Formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos

El objetivo general de este experimento es determinar la accesibilidad de la cromatina a un locus genético mediante la reticulación covalente del ADN con las proteínas asociadas, seguido de la purificación y cuantificación del ADN libre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cromatina, ya que se puede determinar la accesibilidad del ADN, independientemente del tipo de célula en las células no tratadas y también en las células en proceso de remodelación de la cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de enzimas para escindir el ADN o los anticuerpos que deben valorarse para cada entorno experimental.

Este protocolo tiene la ventaja adicional de que no requiere ningún equipo especial que no sea un Sonicator. Para demostrar el procedimiento, Olesja Ritter y Tabea Riedlinger, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar el protocolo, agregue formaldehído directamente al medio de crecimiento de las células que se sembraron un día antes, para alcanzar una concentración final de 1% volumen por volumen.

Incubar el medio durante 10 minutos a temperatura ambiente y girar las placas manualmente cada dos minutos. A continuación, agregue glicina hasta una concentración final de 0,125 molar para apagar el formaldehído. Incubar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente y girarla cada dos minutos.

Aspire el medio y luego agregue con cuidado PBS helado a un lado del plato para lavar las celdas. Aspire el medio y repita cuidadosamente el lavado dos veces. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS helado y use un raspador de células para separar las celdas, si es necesario.

Transfiérelos a un tubo de reacción de 1,5 mililitros sobre hielo. Centrifugar las células durante cinco minutos a 300 g y cuatro grados centígrados en una centrífuga de mesa refrigerada. Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet de celda en un mililitro de tampón de lisis FAIRE pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar las células durante 20 minutos en hielo. Después de la incubación, sonicar el ADN reticulado para compartirlo con un tamaño medio de 200 a 300 pares de bases y enfriar las muestras durante la sonicación para evitar el calentamiento de la muestra.

La fragmentación del ADN es fundamental para este experimento, ya que el tamaño de los fragmentos afecta a la sensibilidad de la solución de toda la técnica, por lo que es importante establecer cuidadosamente las condiciones de sonicación de antemano y comprobar el tamaño de los fragmentos de cromatina en cada experimento. Centrifugar la muestra durante 15 minutos y 13.000 g a cuatro grados centígrados. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción.

Divide las muestras en alícuotas de 100 microlitros. Utilice una alícuota de 100 microlitros para revertir el enlace cruzado y se utilizará como referencia para el ADN total. Añadir 10 microlitros de RNasa A e incubar la muestra durante una hora a 37 grados centígrados.

A continuación, agregue 10 microlitros de proteinasa K. Utilice un termobloque programable para incubar la muestra durante cuatro horas a 37 grados centígrados y luego durante seis horas a 65 grados centígrados para escindir las proteínas e invertir los enlaces cruzados. Obtener una nueva alícuota de 100 microlitros, añadir 10 microlitros de RNasa A e incubar la muestra durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, proceda con la muestra no reticulada y la muestra reticulada de la sección anterior en paralelo.

Añadir H2O hasta alcanzar un volumen final de 300 microlitros. A continuación, añada 300 microlitros de alcohol fenol cloroformo isoamílico en una campana extractora y en un vórtice vigoroso. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 13.000 g y cuatro grados centígrados.

A continuación, transfiera con cuidado 280 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción. Asegúrese de no tomar ningún residuo de la interfase, que también contiene proteínas, y deseche la fase inferior restante como residuo de solvente orgánico. Repita el tratamiento y transfiera con cuidado 270 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción.

Agregue 270 microlitros de cloroformo en una campana extractora y haga un vórtice vigoroso. Centrifugar la muestra. Después de la centrifugación, transfiera con cuidado 250 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción, teniendo cuidado de no arrastrar ningún residuo de la interfase.

Deseche la muestra restante como residuo de solvente orgánico. A continuación, se añaden 25 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, 250 microlitros de isopropanol y se añaden cinco microlitros de glucógeno como portador del ADN. Invierta los tubos e incubelos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, centrifugar la muestra para precipitar el ADN. A continuación, lave el pellet de ADN con 400 microlitros de etanol al 70% volumen por volumen y centrifugue la muestra. Aspire el sobrenadante con cuidado y deje secar el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Una vez que el pellet esté seco, vuelva a suspenderlo en 100 microlitros de tampón TE. Incubar la muestra de ADN libre no reticulada durante cuatro horas a 65 grados Celsius para eliminar los enlaces cruzados entre ADN. Por último, se cuantifica la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro y se ejecuta una pequeña alícuota para comprobar el tamaño del fragmento en un gel de agarosa del 2% en peso por volumen.

Las células HeLA se estimularon con TNF durante una hora y se analizaron mediante FAIRE. Se determinó la relación entre el ADN libre y el total para el promotor de ACTB, el gen que codifica la beta-actina y el control positivo, una región de heterocromatina en el cromosoma 12, el control negativo y el promotor de IL8. Se generó un gel teñido de bromuro de etidio con diferentes tiempos de sonicación e indica que el tamaño óptimo de cromatina de 200 a 300 pares de bases se obtuvo después de 20 minutos de sonicación.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación profunda, para determinar la accesibilidad de la cromatina a nivel de todo el genoma. No olvide que trabajar con formaldehído y cloroformo de fenol puede ser extremadamente peligroso y se deben garantizar precauciones como trabajar en una campana extractora, usar guantes y eliminar adecuadamente los desechos al realizar este procedimiento.