Name: Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a cuantificar microARN circulantes en plasma o suero mediante PCR digital en gotitas con alta sensibilidad. Esta técnica permite detectar biomarcadores de cáncer en etapas tempranas sin necesidad de genes de referencia.

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Con el apoyo de fondos de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) en MF (GPA 11676) y MN (Oncología Clínica Molecular Programa Especial -. 5 por mil n 9980, 2010/15) y del Ministerio Italiano de Instrucción, Universidad y Investigación FIRB 2011 al MN (Proyecto RBAPIIBYNP).

Aislamiento MicroARN del plasma o suero Nota: El plasma y suero de preparación es un paso relevante en la circulación de miARN cuantificación. No existe un procedimiento preferido para la preparación de plasma y suero. La única cosa importante a tener en cuenta es que todas las muestras del mismo experimento deben ser elaborados utilizando exactamente el mismo flujo de trabajo. Comenzar a partir de suero o plasma de 200 l. El ARN total se puede aislar a partir de suero o plasma usando kits disponibles en el mercado. 1. Protocolo para el ARN total (incluyendo miRNA) Aislamiento <ol><li> Las muestras de suero / plasma descongelación en hielo. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de lisis (por ejemplo., QIAzol) a 200 l de suero / plasma. </li><li> Mezclar con el vórtex y colocar el tubo que contiene el homogeneizado en el banquillo a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir 3 l de una solución de 4,16 nM del miARN miR-cel-39-3p sintético a partir de C. elegans. </li><li> Añadir 200 l de cloroformo. Agitar vigorosamente durante 15 segundos. º lugartubo de correo en el banquillo a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C para obtener la separación fases: la fase acuosa superior contiene ARN. </li><li> Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo, a unos 700 l, evitar la transferencia de cualquier material interfase blanca. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 100% y se mezcla por inversión. </li><li> Pipet hasta 700 l de la muestra en una columna de mini giro colocado en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a 12.000 xg durante 15 seg. Desechar el flujo continuo. </li><li> Repita este paso con el resto de la muestra. </li><li> Añadir 700 l de tampón de TAR a la columna de centrifugación mini, cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a 12.000 xg para lavar la columna. Desechar el flujo continuo. </li><li> Pipetear 500 l de tampón RPE en la columna de centrifugación mini. Cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a 12.000 rpm. Desechar el flujo continuo. Repita este paso de nuevo. </li><li> Se centrifuga la columna de centrifugación de mini a toda velocidad durante 2 minutos para secar la columna de centrifugaciónmembrana a partir de etanol residual. </li><li> Transferir la columna de la mini giro a un nuevo tubo de 1,5 ml de recogida y pipeta de 35 l de agua libre de RNasa en la membrana de la columna. </li><li> Centrifugar durante 1 min a 12.000 xg para eluir el RNA. </li><li> Almacenar el ARN a -80 ° C. Nota: Puesto que la concentración de ARN no puede determinarse con precisión, utilizar volúmenes fijos como una medida para la cantidad de entrada. </li></ol> 2. El microARN transcripción inversa <ol><li> Descongelar los transcripción inversa (RT) componentes de la mezcla de reactivos: Tampón de reacción 5x, agua libre de nucleasa. Mezclar invirtiendo suavemente los tubos y el lugar en el hielo. