Name: La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende el ensayo Lambda Select cII para evaluar mutagenicidad en células de roedores transgénicos expuestos a agentes químicos y físicos. Este método permite determinar la potencia mutagénica y analizar mutaciones específicas de secuencia.

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Nos gustaría reconocer la contribución de todos los colegas y colaboradores para nuestros estudios originales, cuyos resultados se han descrito en este manuscrito (con fines ilustrativos). Trabajo de los autores es apoyado por becas del Instituto Nacional de odontología e investigación craneofacial de los institutos nacionales de salud (1R01DE026043) AB y de la Universidad de California Tobacco-Related programa de investigación de la enfermedad para () AB TRDRP-26IR-0015) y ST (TRDRP-25IP-0001). Los patrocinadores del estudio no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos, análisis de datos, interpretación de datos, escritura del informe, o en la decisión de enviar para su publicación.

1. genómica ADN aislado de fibroblastos embrionarios de ratón
Nota: Los fibroblastos embrionarios de ratón primario son aislados de embriones derivados de ratones transgénicos de BB con fondo genético C57BL/6, según el protocolo publicado53. El material de partida de este protocolo consiste en 1 x 106 a 1 x 107 células de fibroblasto embrionario tratadas con un test compuesto versus control. La recolección y recuento de estas células mediante métodos estándar se describen en referencias10,54,55.
<ol><li>Preparación de buffer una (0,3 M sacarosa, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM espermidina, espermina de 0,15 mM y 2 mM EDTA), tampón B (150 mM de NaCl y 5 mM EDTA, pH 7.8) y el tampón C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 NaCl de 20 mM, 20 mM EDTA y 1% SDS) anticipación y reserva a temperatura ambiente (RT) por hasta un año54,55.</li>
	<li>Resuspender las células en 2 – 4 mL de tampón en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL por pipetear repetidamente arriba y abajo utilizando una amplia llevaba 1.000 μl Punta de pipeta.</li>
	<li>Añadir un volumen (2-4 mL) buffer A contiene 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (p. ej., Nonidet P40) usando una pipeta serológica de vidrio.</li>
	<li>Incubar el tubo en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 min a TA.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y lavar el sedimento con 10-15 mL de tampón de un utilizando una pipeta serológica de vidrio.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 2 – 4 mL de tampón B.</li>
	<li>Añadir un volumen (2-4 mL) buffer C contiene 600 μg/mL proteinasa K.</li>
	<li>Incubar el tubo durante 3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir Rnasa A para una concentración final de 100 μg/mL.</li>
	<li>Incubar el tubo por un adicional 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir un fenol de volumen (2-4 mL) (saturado en 0.1 M Tris-HCl, pH 8,0) alcohol:chloroform:isoamyl (25:24:1 vol/vol). Nota: Fenol puede suponer un peligro para la salud graves y debe manipularse con extrema precaución. Fenol es altamente corrosivo a la piel y fácilmente absorbido a través de él y exhibe otros efectos. Cuando manejo fenol, utiliza siempre guantes dobles, usar gafas protectoras y trabajar en una campana de humos químicos.</li>
	<li>Mezclar bien invirtiendo el tubo por 5 min en un agitador de tubo a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Retirar la fase acuosa (capa superior) a un nuevo tubo con una pipeta serológica de vidrio.</li>
	<li>Repita la extracción de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico 1 a 3 veces hasta que la fase acuosa es claro y la interfaz no es turbia.</li>
	<li>Agregar acetato de sodio 1/10 volumen (200-400 μL) de 3 M pH 5.2.</li>
	<li>Agregue 2.5 volumen (5-10 mL) 100% de etanol (frío) e invertir el tubo suavemente a mano durante 2-3 minutos.</li>
	<li>Carrete el ADN con un gancho de vidrio y transferir a un tubo nuevo con 1 – 5 mL 70% etanol y lave bien. Por otra parte, centrifugar el tubo a alta velocidad (3.500 x g) a 4 ° C de la pelotilla de la DNA y lavar completamente con 1 – 5 mL 70% etanol.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a alta velocidad (3.500 x g) a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante y secar el ADN durante 10-15 minutos.</li>
	<li>Disolver el ADN en 10 – 100 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) y almacenar a 4 ° C (para el almacenaje corto de un mes) o a-20 ° C (para el período de almacenamiento de información). La concentración óptima de ADN para el análisis de selección cII λ es 0,5 – 1,0 μg/μl (en tampón TE)56.</li>
</ol>2. la reacción in Vitro envases
