Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los microARN circulantes y los fluidos biológicos, como el plasma o el suero, utilizando la tecnología de PCR digital en gotas. El método puede ayudar a responder preguntas en el campo del biomercado. Mediante la identificación diagnóstica y pronóstica, biomarketing del cáncer.

La principal ventaja de esta técnica es la alta sensibilidad. Se puede utilizar para cuantificar también los microRNAs menos abundantes sin necesidad de un gen de referencia andrógino. Las implicaciones de este método se extienden hacia el diagnóstico del cáncer porque tiene el potencial de identificar a las personas con cáncer en etapa temprana.

También se puede aplicar a otras enfermedades como trastornos neurológicos o cardíacos. En general, las personas deben prestar atención a la manipulación de las gotas antes del paso del ciclo térmico para evitar su interrupción. Por lo tanto, una demostración visual de la generación de gotas es fundamental porque las gotas pueden destruirse mediante una manipulación descuidada o un pipeteo demasiado rápido.

Comience este procedimiento aislando los microARN plasmáticos o séricos. A continuación, transcribirlos inversamente y diluirlos como se describe en el documento adjunto. Retire el juego de cebadores de microARN de mezcla maestra EvaGreen y el ADNc del congelador y deje que se descongelen a temperatura ambiente.

Después de que se haya descongelado, invierta el tubo de mezcla maestro varias veces. Y luego centrifuga todos los reactivos. Prepare una solución de trabajo de mezcla de gotas, digitales o ddPCR de acuerdo con las instrucciones del documento adjunto.

Prepare lo suficiente para hasta ocho muestras con un control sin plantilla para cada condición más un exceso del 10%Una vez ensamblado, mezcle completamente y centrifugue la mezcla de ddPCR. Tenga en cuenta que no se requieren réplicas técnicas debido a la alta reproducibilidad de esta tecnología. Después del centrifugado, dispense 12 microlitros de mezcla ddPCR en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.

Agregue ocho microlitros de molde de ADNc diluido a cada pocillo. A continuación, inserte el cartucho del generador de gotas en el soporte del cartucho. A la fila central del cartucho del generador de gotas, transfiera con cuidado 20 microlitros de cada muestra preparada.

Evite introducir burbujas de aire en el fondo del pozo. Llene cada uno de los pozos de petróleo de la fila inferior con 70 microlitros de aceite para generador de gotas. Enganche la junta sobre el soporte del cartucho.

Insértelo en el generador de gotas y cierre la tapa para iniciar la generación de gotas. Cuando haya finalizado la generación de gotas, abra la tapa, retire el cartucho del generador de gotas y retire la junta desechable. Los pocillos superiores del cartucho contienen las gotas.

Transfiera lenta y suavemente 40 microlitros de cada uno de los ocho pocillos superiores a una sola columna de una placa de PCR de 96 pocillos. Selle inmediatamente la placa con papel de aluminio para evitar la evaporación. Dentro de los 30 minutos posteriores al sellado de la placa, comience el ciclo térmico utilizando el protocolo de PCR descrito en la tabla tres del documento adjunto.

Encienda el lector de gotas. A continuación, mueva la placa del termociclador al lector de gotas. Coloque la placa de PCR de 96 pocillos que contiene las gotas posteriores a la PCR en la base del soporte de placas en el lector de gotas.

Coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa PCR. Presione firmemente ambas lengüetas de liberación hacia abajo para asegurar la placa PCR en el soporte. Inicie el software QuantaLife desde el PC del sistema. Haga clic en Configuración y abra el archivo de datos de la plantilla que contiene información sobre las muestras, los genes objetivo y los ensayos.

En la barra de navegación de la izquierda, seleccione Ejecutar. Aparecerá una ventana de Opciones de ejecución. En el menú Juego de tintes, seleccione EVA y haga clic en Aceptar para iniciar la lectura de gotas.

Una vez completada la ejecución, utilice el gráfico de amplitud 2D en el software de análisis para seleccionar las gotas positivas. Para seleccionar las gotas positivas, use la herramienta Lazo de la barra de navegación del lado izquierdo. A continuación, haga clic en la pestaña Eventos para comprobar el número de gotas positivas y totales.

Un número total de 18.000 gotas se consigue normalmente con la ddPCR sin sonda. A continuación, haga clic en la pestaña Concentración para visualizar la muestra final de concentración. Por último, utilice la opción Exportar.

CSV para exportar los valores de concentración de microARN. El ARNm miR-181a-5p se cuantificó en dos muestras de plasma, S1 y S2, utilizando una concentración de cebador de 0,5 y un microlitro a temperaturas de recocido de 58 y 60 grados Celsius. Esta figura presenta las copias de microARN por microlitro en la reacción de amplificación para cada condición.

Las gotas positivas de PCR para cada muestra se muestran en azul y las gotas negativas se muestran en negro. Como se puede ver aquí, la muestra de control no tiene gotas positivas como se esperaba. La realización de la PCR a 60 grados centígrados con el uso de un cebador de 0,5 o un microlitro dio como resultado una mejor separación de las gotas positivas y negativas.

En esta figura, las barras de error representan el intervalo de confianza de Poisson del 95%. Y aquí, el número de gotas positivas que se muestran en azul, se comparan con el número total de gotas, que se muestran en verde. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la PCR digital en gotas se puede utilizar para determinar el número absoluto de copias de microARN por microlitro de un fluido biológico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una cuantificación de ARNm mediante PCR digital de gotas. Una vez dominadas, se pueden analizar 96 muestras en solo unas pocas horas, lo que es un resultado óptimo para un entorno clínico. Después de cada desarrollo, esta técnica allana el camino al campo de la biopsia líquida para explorar el microARN y otros ácidos nucleicos como biomarcadores de enfermedades.