Name: Formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende el protocolo FAIRE para medir accesibilidad de cromatina en células de mamíferos mediante formaldehído y sonicación. Este método reproducible no requiere equipos especializados ni enzimas costosas.

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Los autores desean agradecer Tilman Borggrefe (Universidad de Giessen) para el dispositivo de sonicación para compartir amablemente. El trabajo de M.L.S. es apoyado por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, el sistema Cardio-pulmonar del grupo excelencia (ECCPS, EXC 147/2), la Deutsche Krebshilfe (111447) y el programa IMPRS-ELO de la sociedad Max-Planck.

1. día 1: Cultivo de células
<ol><li>Las células a analizar a la cantidad deseada de la cultura. Medios y condiciones de cultivo celular dependen de los tipos de células en investigación. Nota: En principio, cualquier célula eucariota es susceptible de un análisis de la accesibilidad de la cromatina por FAIRE. Para este experimento, se siembran las células de 4 x 106 HEK-293T en un plato de solo 10 cm en medio DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS y penicilina/estreptomicina de 1% (p/v) y se incubaron a 5% CO2 y 37 ° C por 24 h hasta que las células alcanzan confluencia de 70-80% (~ 8 x 10 6 células por plato).</li>
</ol>2. día 2: Entrecruzamiento de formaldehído y cosecha celular
PRECAUCIÓN: El formaldehído es altamente tóxico y debe utilizarse siempre bajo una campana de humos. Use ropa protectora (guantes y bata de laboratorio). Deseche los residuos adecuadamente.
<ol><li>Añadir formaldehído directamente al medio de cultivo celular en una campana de humos para alcanzar una concentración final de 1% (v/v) (270 μl de formaldehído al 37% (v/v) a 10 mL de medio de cultivo celular). Incubar 10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) y mató a las placas manualmente cada 2 minutos. Nota: El tiempo de reticulación puede ajustarse según el tipo de célula. Para la mayoría de líneas celulares, a 10 min de reticulación es adecuada. Para los tejidos, incubaciones más tiempo podrían ser necesario para permitir la fijación de todas las células.</li>
	<li>Añadir glicina a una concentración final de 0,125 M para saciar el formaldehído (Agregar 500 μl de un caldo de glicina de 2,5 M a 10 mL de medio de cultivo). Incubar por 5 min a temperatura ambiente y mató a cada 2 minutos.</li>
	<li>Lavar las células 3 x con PBS frío hielo (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L de Na2HPO4 · 2 H2O, 0.24 g/L KH2PO4, ajustar el pH a 7.4 con HCl o NaOH). Aspire el medio y lavar directamente en la placa de cultivo celular o matraz añadir 10 mL de PBS. Repita este paso dos veces, teniendo mucho cuidado en el caso de células ligeramente adherentes como HEK-293T. Añadir PBS cuidadosamente al lado del plato para evitar el desprendimiento de las células.</li>
	<li>Después del tercer lavado, resuspender las células en 1 mL de PBS frío hielo y transfiéralo a un tubo de reacción de 1,5 mL en hielo. Use un raspador celular para separar las células cuando es necesario. Nota: Cuando a partir de un material limitado, utilizar bajo tubos de unión al ADN para evitar pérdida de muestra durante el procedimiento.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 300 x g a 4 ° C en una centrífuga de mesa refrigerada. Deseche el sobrenadante aspirando cuidadosamente.</li>
</ol>3. lisis y la fragmentación de la cromatina de la célula
<ol><li>Resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón de lisis FAIRE (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 8.1, 10 μg/mL leupeptin, 10 μg/mL aprotinina, 2 mM PMSF) y resuspender las células mediante pipeteo con cuidado hacia arriba y abajo varias veces. Incubar por 20 min en hielo. Almacenar las muestras a-80 ° C en este paso si es necesario.</li>