<ol><li>Por una reacción de empaquetado, añadir ~ 5 μg de ADN genómico (volumen final: 8 – 12 μl de ADN genómico fue aislado en la sección 1 del ratón embrionario fibroblastos tratados en vitro con una sustancia de ensayo o control) a un tubo de microcentrífuga con el primero mezcla de reacción (~ 10 μl). Nota: Preparado en casa o comercialmente disponible λ empaquetado extractos se usan en diferentes laboratorios. En el embalaje comercial kit de extracto utilizado aquí56 (véase la Tabla de materiales), tubos rojo figuran la primera mezcla de reacción (~ 10 μl) y tubos de azul la segunda mezcla de reacción (~ 70 μl para las reacciones de al menos 5).</li>
	<li>Incubar el tubo durante 90 minutos a 30 ° C.</li>
	<li>Añadir el volumen requerido (~ 12 μL) de la segunda mezcla de reacción en el tubo.</li>
	<li>Incubar el tubo durante un adicional 90 minutos a 30 ° C.</li>
	<li>
Añadir 1,1 mL de tampón SM al tubo. Nota: 1 mL de esta solución (es decir, mezcla de la reacción de empaquetado) se utilizará para la detección del λ cII-mutantes. El resto se utilizará para titering.<ol>
<li>Preparar el tampón SM mezclando 5,8 g de NaCl, 2,0 g de MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) y 5 mL 2% (w/v) de gelatina. Añadir dH2O a un volumen final de 1 litro, autoclave por 30 min tienda a temperatura ambiente hasta por 1 año.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vórtice el tubo que contiene la muestra de ADN empaquetada para 10 s en RT (Vortex vigoroso).</li>
	<li>Pulso girar el tubo en una microcentrífuga y tienda en hielo hasta que esté listo para usar. Si la muestra no va a ser usado el mismo día de envasado, añada 50 μl de cloroformo de ADN empaquetado por mL de la muestra, vortex y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas.</li>
</ol>3. preparación del cultivo bacteriano de e. coli G1250
<ol><li>
Por lo menos dos días antes de la galjanoplastia, hacer unas placas de raya bacteriana de Escherichia coli (e. coli) G1250 en placas de agar kanamicina TB1.
	<ol>
<li>Preparar placas de agar kanamicina TB1 como sigue. Mezclar el agar NaCl 10,0 g peptona de caseína y 12,0 g 5,0 g. Agregar clorhidrato de tiamina de 800 mL dH2O. Añadir 1 mL de 0,1%. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH o HCl. agregar dH2O hasta un volumen final de 1 litro.</li>
		<li>Mezclar bien y autoclave durante 30 minutos dejar enfriar a 55 ° C. Añadir 50,0 mg kanamicina y mezclar. Vierta en platos de petri de 100 mm estériles (20 – 25 mL por caja). Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las placas bacterianas racha en una incubadora estacionaria 30 ° C durante al menos 24 h.</li>
	<li>
Un día antes de la galjanoplastia, combinar 10 mL de medio líquido TB1 con 100 μl de solución al 20% (w/v) maltosa 1 M MgSO4 en un tubo cónico estéril 50 mL tapa a rosca.
	<ol>
<li>Preparación de medio líquido TB1 como sigue. Mezcla 5.0g NaCl peptona de caseína 10,0 g, añadir 800 mL dH2O, clorhidrato de tiamina de 0.1% 1 mL y ajustar el pH a 7.0 con NaOH o HCl. DH2O agregar a un volumen final de 1 litro, mezcla bien y autoclave por 30 min almacenan el medio a temperatura ambiente hasta por tres meses.</li>
		<li>Preparar como sigue 20% (p/v) de maltosa 1 M MgSO4 . Mezcla de 20,0 g maltosa y 24,6 g de MgSO4. 7H2O, luego añadir dH2O a un volumen final de 100 mL. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C hasta por 6 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular el medio líquido con varias colonias de la placa bacteriana racha utilizando un bucle inoculación estéril56.</li>
	<li>Incubar el cultivo líquido durante la noche en a 30 ° C agitando la incubadora con agitación vigorosa (250 – 300 rpm).</li>
	<li>En el día de la galjanoplastia, centrifugar el tubo cónico que contiene el cultivo líquido G1250 a 1.500 x g por 10 min a temperatura ambiente para que sedimenten las células bacterianas.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de 10 mM de MgSO4.</li>
	<li>Medir la absorbancia de un 1:10 dilución de la suspensión celular en longitud de onda 600 nm utilizando un UV-Vis espectrofotómetro (p. ej., 100 μl célula suspensión + 900 μl 10 mM MgSO4)56.</li>
	<li>Diluir la suspensión celular a un final de OD600 0.5 con 10 mM MgSO4. La suspensión preparada de G1250 e. coli con OD600 = 0.5 se conoce como 'la cultura de la galjanoplastia de G1250'.</li>
	<li>Almacene la cultura de la galjanoplastia G1250 en hielo y use dentro de 1-2 h.</li>
</ol>4. las muestras de ADN empaquetada de la galjanoplastia
<ol><li>
Por una muestra de ADN empaquetada, preparar dieciséis tubos de fondo redondo de2 estériles 14 x 100 mm y dieciséis placas de agar TB1. Diez de cada sistema se utilizará para investigación y seis para titering (tres por título 20) y tres de título 100.
