran un ejemplo de división celular. Aquí se observa el redondeo de células de los progenitores, seguido de la constricción de la membrana celular y, por último, la finalización de la mitosis. Este es un ejemplo de un árbol de linaje de una sola célula.

Las flechas de colores indican diferentes modos de división celular, la división proliferativa simétrica se muestra con la flecha amarilla. La división asimétrica se indica con la flecha azul. La división terminal simétrica se muestra con la flecha roja y la X indica la muerte de la célula.

Los números indican la duración del ciclo celular de las células progenitoras. Esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mostrar los comportamientos celulares durante la progresión del linaje celular de células madre a neuronas o células gliales.