Formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos
2 de abril de 2018
La plasticidad de la arquitectura nuclear es controlada por mecanismos epigenéticos dinámicos incluyendo no-codificación RNAs, ADN metilación, nucleosoma reposicionamiento como histona composición y modificación. Aquí se describe un protocolo de aislamiento Formaldehyde-Assisted de elementos regulatorios (FAIRE) que permite la determinación de la accesibilidad de la cromatina de forma reproducible, barata y sencilla.
El objetivo general de este experimento es determinar la accesibilidad de la cromatina a un locus genético mediante la reticulación covalente del ADN con las proteínas asociadas, seguido de la purificación y cuantificación del ADN libre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cromatina, ya que se puede determinar la accesibilidad del ADN, independientemente del tipo de célula en las células no tratadas y también en las células en proceso de remodelación de la cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de enzimas para escindir el ADN o los anticuerpos que deben valorarse para cada entorno experimental.
Este protocolo tiene la ventaja adicional de que no requiere ningún equipo especial que no sea un Sonicator. Para demostrar el procedimiento, Olesja Ritter y Tabea Riedlinger, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar el protocolo, agregue formaldehído directamente al medio de crecimiento de las células que se sembraron un día antes, para alcanzar una concentración final de 1% volumen por volumen.
Incubar el medio durante 10 minutos a temperatura ambiente y girar las placas manualmente cada dos minutos. A continuación, agregue glicina hasta una concentración final de 0,125 molar para apagar el formaldehído. Incubar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente y girarla cada dos minutos.
Aspire el medio y luego agregue con cuidado PBS helado a un lado del plato para lavar las celdas. Aspire el medio y repita cuidadosamente el lavado dos veces. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS helado y use un raspador de células para separar las celdas, si es necesario.
Transfiérelos a un tubo de reacción de 1,5 mililitros sobre hielo. Centrifugar las células durante cinco minutos a 300 g y cuatro grados centígrados en una centrífuga de mesa refrigerada. Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet de celda en un mililitro de tampón de lisis FAIRE pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar las células durante 20 minutos en hielo. Después de la incubación, sonicar el ADN reticulado para compartirlo con un tamaño medio de 200 a 300 pares de bases y enfriar las muestras durante la sonicación para evitar el calentamiento de la muestra.
La fragmentación del ADN es fundamental para este experimento, ya que el tamaño de los fragmentos afecta a la sensibilidad de la solución de toda la técnica, por lo que es importante establecer cuidadosamente las condiciones de sonicación de antemano y comprobar el tamaño de los fragmentos de cromatina en cada experimento. Centrifugar la muestra durante 15 minutos y 13.000 g a cuatro grados centígrados. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción.
Divide las muestras en alícuotas de 100 microlitros. Utilice una alícuota de 100 microlitros para revertir el enlace cruzado y se utilizará como referencia para el ADN total. Añadir 10 microlitros de RNasa A e incubar la muestra durante una hora a 37 grados centígrados.
A continuación, agregue 10 microlitros de proteinasa K. Utilice un termobloque programable para incubar la muestra durante cuatro horas a 37 grados centígrados y luego durante seis horas a 65 grados centígrados para escindir las proteínas e invertir los enlaces cruzados. Obtener una nueva alícuota de 100 microlitros, añadir 10 microlitros de RNasa A e incubar la muestra durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, proceda con la muestra no reticulada y la muestra reticulada de la sección anterior en paralelo.
Añadir H2O hasta alcanzar un volumen final de 300 microlitros. A continuación, añada 300 microlitros de alcohol fenol cloroformo isoamílico en una campana extractora y en un vórtice vigoroso. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 13.000 g y cuatro grados centígrados.
A continuación, transfiera con cuidado 280 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción. Asegúrese de no tomar ningún residuo de la interfase, que también contiene proteínas, y deseche la fase inferior restante como residuo de solvente orgánico. Repita el tratamiento y transfiera con cuidado 270 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción.
Agregue 270 microlitros de cloroformo en una campana extractora y haga un vórtice vigoroso. Centrifugar la muestra. Después de la centrifugación, transfiera con cuidado 250 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción, teniendo cuidado de no arrastrar ningún residuo de la interfase.
Deseche la muestra restante como residuo de solvente orgánico. A continuación, se añaden 25 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, 250 microlitros de isopropanol y se añaden cinco microlitros de glucógeno como portador del ADN. Invierta los tubos e incubelos a temperatura ambiente.
Después de la incubación, centrifugar la muestra para precipitar el ADN. A continuación, lave el pellet de ADN con 400 microlitros de etanol al 70% volumen por volumen y centrifugue la muestra. Aspire el sobrenadante con cuidado y deje secar el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Una vez que el pellet esté seco, vuelva a suspenderlo en 100 microlitros de tampón TE. Incubar la muestra de ADN libre no reticulada durante cuatro horas a 65 grados Celsius para eliminar los enlaces cruzados entre ADN. Por último, se cuantifica la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro y se ejecuta una pequeña alícuota para comprobar el tamaño del fragmento en un gel de agarosa del 2% en peso por volumen.