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos. </li><li> Preparar la mezcla de reactivo de RT en hielo como se describe en la Tabla 1. Preparar al menos 10% superior a la mezcla. </li><li> Mezclar la reacción con la pipeta, y luego girar hacia abajo. </li><li> Incubar durante 60 minutos a 42 ° C. </li><li> Heat-inactivar la revertranscriptasa SE durante 5 min a 95 ° C. </li><li> Inmediatamente enfriar a 4 ° C. </li><li> Almacenar el ADNc a -20 ° C. </li></ol> 3. La dilución de cDNA <ol><li> Diluir la cantidad de cDNA plantilla necesaria para las reacciones ddPCR previstas en agua libre de nucleasa. Se diluye la reacción de ADNc de entre 1:50 y 1: 500 en agua, en función de los genes miARN objetivo abundancia. Almacenar el ADNc diluida a -20 ° C. El cDNA diluido resultó ser estable durante al menos 3 meses a -20 ° C. </li></ol> 4. Generación de la gotita y PCR Nota: la generación de la gotita se debe realizar en 8 muestras a la vez. Técnico repeticiones no son necesarios, debido a la alta reproducibilidad de esta tecnología 12,15 .A No Control plantilla (NTC) de la muestra debe ser ejecutado en cada placa y para cada condición ddPCR diferente. <ol><li> Descongelar y equilibrar la mezcla maestra (por ejemplo., EvaGreen Master Mix), el juego de primers Micro RNA y cDNA a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar la TH Master Mixoroughly invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar todos los reactivos. </li><li> Prepare la mezcla ddPCR como se describe en la Tabla 2. Cuando se realizan múltiples reacciones ddPCR, preparar una mezcla ddPCR-solución de trabajo. Preparar al menos 10% superior a la mezcla. </li><li> Una vez montada, mezclar bien y centrifugar la mezcla ddPCR. </li><li> Dispensan 12 l de ddPCR mezclan en una placa de 96 pocillos PCR o los tubos de PCR. </li><li> Añadir 8 l de molde de ADNc diluida a cada tubo / pocillo. </li><li> Insertar el cartucho generador de gotas en el soporte. </li><li> Transferencia de 20 l de cada muestra preparada a los pocillos de muestra (fila central) del cartucho generador de gotas con cuidado, evitando las burbujas de aire en la parte inferior del pozo. </li><li> Llenar cada pocillo de aceite (fila inferior) con 70 l de aceite de generador de gotas. </li><li> Enganche la junta sobre el soporte del cartucho y se insertan en el generador de gotas. </li><li> Cierre la tapa para que comience la generación de gotas según la pr del fabricanteotocol. Cuando la generación de gotas ha terminado, abra la tapa, retire la junta desechable. Los pocillos superior del cartucho contienen las gotitas. </li><li> Pipet lenta y suavemente 40 l de los contenidos de los ocho pozos superiores (las gotas) en una sola columna de una placa de 96 pocillos de PCR. </li><li> Sellar la placa con papel de PCR inmediatamente después de la transferencia de gotas para evitar la evaporación. Usar juntas de la placa de lámina perforables que son compatibles con las agujas en el lector de gotas. </li><li> Comenzará el ciclo térmico (PCR) dentro de los 30 minutos después del cierre del plato. </li><li> Realizar el protocolo de ciclado de acuerdo a la Tabla 3. </li></ol> 5. Lectura de la gotita <ol><li> Encender el lector de gotas. </li><li> Mover la placa del termociclador para el lector de gotas. </li><li> Coloque la placa de PCR de 96 pocillos que contiene las gotas de post-PCR en la base del soporte de la placa. </li><li> Coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa de PCR. Presione firmemente las dos lengüetas de liberaciónhacia abajo para asegurar la placa de PCR en el soporte. </li><li> Iniciar el software desde el PC del sistema. <ol><li> Haga clic en Configuración para definir el experimento (Cuantificación absoluta) a continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar la lectura de las gotas. </li><li> Cuando la lectura de la gotita se haya completado, haga clic en el botón para abrir y analizar los datos &quot;Analizar&quot;. </li><li> Usar el diagrama de amplitud 2D en el software de análisis para seleccionar las gotitas positivos (herramienta de lazo) (Figura 1B). </li><li> Utilice la ficha Eventos para comprobar el número de gotitas positivas y totales. Un total de 18.000 - 21.000 gotitas se logra por lo general con ddPCR sin sonda. </li><li> Una vez que se seleccionan las gotitas positivos, exportar los valores de concentración miARN utilizando la opción de la exportación .csv desde la pestaña de concentración. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

