Visualización de módulos corticales en cortezas mamíferos aplanados

Este artículo describe una metodología detallada para obtener secciones tangenciales aplastadas de cortezas mamíferas y visualizar los módulos corticales mediante histoquímica y métodos inmunohistoquímicos.

El objetivo general de este procedimiento para el aplanamiento y la tinción de la corteza es visualizar los módulos celulares en las regiones corticales de una manera por capas. Este método puede responder a preguntas clave en neurociencia, como cómo la estructura cortical se extiende en el cerebro y cómo podría relacionarse con la función. La principal ventaja de esta técnica es que se puede comparar la arquitectura cortical de forma laminar, y comparar varios aspectos de la misma, como cómo se ha conservado la evolución de la clase, o cómo varía en función.

La demostración de la técnica estará a cargo de Simon Lauer y Undine Schneeweib, estudiante y técnica del laboratorio de la profesora Michelle Black. Para empezar, perfundir transcárdicamente al animal para obtener un cerebro homogéneamente fijado y libre de sangre. Después de extraer el cerebro, sumérjalo en un tampón de fosfato 0,1 molar.

Si se desean secciones con áreas corticales grandes, aplanar el cerebro antes de una mayor posfijación. Sin embargo, para obtener secciones de áreas más difíciles de alcanzar, como la corteza entorrinal medial, coloque el cerebro en 4%PFA durante 24 horas antes de aplanarse. Prepárese para mantener el cerebro húmedo con un tampón durante toda la disección.

Para empezar, separa los hemisferios con un bisturí. Si el cerebro no ha sido postfijado, tenga cuidado al manipularlo. A continuación, mientras asegura el cerebro por el cerebelo, inserte suavemente la espátula para abrir un plano de disección en el cuerpo calloso.

La punta redonda de la espátula debe apuntar en dirección opuesta a la corteza. Luego, manipula la espátula para dividir el tálamo y la corteza. A continuación, separe las estructuras subcorticales con una cuchilla de afeitar.

A continuación, separa las estructuras subcorticales con un bisturí o el borde de la espátula. Para mejorar el aplanamiento, haz un corte limpio a través del cuerpo estriado, el núcleo accumbens y la corteza frontal orbitaria, ya que aumentan el grosor de la corteza en la región lateral. A continuación, añade un corte de alivio en la base de la región interna de la corteza prefrontal.

Esto permitirá el despliegue de las porciones mediales de la corteza. Ahora, coloca una corteza del hemisferio en un portaobjetos de vidrio. Luego, coloca dos cilindros de arcilla a cada lado del pañuelo.

La arcilla debe ser entre un 10 y un 20% más delgada que el tejido cerebral, ya que la arcilla define el grado de aplanamiento. A continuación, coloque un lado de vidrio tangencialmente en la corteza, contactando primero la parte lateral. Luego, coloque un peso sobre el vidrio, con la masa centrada sobre la parte lateral.

Ahora, deje reposar el ensamblaje durante tres a cinco horas en un tampón de fosfato a cuatro grados centígrados. La verdadera clave para esta preparación es hacer que el cerebro sea lo más plano posible, ya que esto tiene el mayor impacto en la visualización del mapa cortical. Por último, si es necesario, coloque el cerebro.

Transfiera el hemisferio aplanado a 1% de PFA, o 2% de PFA si no se tomó de un animal perfundido. Luego, déjalo reposar durante 24 horas a 4 grados centígrados, con una suave agitación. Primero, lave el hemisferio aplanado en tampón de fosfato durante 15 minutos.

Luego, corta el hemisferio tangencialmente en un vibrátomo. Fije el tejido en su posición con un pequeño volumen de cianocrilato y un prensado suave. Tenga cuidado, ya que demasiado pegamento puede provocar artefactos de corte.

Ahora, corta el hemisferio desde el extremo más grueso y estable hacia el extremo más delgado con el grosor requerido. Si se utilizaron concentraciones bajas de fijador, corte el tejido lentamente con una amplitud alta. A continuación, lave el tejido seccionado en tampón hepes durante 15 minutos con una agitación suave.

Durante el lavado, prepare una solución fresca de tinción de citocromo oxidasa. Y agregue el componente DAB justo antes de usarlo. Ahora, incube las secciones en la solución de tinción recién hecha a temperatura ambiente con agitador y vigile.

Dependiendo de la cantidad de fijación, la tinción puede ser observable en 10 minutos o puede tardar varias horas. Si la reacción es demasiado lenta, aumente la temperatura a 37 grados centígrados. Para detener la reacción, transfiera las secciones a un baño de 4% de PFA y déjelas incubar durante 15 minutos con una agitación suave.

A continuación, lava las secciones tres veces, con tampón hepes durante 10 minutos por lavado. Ahora, monte y seque las secciones en portaobjetos de vidrio. Y deshidratarlos con baños de etanol progresivamente más fuertes.

Luego, lave los portaobjetos con isopropanol durante cinco minutos, seguido de xileno durante cinco minutos. Después del baño de xileno, agregue inmediatamente un medio de montaje de endurecimiento rápido que no sea a base de agua. Los medios a base de agua degradarán la mancha.

Después de agregar un cubreobjetos, guarde las diapositivas a cuatro grados centígrados hasta que se obtengan imágenes. Se procesaron secciones corticales de la corteza somatosensorial en una variedad de cerebros, utilizando los procedimientos descritos. Este enfoque comparativo permite el estudio de las fuerzas evolutivas que dan forma a la corteza, como la representación altamente conservada de mistacial vibrissaer en roedores y lagomorfos como barriles.

La arquitectura de la corteza entorrinal medial se observó en secciones paralelas a la superficie de la cáscara, utilizando la sección tangencial de la corteza entorrinal médica en ratones, ratas y murciélagos frugívoros egipcios. Además, los cerebros humanos se procesaron mediante un suave aplanamiento de la corteza y cortes tangenciales. Todos los cerebros fueron criopreservados y seccionados en un criostato de 60 micras.

La inmunotinción se utilizó para marcar módulos celulares parameatales positivos para calbindina. En la corteza entorrinal, los módulos de calbindina muestran una periodicidad notable en cada especie, y varían en tamaño solo un factor de 10, a lo largo de una variación de 20.000 veces en el tamaño del cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener secciones tangenciales para el análisis.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en un par de horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar aplanar el cerebro correctamente, en lugar del tamaño, la calidad o los resultados finales. No olvide que trabajar con agentes como PFA y DAB puede ser extremadamente peligroso, y siempre debe usar ropa protectora y trabajar bajo la luz del campo.