	<li>Someter a ultrasonidos reticulado ADN para esquilar a un tamaño medio de 200-300 bp. La configuración específica del sonicador debe ser determinada para cada fuente de muestras y el dispositivo utilizado sonicación. En cualquier caso asegúrese de que el ADN es cortado eficientemente. Un paso de optimización para el corte de ADN se describe en paso 5.14. Enfriar las muestras en hielo durante la sonicación para evitar el calentamiento de la muestra.</li>
	<li>Centrifugue la muestra durante 15 minutos y 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción. Dividir las muestras en alícuotas μl 100. Almacenar las muestras a-80 ° C, si es necesario. Nota: El protocolo puede ser interrumpido en este punto.</li>
</ol>4. de reticulación de Control ADN
<ol><li>Tomar 100 μl alícuota del paso 3.4 invertir la reticulación y utilizarse como una referencia de ADN total. Añadir 10 μl de ARNasa A (10 mg/mL) e incubar 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 10 μl de proteinasa K (20 mg/mL). Utilizar un termo-bloque programable para incubar durante 4 h a 37 ° C y luego durante 6 h a 65 ° C a hienda las proteínas y a revertir las reticulaciones. Por último, mantenga las muestras a 4 ° C hasta que se reanude el protocolo y luego proceder al paso 5. Nota: Otros protocolos FAIRE utilizan muestras de cromatina de las células que no han sido reticulado como referencia, aboliendo así la necesidad de reticulación de11. El hecho de que estas muestras no son reticulado podría conducir a diferencias en la eficacia de la sonicación o en la estabilidad del ADN, por lo tanto, el uso total referencia de muestras de ADN que han sufrido el mismo procedimiento que las muestras de prueba es más preciso.</li>
</ol>5. día 3: Fenol: cloroformo purificación de ADN
<ol><li>Tomar no-de-reticulado alícuota del paso 3.4. Añadir 10 μl de ARNasa A (10 mg/mL) e incubar 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Tomar el paso de forma alícuota no del reticulado de 5.1 y la muestra de reticulado en el paso 4.2 y seguir en paralelo. Agregar H2O para llegar a un volumen final de 300 μl.</li>
	<li>Añadir 300 μL de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (25:24:1) en una campana de humos y agitar vigorosamente. PRECAUCIÓN: El fenol es corrosivo y tóxico y debe utilizarse siempre bajo una campana de humos. Usar ropa protectora (guantes y bata de laboratorio), asegúrese de que los tubos de reacción se cierran herméticamente y disponen los residuos adecuadamente.</li>
	<li>Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente transfiera 280 μl de la fase acuosa superior a un tubo de reacción nueva. Asegúrese de no tomar cualquier residuo de la interfase que contiene también proteínas. Descartar la fase inferior quedan como residuos de solventes orgánicos.</li>
	<li>Repita los pasos del 5.3 a 5.5 y cuidadosamente transfiera 270 μl de la fase acuosa superior a un tubo de reacción nueva.</li>
	<li>Agregar 270 μl de cloroformo en una campana de humos y agitar vigorosamente. Nota: Este paso se utiliza para eliminar cualquier fenol restante de la muestra.</li>
	<li>Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente transferir 250 μl de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción, teniendo cuidado de no para llevar cualquier residuo de la interfase. Descarte la muestra restante como residuos de solventes orgánicos.</li>
	<li>Añadir 25 μl de 5 M NaCl y 250 μl de isopropanol. Añadir 5 μl de glicógeno (20 mg/mL) como el portador de ADN. Mezclar bien por inversión del tubo los tubos e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C para precipitar el ADN.</li>
	<li>Lavar el pellet de ADN con 400 μL de etanol al 70% (v/v). Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante con cuidado y dejar el sedimento seco durante 10 min a temperatura ambiente. Resuspender en 100 μl de tampón TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Incubar la muestra de ADN libre de-reticulado de 4 h a 65 ° C para eliminar vínculos cruzados entre ADN. Almacenar las muestras a-20 ° C.</li>