miRNAs circulantes están presentes en la sangre en concentraciones extremadamente bajas y la cantidad de ARN que se puede extraer a partir de muestras de plasma y suero es baja. Por esta razón, son difíciles de cuantificar con otras técnicas tales como microarrays y secuenciación de ARN. Por otra parte, hay una falta generalizada de acuerdo sobre la normalización de datos y la presencia de miRNAs endógenos &quot;de referencia&quot; en la sangre. En este contexto, una tecnología sensible como gotita PCR digital, capaz de...

Los microRNAs (miRNAs) son liberados a la circulación sanguínea por potencialmente todas las células del organismo, como consecuencia de la liberación activa o de procesos necróticos y apoptóticos. Se han detectado miRNAs libres de células en el torrente sanguíneo, ya sea como moléculas libres y estables o unidas a lipoproteínas o envueltas dentro de exosomas y microvesículas 1-3. Se cree que funcionan como comunicadores de célula a célula 4, y su cantidad cambia en presencia de cáncer, trastornos cardíacos o enfermedades autoinmunes 5-7. Su cuantificación precisa y reproducible es la base para su evaluación como biomarcadores de enfermedades. Sin embargo, por varias razones ya descritas en otros lugares 8,9, la cuantificación de miRNAs en suero o plasma, así como en otros fluidos corporales, podría ser muy desafiante 10,11. Recientemente hemos desarrollado un método para la cuantificación absoluta de miRNAs circulantes, basado en cebadores LNA específicos de miRNAs y tecnología de PCR digital (ddPCR) de gotas de colorante de unión al ADN 12. Esta metodología se ha aplicado a la validación de biomarcadores de cáncer de mama con miRNA 13,14. 
Después de la partición de cada molécula de miARN transcrita inversamente dentro de una gota del tamaño de un nanolitro, es posible contar el número de copias de cada miARN en cada muestra, básicamente contando el número de gotas fluorescentes verdes y, por lo tanto, positivas. Tan pronto como se produce una reacción de PCR, se logra un recuento positivo, sin necesidad de establecer una curva estándar ni tener en cuenta la eficiencia de la PCR en el cálculo de la cantidad objetivo, como ocurre con la RT-PCR CUANTITATIVA (RT-qPCR). Además, la ddPCR demostró ser más sensible y precisa que la RT-qPCR en la cuantificación de miARN circulante 15. En este artículo se presenta el protocolo detallado de esta metodología, discutiendo los pasos más relevantes y considerando específicamente las muestras clínicas de suero y plasma.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Columnas para ARN total, incluido el miARN, extracción de suero/plasma</td></tr><tr><td>100 nmol de ARN oligo Cel-miR-39-3p</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>Secuencia personalizada</td><td>: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Kit universal de síntesis de ADNc II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>Kit para transcripción inversa de microARN</td></tr> Juego de <tr><td>cebadores de PCR de ARN de ARNm&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx y 2100000-21xxxxx</td><td>Cebadores para la amplificación de miRNA en el interior de gotas</td></tr><tr><td>QX200 generador de gotas BioRad</td><td></td><td>186-4002</td><td>Instrumento utilizado para la lectura de gotas</td></tr><tr><td>QX200 lector de gotas</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Instrumento utilizado para la generación de gotas</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Software para la recopilación y análisis</td></tr> <tr>de datos<td>Selladora de placas PX1 PCR</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>Selladora de placas</td></tr><tr><td>DG8 Cartuchos y juntas del generador de gotas</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Cartuchos utilizados para mezclar muestra y aceite para generar gotas</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>QX200 aceite generador de gotas para tinte EvaGreen</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Aceite para la generación de gotas</td></tr></tbody></table>

que circula microarn cuantificación usando adn vinculante tinte química y gotita de pcr digital