Las células HeLA se estimularon con TNF durante una hora y se analizaron mediante FAIRE. Se determinó la relación entre el ADN libre y el total para el promotor de ACTB, el gen que codifica la beta-actina y el control positivo, una región de heterocromatina en el cromosoma 12, el control negativo y el promotor de IL8. Se generó un gel teñido de bromuro de etidio con diferentes tiempos de sonicación e indica que el tamaño óptimo de cromatina de 200 a 300 pares de bases se obtuvo después de 20 minutos de sonicación.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación profunda, para determinar la accesibilidad de la cromatina a nivel de todo el genoma. No olvide que trabajar con formaldehído y cloroformo de fenol puede ser extremadamente peligroso y se deben garantizar precauciones como trabajar en una campana extractora, usar guantes y eliminar adecuadamente los desechos al realizar este procedimiento.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para determinar la accesibilidad de la cromatina utilizando el método de Aislamiento Asistido por Formaldehído de Elementos Reguladores (FAIRE). La técnica es sencilla, reproducible y no requiere equipo especializado.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Epigenética
- Biología de la cromatina
Antecedentes
- La accesibilidad de la cromatina es fundamental para comprender la regulación génica.
- Los mecanismos epigenéticos dinámicos influyen en la arquitectura nuclear.
- Los ARN no codificantes, la metilación del ADN y las modificaciones de histonas desempeñan roles importantes.
- El protocolo FAIRE permite el análisis de la estructura de la cromatina en diversos tipos celulares.
Objetivo del estudio
- Determinar la accesibilidad de la cromatina en loci genéticos específicos.
- Proporcionar un método confiable para estudiar la dinámica de la cromatina.
- Facilitar análisis genómicos adicionales tras la evaluación de la accesibilidad de la cromatina.
Métodos Utilizados
- Retroligación covalente del ADN a proteínas asociadas utilizando formaldehído.
- Purificación y cuantificación del ADN libre.
- Sonicación para fragmentar el ADN a tamaños óptimos para el análisis.
- Uso de la extracción con fenol-cloroformo para purificar muestras de ADN.
Resultados principales
- Determinación exitosa de la accesibilidad de la cromatina en células HeLa.
- Las condiciones óptimas de sonicación producen fragmentos de ADN de 200-300 pares de bases.
- Comparación de las proporciones de ADN libre frente a ADN total en promotores génicos específicos.
- Demuestra la aplicabilidad del método a diversos entornos experimentales.
Conclusiones
- El protocolo FAIRE es una herramienta valiosa para estudiar la accesibilidad de la cromatina.
- Puede realizarse sin equipo especializado y es rentable.
- Otras aplicaciones incluyen la secuenciación profunda para el análisis de cromatina a nivel del genoma completo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición confiable de la accesibilidad de la cromatina es fundamental para la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en estudios de regulación génica. El protocolo FAIRE permite una evaluación cuantitativa independiente de anticuerpos de los estados de cromatina en loci específicos, lo que respalda la confianza predictiva en los flujos de trabajo de descubrimiento y cribado. Su simplicidad operativa y reproducibilidad facilitan su integración en líneas de investigación y desarrollo a gran escala para estudios epigenéticos y transcripcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la accesibilidad de la cromatina en loci genéticos específicos para aclarar los mecanismos reguladores.
- Apoya la validación funcional de dianas al distinguir entre regiones de cromatina abiertas y compactadas, sin sesgo por anticuerpos.
- Facilita la eliminación de riesgos mecanicistas al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles sobre el estado de la cromatina en diferentes tipos celulares y condiciones.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara perfiles validados de accesibilidad de la cromatina para ensayos posteriores basados en qPCR o secuenciación.
- Normaliza la medición del estado de la cromatina, reduce la variabilidad experimental y mejora la reproducibilidad.
- Permite flujos de trabajo escalables y independientes de la plataforma para cribados de compuestos o perturbaciones genéticas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea datos de accesibilidad de la cromatina con modelos de regulación génica relevantes para enfermedades cuando se aplica a sistemas celulares pertinentes.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir perfiles de cromatina a nivel del genoma completo o específicos de un locus.
- Proporciona información mecanicista sobre la regulación transcripcional para tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El protocolo FAIRE se integra en la continuación desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la interrogación de cromatina basada en hipótesis y apoyando los flujos de trabajo de identificación y validación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la apertura de la cromatina para probar hipótesis regulatorias y aclarar los mecanismos de control génico.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles sobre la accesibilidad de la cromatina, adecuados para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece ratios de rendimiento de ADN y datos sobre el tamaño de fragmentos para comparaciones estadísticas robustas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la continuidad mecanicista cuando se aplica a modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado e independiente de anticuerpos, adaptable a diversos tipos celulares y entornos experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los estudios de regulación génica y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante protocolos estandarizados que requieren poco equipo.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al proporcionar datos sólidos sobre el estado de la cromatina desde las primeras etapas del proceso.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de objetivos epigenéticos y transcripcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de la cromatina y análisis de PCR cuantitativa o secuenciación.
- Necesita acceso a un sonicador e instrumentación estándar de biología molecular.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos de los parámetros de sonicación y extracción para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos tipos de células de mamíferos y condiciones experimentales mediante la optimización del protocolo.
- Las precauciones de seguridad son esenciales debido al uso de reactivos peligrosos como el formaldehído y la mezcla fenol-cloroformo.