	<li>Cuantificar la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro y ejecute una alícuota para comprobar el tamaño del fragmento en un gel de agarosa al 2% (w/v). Ajustar la esquila e intensidades, dependiendo de los resultados de lo análisis ADN por agarosa gel electroforesis para obtener un tamaño medio de 200-300 bp.</li>
</ol>6. determinación de libre Versus Total DNA por PCR en tiempo Real cuantitativa (qRT-PCR)
<ol><li>La proporción de ADN nucleosoma-libre (en el siguiente denominado ADN libre) versus total de ADN se determina por qRT-PCR17,18. Las muestras pueden analizarse cuantitativamente por microarray hibridación o secuenciación profunda para las determinaciones de genoma.</li>
	<li>Diseño de cartillas de qPCR para las regiones a ser probado y para los controles positivos y negativos. Nota: Los adecuados controles positivos son cartillas situados en el promotor de genes activamente transcritos limpieza como ACTB, GAPDH, TPI1 TUBA1A (codificación de GAPDH, TPI, β-actina y α-tubulina). Correspondientes controles negativos se encuentran en regiones de heterocromatina o gene desiertos. Otros controles negativos adecuados pueden diseñarse en regiones genómicas adyacentes al lugar geométrico regulado dinámicamente bajo investigación para controlar las diferencias de número de copia local (tabla 1).</li>
	<li>Diluir las muestras de ADN a una concentración final de 10 ng/μl con buffer TE y considerar el factor de dilución para los cálculos finales (ver paso 6.5).</li>
	<li>Establecer una reacción de qPCR en triplicado en una placa de 96 pozos, con la siguiente mezcla de reacción por pozo: plantilla ADN: 20 ng (2 μL), primer avance 200 nM (0,4 μL de un caldo de 5 μm), primer revés 200 nM (0,4 μL de un caldo de 5 μm) , comercial lista para usar la mezcla de reacción que contiene el tinte verde (5 μl de un stock de 2 x) y H2O a 10 μl.</li>
	<li>Ejecutar en un dispositivo de qPCR de tiempo real, usando el modo de cuantificación absoluta y determinar el TC de las muestras con los pares diferentes cartilla. Calcular el ratio de recuperación de DNA libre al DNA total para cada primer utilizando la siguiente fórmula, teniendo en cuenta los factores de dilución de paso 6.3: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq1.jpg"> Resultados representativos y un cálculo de ejemplo se dan en la tabla 2.</li>
	<li>Para compensar las diferencias entre las muestras, normalizar la relación de recuperación de control positivo: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

FAIRE es un método robusto y de bajo costo que permite la identificación de regiones libres de nucleosoma. Se basa en el principio de que el ADN envuelto alrededor de los nucleosomas puede ser fácilmente reticulado a las histonas. Una extracción de fenol: cloroformo se usa para separar el no reticulado y fragmentos de ADN libre de proteínas, el ADN unida a las proteínas, que se encuentra en la fase inferior de fenol y en cierta medida en la interfase (figura 1). Por lo tanto, las regiones libres de nucleosoma son representadas en la fracción de ADN libre en la fase acuosa. Varias publicaciones describen protocolos detallados de la FAIRE método23,24,25,26, que puede ser consultado para complementar el procedimiento descrito aquí.
Similar a otros métodos utilizados para determinar la estructura de la cromatina, el método FAIRE también críticamente depende de corte óptimo de la DNA. Si los fragmentos son demasiado largos, cualquier región libre de nucleosoma se enmascara por el ADN de la cromatina-limite adyacente. Si los fragmentos son demasiado pequeños, la detección por qPCR o secuenciación profunda resulta muy difícil. Por esta razón, la sonicación de la DNA es un parámetro crucial que debe ser controlado y optimizado para obtener fragmentos de alrededor de 200-300 longitud de bp, que representan 1-2 los nucleosomas (figura 4).