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulación (de libres de células) microRNAs (miRNAs) son liberados de las células en el torrente sanguíneo. La cantidad de microRNAs específicos en la circulación se ha relacionado con un estado de enfermedad y tiene el potencial para ser utilizado como biomarcador de la enfermedad. Un método sensible y exacto para la circulación de la cuantificación de microARN usando una química a base de colorante y tecnología de gotas de PCR digital ha sido desarrollado recientemente. Específicamente, utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) a base de cebadores-miARN específico con un colorante de unión a ADN fluorescente verde en un sistema digital de PCR gotita compatible es posible obtener la cuantificación absoluta de miRNAs específicos. A continuación, se describe la forma de realizar esta técnica para evaluar la cantidad de miRNA en fluidos biológicos, tales como plasma y suero, es factible y eficaz.

La cantidad absoluta de miRNAs específicos por ml de plasma o suero se puede determinar usando un colorante de unión a ADN fluorescente verde y tecnología de gotas de PCR digital. La Figura 1 presenta el proceso de selección-gotitas positivo, que determina la concentración final miRNA (copias / l ) en la reacción de amplificación calculado por el software de análisis. La cantidad de cada uno de los genes miARN en la sangre es muy diferente, siendo algunas especies miARN ...

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar microARNs circulantes en fluidos biológicos, como plasma o suero, utilizando la tecnología de PCR digital por gotas. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de los biomarcadores. Mediante la identificación de biomarcadores diagnósticos y pronósticos en el cáncer.La principal ventaja de esta técnica radica en su alta sensibilidad. Puede utilizarse para cuantificar también las microARN menos abundantes sin necesidad de un gen de referencia andrógino. Las implicaciones de este método se extienden hacia el diagnóstico del cáncer porque tiene el potencial de identificar personas con cáncer en estadio temprano.También puede aplicarse a otras enfermedades como trastornos neurológicos o cardíacos. En general, las personas deben prestar atención a la manipulación de las gotas antes del paso de ciclado térmico para evitar su alteración. Por lo tanto, una demostración visual de la generación de gotas es fundamental, ya que estas pueden destruirse por una manipulación descuidada o por pipeteo demasiado rápido.Comience este procedimiento aislando los microARNs del plasma o suero. Luego realice la transcripción inversa y dilúyalos según se describe en el documento adjunto. Saque del congelador el conjunto de cebadores para microARNs, el cDNA y la mezcla maestra de EvaGreen, y déjelos descongelar a temperatura ambiente.Después de que se haya descongelado, invierta varias veces el tubo de la mezcla maestra. Luego, centrifugue todos los reactivos. Prepare una solución de trabajo de digital por gotas, o ddPCR, según las instrucciones del documento adjunto.Prepare suficiente para hasta ocho muestras con un control sin plantilla para cada condición más un exceso del 10%. Una vez ensamblada, mezcle bien y centrifugue brevemente la mezcla de ddPCR. Tenga en cuenta que no se requieren réplicas técnicas debido a la alta reproducibilidad de esta tecnología. Después de la centrifugación, distribuya 12 microlitros de la mezcla de ddPCR en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos.Agregue ocho microlitros de la plantilla de ADNc diluida a cada pocillo. Luego, inserte el cartucho del generador de gotas en el soporte del cartucho. A la fila central del cartucho del generador de gotas, transfiera cuidadosamente 20 microlitros de cada muestra preparada.Evite introducir burbujas de aire en la parte inferior del pocillo. Llene cada uno de los pozos de aceite en la fila inferior con 70 microlitros de aceite generador de gotas. Enganche la junta sobre el soporte del cartucho.Introduzca en el generador de gotas y cierre la tapa para iniciar la generación de gotas. Cuando finalice la generación de gotas, abra la tapa, retire el cartucho del generador de gotas y retire la junta desechable. Los pozos superiores del cartucho contienen las gotas.Transfiera lentamente y con suavidad 40 microlitros de cada