General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

El objetivo general de este protocolo es realizar pruebas precisas de muestras de médula ósea de pacientes con leucemia mieloide aguda para detectar enfermedad residual medible, incluida la cuantificación de las células madre de leucemia. Este método puede proporcionar una evaluación precisa de la enfermedad residual medible en muestras de médula ósea de pacientes con leucemia mieloide aguda. La principal ventaja de este enfoque es que un seguimiento cercano del protocolo produce resultados altamente reproducibles y de alta calidad.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a la toma de decisiones clínicas, ya que se puede utilizar como una lectura de la respuesta de los pacientes al tratamiento. Los demostradores de los procedimientos estarán a cargo de Jeroen Janssen, hematólogo, Gerrit Sijm, técnico del laboratorio de hematología diagnóstica y Jennifer Scheick y Sander Snel, técnicos del equipo de MRD. Con el paciente en posición de decúbito lateral, marque la espina ilíaca posterior superior con un bolígrafo y desinfecte la piel del área de biopsia prevista con clorhexidina al 0,5 a 1% en etanol con un movimiento circular hacia afuera.

Después de administrar un anestésico local, tome una aguja de calibre 15 de 2.8 pulgadas con el extremo proximal en la palma y el dedo índice contra el lado del eje metálico de la aguja cerca de la punta para controlarlo. Con una presión suave pero firme, introduzca la aguja con un rápido movimiento supinante pronador alterno a través de la piel anestesiada hacia la espina ilíaca. Cuando la aguja entre en contacto con la espina ilíaca posterior, retire el estileta y coloque una jeringa vacía de 10 mililitros en la aguja.

Retire suavemente el émbolo para crear una presión negativa dentro de la jeringa hasta que se hayan extraído hasta 10 mililitros de espículas de médula ósea. No tome más de 10 milésimas de pulgada de médula ósea por aspirado para evitar la hemodilución. Retire la jeringa y vuelva a colocar el estilete en la aguja.

A continuación, expulse unos dos mililitros de médula en un cristal de reloj y asegúrese de que se extrae suficiente muestra para inyectarla en un tubo de ocho mililitros recubierto de heparina e invierta inmediatamente el tubo. Para prevenir la coagulación, es importante invertir el tubo que contiene anticoagulante tan pronto como se agregue la médula ósea. Para una evaluación morfológica óptima, use una espátula de plástico para transferir las espículas del aspirado en el vidrio del reloj a un portaobjetos de vidrio, y deslice con cuidado otro portaobjetos de vidrio sobre la médula.

Después del secado, tiñir las espículas con Giemsa de May-Grünwald para su análisis mediante microscopía óptica. Coloque el tubo de médula ósea en un soporte de plástico y coloque el soporte en un recipiente de plástico con un paquete de gel ambiental y un formulario de solicitud completado. Antes de analizar la médula ósea mediante citometría de flujo, encienda el citómetro de flujo y abra el software de análisis de citometría de flujo para crear un nuevo experimento con un diagrama de puntos de dispersión directa frente a dispersión lateral.

Para evaluar el tamaño y la granularidad de las células, cargue células de sangre periférica lisadas sin marcar de un donante sano y seleccione la función Adquirir células. Conecte los linfocitos y ajuste los voltajes de dispersión directa y lateral para alcanzar los valores objetivo medios apropiados para la población de células controladas. A continuación, adquiera datos de al menos 10.000 eventos.

Para configurar los voltajes del tubo fotomultiplicador del canal de florescencia objetivo, primero use partículas de calibración de cuentas arcoíris de ocho picos de acuerdo con las instrucciones del fabricante para adquirir 10,000 eventos a un caudal bajo. Cierre las cuentas singlete en el diagrama de puntos de dispersión frontal frente a lateral seguido de la compuerta del 7º pico en el diagrama de puntos FITC-PE. Compruebe las poblaciones de perlas resultantes para cada fluoróforo.

Continúe con la adquisición de la suspensión de cuentas arcoíris de ocho picos y ajuste y ajuste los voltajes PMT en todos los canales de fluorescencia para alcanzar los valores objetivo de MFI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice Registrar para recopilar datos de unos 2.000 eventos y comprobar el MFI para las cuentas del 7º pico. A continuación, agregue un volumen suficiente de cada anticuerpo conjugado de fluorocromo experimental para teñir las perlas en los tubos de florescencia correspondientes menos un control y vórtice los tubos a fondo.