Otro parámetro que puede afectar el resultado final es el entrecruzamiento de la muestra. Aunque el procedimiento de fijación descrito aquí es válido para la mayoría de las líneas de la célula, el investigador debe evaluar cuidadosamente este paso de la muestra particular de estudio, especialmente cuando se utilizan los tejidos, donde tiempo de fijación puede ser necesario para permitir la formaldehído para llegar a las células en toda la muestra de tejido.
A diferencia de otros métodos, como la ADNasa I o hipersensibilidad de la nucleasa micrococcal, ChIP o ATAC, FAIRE no depende de una actividad enzimática o anticuerpos específicos, y por lo tanto no es necesario titulación o la optimización de las condiciones de reacción. Esto hace que FAIRE un método ideal para medir la accesibilidad de la cromatina para laboratorios con poca experiencia en el campo de la cromatina. Además, sólo son necesarios experimentos piloto para optimizar el paso de corte de ADN y el tiempo de reticulación, cuando sea necesario.
El método fue desarrollado inicialmente en levadura6, pero se ha extendido también a células de mamíferos. El ADN purificado con el método FAIRE puede utilizarse para secuenciación profunda, permitiendo la caracterización del genoma de la estado de cromatina. Esto ya ha demostrado ser útil en un número de estudios8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultados de experimentos de FAIRE-seq demuestran un traslapo grande con resultados obtenidos por otros métodos como la DNasa-seq14, aunque se presentan algunas diferencias. Esto es debido a las diferencias metodológicas, como por ejemplo nucleosomas relajados o remodelados todavía podrían obstaculizar el escote por la ADNasa I, mientras que estas regiones de ADN serían menos propensas a producir DNA/proteína reticulaciones y así estaría determinadas como nucleosoma-libre regiones con FAIRE9. Además, la presencia de proteínas no histonas como Polimerasas del RNA o proteínas lector de marcas epigenéticas podría resultar en DNA/proteína reticulaciones y así se interpretaría como regiones repleto de proteína en los experimentos FAIRE. Estas limitaciones son inherentes a cada método utilizado para la determinación del estado de cromatina, elevando así la necesidad de utilizar una combinación de diferentes métodos para obtener una visión integral.

El ADN genómico de las células eucariotas se embala firmemente en los nucleosomas, que debe ser eliminado o remodelado para permitir la interacción de otras proteínas con el ADN. La activación transcripcional de un gen por lo general conduce a una configuración más abierta de su estructura nucleosomal, particularmente en el nucleosoma + 11, para facilitar la transcripción por la polimerasa de ARN. También, las regiones reguladoras tales como promotores y enhancers someterse a cambios dinámicos en su accesibilidad de cromatina para permitir la interacción con modificadores de la cromatina y transcripción factores2. Varios acercamientos se han desarrollado para identificar estas regiones libres de nucleosoma. Estos incluyen la sensibilidad a las nucleasas como DNasa I3 o nucleasa micrococcal4, que sólo pueden acceder al ADN cuando no está bien envuelto alrededor de los nucleosomas. Otros métodos para la identificación de la cromatina abierta o ADN libre incluyen la integración mediada por la transposasa de elementos retrotransposable (ensayo de cromatina transposasa accesible, ATAC)5o la cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación utilizando anticuerpos contra las histonas. El método FAIRE no se basa en la capacidad de una enzima a la DNA o la Unión de un anticuerpo para una proteína particular, pero en cambio se basa en la purificación de regiones libres de nucleosoma por una extracción de fenol: cloroformo6,7. En este método, el ADN está covalentemente a las proteínas de la cromatina por el formaldehído agente de reticulación y luego es cortado a trozos pequeños por sonicación. Regiones de cromatina apretadas tendrá abundante reticulaciones del DNA/proteína, mientras que las regiones de ADN con pocos o ningún nucleosomas tendrán poco o nada reticulado complejos DNA/proteína. Una extracción de fenol: cloroformo permite la purificación de la no-reticulado ADN libre en la fase acuosa, mientras que el reticulado de ADN a las proteínas es capturado en la fase orgánica fenol o interfase acuosa orgánica junto con las proteínas. La cuantificación de este ADN libre en comparación con una referencia de la muestra total de DNA