uno de los ocho pozos superiores a una sola columna de una placa PCR de 96 pozos. Selle inmediatamente la placa con papel de aluminio para evitar la evaporación. Dentro de los 30 minutos posteriores al sellado de la placa, comience el ciclado térmico utilizando el protocolo de PCR descrito en la tabla tres del documento adjunto.Encienda el lector de gotas. A continuación, traslade la placa desde el termociclador hasta el lector de gotas. Coloque la placa PCR de 96 pocillos que contiene las gotas post-PCR en la base del portaplacas del lector de gotas.Coloque la parte superior del portaplacas sobre la placa de PCR. Presione firmemente ambas pestañas de liberación hacia abajo para asegurar la placa de PCR en el portaplacas. Inicie el software QuantaLife desde la PC del sistema. Haga clic en Configuración y abra el archivo de plantilla de datos que contiene información sobre las muestras, los genes diana y los ensayos.Desde la barra de navegación izquierda, seleccione Ejecutar. Aparecerá una ventana de opciones de ejecución. En el menú Conjunto de colorante, seleccione EVA y haga clic en Aceptar para iniciar la lectura de las gotas.Una vez finalizada la corrida, utilice el gráfico de amplitud 2D en el software de análisis para seleccionar las gotas positivas. Para seleccionar las gotas positivas, use la herramienta de lazo ubicada en la barra de navegación izquierda. A continuación, haga clic en la pestaña Eventos para verificar el número de gotas positivas y el número total de gotas.Normalmente se obtienen un total de 18.000 gotas con la ddPCR sin sonda. A continuación, haga clic en la pestaña Concentración para visualizar la muestra final de concentración. Finalmente, utilice la función Exportar.CSV para exportar los valores de concentración de microARN. El ARNm miR-181a-5p se cuantificó en dos muestras de plasma, S1 y S2, utilizando concentraciones de cebador de 0,5 y un microlitro a temperaturas de hibridación de 58 y 60 grados Celsius. Esta figura presenta las copias de microARN por microlitro en la reacción de amplificación para cada condición.Las gotas positivas para PCR de cada muestra se muestran en azul, y las gotas negativas se muestran en negro. Como puede observarse aquí, la muestra de control no tiene gotas positivas, tal como se esperaba. Realizar la PCR a 60 grados Celsius utilizando ya sea 0,5 o un microlitro de cebador dio como resultado una mejor separación entre las gotas positivas y negativas.En esta figura, las barras de error representan el intervalo de confianza de Poisson al 95 %. Y aquí, el número de gotas positivas mostradas en azul se compara con el número total de gotas, mostradas en verde. En conjunto, estos datos demuestran que la PCR digital en gotas puede utilizarse para determinar el número absoluto de copias de microARN por microlitro de un fluido biológico.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar una cuantificación de ARNm utilizando PCR digital por gotas. Una vez dominada, se pueden analizar 96 muestras en solo unas pocas horas, lo cual representa un rendimiento óptimo para un entorno clínico. Tras cada avance, esta técnica allana el camino hacia el campo de la biopsia líquida para explorar microARN y otros ácidos nucleicos como biomarcadores de enfermedades.

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Investigación

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Bioingeniería

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

En este video, demostramos la técnica de PCR digital dúplex (ddPCR), una modificación de la técnica de PCR tradicional que es útil para detectar dos marcadores genéticos diferentes simultáneamente. Una sola reacción de PCR se divide en gotas emulsionadas del tamaño de un nanolitro que se amplifican de forma independiente, y la detección de señales de amplificación de fluorescencia de diferentes colores a partir de la fracción de gotas se utiliza para calcular la concentración inicial de las...

PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

Aprenda a cuantificar microARN circulantes en plasma o suero mediante PCR digital en gotitas con alta sensibilidad. Esta técnica permite detectar biomarcadores de cáncer en etapas tempranas sin necesidad de genes de referencia.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

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