Cree un nuevo experimento en blanco con los mismos parámetros de compensación, teniendo cuidado de que el umbral de dispersión directa se establezca en 5.000 y que los valores de compensación de todos los fluorocromos sean cero. Para crear los controles de compensación, seleccione la función Crear control de compensación y cargue el tubo de control sin manchar. Ajuste la compuerta P1 alrededor de la población de cuentas singlete y confirme que la compuerta P1 solo contiene cordones singlete.

Haga clic con el botón derecho en la puerta P1 y seleccione Aplicar a todos los controles de compensación. A continuación, registre los datos de todos los tubos de florescencia marcados individualmente para confirmar que la puerta P2 abarca la población positiva en cada histograma de florescencia. Para teñir las células para el análisis por citometría de flujo, transporte la médula ósea al laboratorio, consulte el formulario de solicitud para verificar el número de estudio del paciente y la fecha de nacimiento y determine qué se debe teñir.

Para MRD, utilizamos un panel de tinción que consta de cuatro tubos. Aquí demostramos la tinción del panel LSC que consta de un tubo. Después del recuento de células, transfiera el volumen apropiado de médula ósea a un nuevo tubo de 15 mililitros.

Agregue tampón de lisis a 10 veces el volumen de la célula experimental para lisar los glóbulos rojos. Invierta el tubo para mezclar e incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final del período de lisis, granule las células por centrifugación.

Vuelva a suspender las células en 15 mililitros de tampón de lavado a temperatura ambiente y vuelva a cosechar el pellet de la célula por centrifugación. Mientras tanto, pipetee la cantidad adecuada de solución de cóctel de anticuerpos en tubos FACS de cinco mililitros. Aquí se muestra el panel para el tubo de células madre.

Vuelva a suspender el gránulo en el tampón de lavado y agregue la suspensión de la célula al tubo FACS que contiene la solución de cóctel de anticuerpos monoclonales para una incubación de 15 minutos en la oscuridad. Luego, lave las células en tampón de lavado y granule las células por centrifugación. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 400 microlitros de tampón de lavado fresco.

Para analizar las células madre leucémicas, agregue cuatro microlitros de perlas en blanco a la suspensión celular que se tiñe con el cóctel de anticuerpos de células madre. A continuación, lea las muestras utilizando los parámetros previamente establecidos, adquiriendo al menos cuatro veces 10 a 6 eventos de las muestras de pacientes experimentales. Para identificar el inmunofenotipo asociado a la leucemia que se observa en aproximadamente el 90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda, es crucial que las puertas exprimibles se establezcan adecuadamente, como se ilustra.

Aquí, se muestran ejemplos de datos de pacientes individuales que albergan diferentes tipos de aberración en las células primitivas CD34 positivas. En estos gráficos, se puede observar a un paciente que permanece en remisión completa y a un paciente que recayó después de tener resultados positivos medibles de enfermedad residual después del segundo ciclo de terapia de inducción, lo que subraya la necesidad de un ajuste preciso de la puerta antes del análisis de la muestra. La identificación y cuantificación de LSC requiere un análisis adicional de las aberraciones, específicamente en las células blastas CD34 positivas para CD38 negativas, como se muestra en estos gráficos.

Al realizar este protocolo, es muy importante contar con personal especializado y de respaldo para la toma de muestras de médula ósea, el transporte, el trabajo experimental y las etapas de análisis de este procedimiento. Este procedimiento también se puede utilizar para realizar análisis citogenéticos y moleculares para responder preguntas adicionales sobre la correlación entre poblaciones celulares específicas y aberrancias moleculares de interés, o para refinar el grupo de riesgo de un paciente para predecir el resultado clínico. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hematología exploraran la enfermedad residual en pacientes con LMA después del tratamiento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificamos y cuantificamos con precisión la enfermedad residual mediante el uso de citometría de flujo, incluida la recolección y el transporte de muestras de médula ósea de pacientes con LMA.