permite la identificación de las regiones libres de cromatina. El método FAIRE puede utilizarse para la caracterización de regiones genómicas individuales como se describe aquí, pero también es adecuado para la identificación de la accesibilidad de todo el genoma cromatina junto a secuenciación profunda tal como se describe en diferentes modelos8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultados obtenidos por otros métodos como ATAC-seq y FAIRE-seq solapan en gran medida14. El método FAIRE es un muy robusto, barato y fácil de realizar el método para identificar regiones libres de nucleosoma. A diferencia de otros métodos, no requiere de experiencias piloto para determinar el nivel adecuado de digestión como se requiere para las nucleasas (DNasa-seq, MNase-seq) o transposases (ATAC-seq) y discutido en detalle en una reciente revisión15. Los parámetros sólo ajustarse son condiciones de la sonicación y en algunos casos el tiempo de fijación. Este papel describe un protocolo simple que se muestra esquemáticamente en la figura 1 y que no requiere ningún equipo especial que no sea un sonicador. El protocolo se puede realizar en un tiempo razonablemente corto y hace FAIRE un método sencillo y confiable para probar la accesibilidad de la cromatina en un número de diversos tipos celulares que van desde células de pulmón11 a células primarias de ratón hígado16.

<table><tbody><tr><td>Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno, 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1162B</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K, 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A, 10 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>milliTUBE 1 ml AFA Fibra</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td></td></tr><tr><td>Soporte milliTUBE 1ml</td><td>Covaris</td><td>500371</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 Ultrasonido focalizado</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus</td><td>Biosistems aplicados</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Expresión génica apropiada en respuesta a señales extracelulares, es decir, tejido-linaje-específicas y gene transcripción críticamente depende de Estados altamente definidos de organización de la cromatina. La arquitectura dinámica del núcleo es controlada por múltiples mecanismos y formas de los programas de salida transcripcional. Por lo tanto, es importante determinar la accesibilidad de la cromatina de locus específico de manera confiable que sea preferiblemente independiente de anticuerpos, que pueden ser una fuente potencial de confusión de la variabilidad experimental. Accesibilidad de cromatina se puede medir por varios métodos, incluyendo el ensayo de aislamiento Formaldehyde-Assisted de elementos regulatorios (FAIRE), que permiten la determinación de la accesibilidad general de la cromatina en un número relativamente bajo de células. Aquí se describe un protocolo FAIRE que permite simple, fiable y rápida identificación de regiones genómicas con una ocupación baja en proteínas. En este método, el ADN es covalente enlazado a las proteínas de la cromatina mediante formaldehído como agente de reticulación y cortado a trozos pequeños. El ADN libre se enriquece luego con extracción de fenol: cloroformo. La proporción de DNA libre se determina por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o secuencia de la DNA (DNA-seq) en comparación con una muestra de control que representa el ADN total. Las regiones con una estructura más flexible de la cromatina están enriquecidas en la muestra de ADN libre, permitiendo la identificación de regiones genómicas con menor compactación de la cromatina.

Hemos utilizado el método FAIRE medir diferencias en la accesibilidad de la cromatina de los genes de MHC clase II en células HEK293T publicado19. Codificación genes de MHC clase II se expresan en antígeno que presenta las células (APCs), ya sea constitutivamente o en respuesta a citoquinas señalización20. La expresión de MHCII genes es conducida por un complejo activador que se une a elementos específicos de ADN, llamados cajas de XY, situadas en el promotor y los promotores de estos genes21,22. Esto se refleja en el nivel de la cromatina, según lo revelado por nuestro análisis de la Feria de las regiones de los genes de MHC clase II HLA-DPB1 y HLA-DMA. Estos experimentos demostraron que la cromatina está abierta en las regiones que abarca las cajas XY, mientras que es más compacto en los órganos de la gene (figura 2).
Por ejemplo, para los cálculos, en este experimento particular, hemos diluido el total muestra de ADN 10 veces (factor de dilución 10), y no se diluyó la muestra de ADN libre (factor de dilución 1) para la qRT-PCR. El Cts obtenidos para las diferentes regiones probadas y los cálculos para obtener los ratios de recuperación final y ratios de recuperación relativa se enumeran en tabla 2. Estos ratios de recuperación relativa se obtuvieron usando el promotor ACTB como control positivo. Tenga en cuenta que estos cálculos son una de las repeticiones para generar los resultados mostrados en la figura 2.
En un contexto diferente, accesibilidad de cromatina se probó en un modelo de expresión génica inducible. En este caso, se midieron los cambios rápidos de compactación de la cromatina en respuesta al estímulos proinflamatorios tumor necrosis factor (TNF). Las células HeLa fueron dejadas sin tratar o estimuladas con TNF durante 1 h, seguido de FAIRE para medir la compactación de la cromatina en la expresión control de promotor región del gene que codificaba el TNF-responsivo cytokine interleukin 8 (IL8). Estos resultados mostraron una accesibilidad de cromatina fuertemente creciente en el promotor de IL8 TNF estimula células (figura 3). La accesibilidad en el promotor de IL-8 después de la estimulación de TNF es aún mayor que la encontrada en el promotor ACTB mostrando una remodelación de cromatina dramática en esta región reguladora. Como el coeficiente de recuperación obtenido en este caso es mayor que la obtenida en la región utilizada como control positivo (promotor ACTB) el ratio de recuperación relativa es mayor que uno.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo de FAIRE la. Las células son reticulado directamente en el frasco de cultivo celular o plato mediante la adición de formaldehído (A). Después de apagar del formaldehído, células se lavaron tres veces con PBS frío de hielo (B) y transfirió a un tubo de reacción donde se resuspendió en buffer de lisis FAIRE y se sonicó para distorsionar el ADN (C). Una alícuota de la cromatina extraída es de reticulado por calentamiento a 65 ° C, para obtener la referencia de ADN total (D), y luego el ADN libre se extrae con fenol: cloroformo del reticulado y las alícuotas de reticulado (E). Finalmente, se cuantificó el ADN, y calcula el cociente de libre vs total que ADN es (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig2.jpg"> Figura 2: determinación de la accesibilidad de la cromatina en el gen MHC clase II se agrupan en células HEK293T. Se analizaron las células HEK293T por FAIRE. La relación entre libre versus ADN total (es decir., la relación de recuperación relativa) se determinó para el promotor del gen ACTB como control positivo, una región de heterocromatina en Chr. 12 como control negativo y las regiones reguladoras y cuerpos de gene del MHC genes de clase II HLA-DMA y HLA-DPB1. La parte superior muestra una representación esquemática del lugar geométrico y las posiciones de los cebadores. Barras de error representan desviaciones estándar de dos réplicas biológicas medidos en triplicado. Se modificó la figura de un informe publicado19. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig3.jpg"> Figura 3: cambios de accesibilidad del DNA en el promotor de IL8 en respuesta al TNF tratamiento. Las células HeLa fueron estimuladas con TNF (20 ng/mL) durante 1 h y analizados por FAIRE. La relación entre libre versus total de ADN se determinó para el promotor de la ACTB (control positivo), una región de heterocromatina en Chr. 12 (control negativo) y el promotor de la IL8. Barras de error representan los errores estándar de la media (SEM) de tres réplicas biológicas medidos por duplicado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig4.jpg"> Figura 4: optimización de las condiciones de sonicación. Extraído de células 293T de cromatina se sonified utilizando un sonicador centrado con tubos adecuados (Tabla de materiales). La cromatina fue sonicada durante el tiempo indicado con repeticiones de 30 s con los siguientes parámetros: potencia máxima 150, factor de servicio 15, completa un ciclo por ráfaga 500, seguido por 30 s: potencia de pico 2.5, factor de servicio 15, ciclos por explosión 500. La cromatina resultante fue de-reticulado, purificado por extracción con fenol: cloroformo y cargan en un gel de agarosa al 2%. Se muestra un tinción gel de bromuro de etidio, y las posiciones de los marcadores de peso molecular están indicadas en bp. En este experimento, el tamaño óptimo de la cromatina (200-300 bp) se obtuvo después de 20 min de sonicación. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cartilla de</td>
			<td>Secuencia de</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-promotor-F</td>
			<td>AAAGGCAACTTTCGGAACGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-promotor-R</td>
			<td>TTCCTCAATCTCGCTCTCGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Control negativo de Chr. 12-F</td>
			<td>ATGGTTGCCACTGGGGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Control negativo de Chr. 12-R</td>
			<td>TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-caja-F</td>
			<td>CATCAGTCACTGGGGAGACG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-caja-R</td>
			<td>GCTTCCCAGCCCAGTTACAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-F</td>
			<td>GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-R</td>
			<td>AGCTGCTATGTGTGGTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-F</td>
			<td>TGGGGACCTAGTTAGGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-R</td>
			<td>AGATCCATGGGAGGAGGCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-caja-F</td>
			<td>GTCCAATCCCAGGGTCACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-caja-R</td>
			<td>TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-F</td>
			<td>GCGTGTTCATGTCTGCATCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-R</td>
			<td>TGATCCTCAGAGCCTGGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-F</td>
			<td>CCAGCCTAGGGTGAATGTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-R</td>
			<td>GCCTGGGTAGAAATCCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promotor-F</td>
			<td>GTGATGACTCAGGTTTGCCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promotor-R</td>
			<td>CTTATGGAGTGCTCCGGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Cartillas para qPCR.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272table2.jpg"> Tabla 2: cálculos de ejemplo de Ratios de recuperación relativa de FAIRE. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/Table_2.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La plasticidad de la arquitectura nuclear es controlada por mecanismos epigenéticos dinámicos incluyendo no-codificación RNAs, ADN metilación, nucleosoma reposicionamiento como histona composición y modificación. Aquí se describe un protocolo de aislamiento Formaldehyde-Assisted de elementos regulatorios (FAIRE) que permite la determinación de la accesibilidad de la cromatina de forma reproducible, barata y sencilla.

Formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

El objetivo general de este experimento es determinar la accesibilidad de la cromatina a un locus genético mediante la reticulación covalente del ADN con las proteínas asociadas, seguido de la purificación y cuantificación del ADN libre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cromatina, ya que se puede determinar la accesibilidad del ADN, independientemente del tipo de célula en las células no tratadas y también en las células en proceso de remodelación de la cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de enzimas para escindir el ADN o los anticuerpos que deben valorarse para cada entorno experimental.Este protocolo tiene la ventaja adicional de que no requiere ningún equipo especial que no sea un Sonicator. Para demostrar el procedimiento, Olesja Ritter y Tabea Riedlinger, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar el protocolo, agregue formaldehído directamente al medio de crecimiento de las células que se sembraron un día antes, para alcanzar una concentración final de 1% volumen por volumen.Incubar el medio durante 10 minutos a temperatura ambiente y girar las placas manualmente cada dos minutos. A continuación, agregue glicina hasta una concentración final de 0,125 molar para apagar el formaldehído. Incubar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente y girarla cada dos minutos.Aspire el medio y luego agregue con cuidado PBS helado a un lado del plato para lavar las celdas. Aspire el medio y repita cuidadosamente el lavado dos veces. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS helado y use un raspador de células para separar las celdas, si es necesario.Transfiérelos a un tubo de reacción de 1,5 mililitros sobre hielo. Centrifugar las células durante cinco minutos a 300 g y cuatro grados centígrados en una centrífuga de mesa refrigerada. Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet de celda en un mililitro de tampón de lisis FAIRE pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar las células durante 20 minutos en hielo. Después de la incubación, sonicar el ADN reticulado para compartirlo con un tamaño medio de 200 a 300 pares de bases y enfriar las muestras durante la sonicación para evitar el calentamiento de la muestra.La fragmentación del ADN es fundamental para este experimento, ya que el tamaño de los fragmentos afecta a la sensibilidad de la solución de toda la técnica, por lo que es importante establecer cuidadosamente las condiciones de sonicación de antemano y comprobar el tamaño de los fragmentos de cromatina en cada experimento. Centrifugar la muestra durante 15 minutos y 13.000 g a cuatro grados centígrados. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción.Divide las muestras en alícuotas de 100 microlitros. Utilice una alícuota de 100 microlitros para revertir el enlace cruzado y se utilizará como referencia para el ADN total. Añadir 10 microlitros de RNasa A e incubar la muestra durante una hora a 37 grados centígrados.A continuación, agregue 10 microlitros de proteinasa K. Utilice un termobloque programable para incubar la muestra durante cuatro horas a 37 grados centígrados y luego durante seis horas a 65 grados centígrados para escindir las proteínas e invertir los enlaces cruzados. Obtener una nueva alícuota de 100 microlitros, añadir 10 microlitros de RNasa A e incubar la muestra durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, proceda con la muestra no reticulada y la muestra reticulada de la sección anterior en paralelo.Añadir H2O hasta alcanzar un volumen final de 300 microlitros. A continuación, añada 300 microlitros de alcohol fenol cloroformo isoamílico en una campana extractora y en un vórtice vigoroso. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 13.000 g y cuatro grados centígrados.A continuación, transfiera con cuidado 280 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción. Asegúrese de no tomar ningún residuo de la interfase, que también contiene proteínas, y deseche la fase inferior restante como residuo de solvente orgánico. Repita el tratamiento y transfiera con cuidado 270 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción.Agregue 270 microlitros de cloroformo en una campana extractora y haga un vórtice vigoroso. Centrifugar la muestra. Después de la centrifugación, transfiera con cuidado 250 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción, teniendo cuidado de no arrastrar ningún residuo de la interfase.Deseche la muestra restante como residuo de solvente orgánico. A continuación, se añaden 25 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, 250 microlitros de isopropanol y se añaden cinco microlitros de glucógeno como portador del ADN. Invierta los tubos e incubelos a temperatura ambiente.Después de la incubación, centrifugar la muestra para precipitar el ADN. A continuación, lave el pellet de ADN con 400 microlitros de etanol al 70% volumen por volumen y centrifugue la muestra. Aspire el sobrenadante con cuidado y deje secar el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente.Una vez que el pellet esté seco, vuelva a suspenderlo en 100 microlitros de tampón TE. Incubar la muestra de ADN libre no reticulada durante cuatro horas a 65 grados Celsius para eliminar los enlaces cruzados entre ADN. Por último, se cuantifica la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro y se ejecuta una pequeña alícuota para comprobar el tamaño del fragmento en un gel de agarosa del 2% en peso por volumen.Las células HeLA se estimularon con TNF durante una hora y se analizaron mediante FAIRE. Se determinó la relación entre el ADN libre y el total para el promotor de ACTB, el gen que codifica la beta-actina y el control positivo, una región de heterocromatina en el cromosoma 12, el control negativo y el promotor de IL8. Se generó un gel teñido de bromuro de etidio con diferentes tiempos de sonicación e indica que el tamaño óptimo de cromatina de 200 a 300 pares de bases se obtuvo después de 20 minutos de sonicación.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación profunda, para determinar la accesibilidad de la cromatina a nivel de todo el genoma. No olvide que trabajar con formaldehído y cloroformo de fenol puede ser extremadamente peligroso y se deben garantizar precauciones como trabajar en una campana extractora, usar guantes y eliminar adecuadamente los desechos al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

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Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

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Formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos

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