	<ol>
<li>Preparar placas de agar TB1 como sigue. Mezcla 5.0g NaCl y peptona de caseína 10,0 g 12,0 g Agar, añaden 800 mL dH2O y el clorhidrato de tiamina de 0.1% 1 mL. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH o HCl y añadir dH2O a un volumen final de 1 L.</li>
		<li>Mezclar bien y autoclave durante 30 minutos deje que la mezcla se enfríe a 55 ° C, luego verter en placas de Petri estériles de 100 mm (20 – 25 mL por caja). Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas. Nota: Las placas de agar TB1 deben estar preparadas por lo menos 24 horas antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alícuotas de 200 μL de la cultura de la galjanoplastia G1250 en cada tubo de fondo redondo.</li>
	<li>
Para titering, hacer una dilución 1: 100 de la muestra de ADN empaquetada y mezclar bien todo con un vórtex (es decir, 10 μl empacados muestra de ADN + 990 μl de tampón de SM).</li>
	<li>Añadir 20 μl de la dilución 1: 100 a cada uno de los tres tubos del título 20.</li>
	<li>Añadir 100 μl de la dilución 1: 100 a cada uno de los tres tubos de título 100.</li>
	<li>
Para la detección, añada 100 μl de la 'sin diluir ' empacada muestra de ADN a cada uno de los tubos de la proyección de diez.</li>
	<li>Procesar todos los titering y proyección de tubos (tubos de 2 x 3 + 10 = 16), como sigue: mezclar bien todo con un vórtex para aproximadamente 10 s y luego incubar a temperatura ambiente durante 30 min permitir que el host de e. coli para los phages.</li>
	<li>
Añadir 2,5 mL microondas TB1 fundido top agar (enfriado a 55 ° C) para cada título o proyección tubo, mezclar inmediatamente con un vórtex (suavemente), y verter en el título correspondiente o proyección de las placas de agar TB1.
	<ol>
<li>Preparar el agar superior TB1 como sigue. Mezcla 5.0g NaCl y peptona de caseína 10,0 g 7,0 g Agar, agregar clorhidrato de tiamina de 800 mL dH2O. Añadir 1 mL de 0,1% continuación, ajustan el pH a 7.0 con NaOH o HCl. Por último, añadir dH2O a un volumen final de 1 litro.</li>
		<li>Mezclar bien y autoclave durante 20 – 25 minutos tienda a temperatura ambiente hasta por tres meses.</li>
		<li>Antes de usar, fundir el agar superior preparado de TB1 en el microondas, mezclar bien y dejar para enfriar a 55 ° C en un baño de agua. Nota: La tapa de TB1 fundida y enfriada se agrega a los contenidos de cada título o tubo de proyección y después de la mezcla, se vierte en el título correspondiente o las placas de agar screening TB1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dejar las placas reposar 15-30 min a temperatura ambiente, con la tapa entreabierta para evitar la condensación.</li>
	<li>Invertir las placas y las placas de diez cribado en una incubadora estacionaria 24 ° C e incube durante 46 – 48 h (es decir, condiciones selectivas) y las seis placas de título en una incubadora estacionaria 37 ° C e incubar durante 24 h/durante la noche (es decir, condiciones no selectivo). Nota: Para aseguramiento de la calidad y estandarización de resultados, soluciones de control disponibles en el mercado de fago que contiene una mezcla de tipo salvaje y mutante cII con frecuencia de mutantes conocido son plateadas junto a las muestras de ADN empaquetadas e incluye en todos los ensayo funciona56.</li>
</ol>5. examinar el título y las placas de cribado para determinar la cII frecuencia mutante
<ol><li>Después de las 24 h/noche incubación a 37 ° C, cuenta el número de placas formadas en cada una de las tres placas de 20 título y título 100 placas. Para identificar más fácilmente las placas, sujetan la placa al lado de una caja de luz blanca y sobre un fondo oscuro con la tapa quitada (ver figura 2).</li>
	<li>Haga un promedio (media) del número de placas contado en cada juego de placas de 20 título y título 100 placas (triplicadas, cada uno).</li>
	<li>Seleccione el número promedio en el conjunto de placas título que cae más cercano al rango de 50 – 200 placas por placa.</li>
	<li>Calcular el número total de placas proyectadas en las placas de diez cribado como sigue: Total placas proyectadas = (media del número de placas en el conjunto elegido de título placas ÷ número de μl de la dilución utilizada por placa título elegido) x factor de dilución x número de μl de la muestra de ADN empaquetado por detección placa [100 μl/placa] x número de detección placas [10]. Nota: por ejemplo, si el número de placas por placa en el conjunto de placas de 20 título es 128 y el número correspondiente en el conjunto de título 100 placas 478, el número 128 se utilizará para el cálculo del número total de placas proyectadas , como sigue: (128 ÷ 20) x 100 [factor de dilución] x 100 [μl/placa] x 10 [placas] = 640.000 Esto es equivalente a multiplicar al número de placas por 5.000 o 1000, si el promedio se basa en recuentos de placas de 20 título o título 100 placas, respectivamente.</li>
	<li>Después de 46 – 48 h de incubación a 24 ° C, contar el número total de placas formadas en las placas de diez cribado (siga las instrucciones en la sección 5.1). Nota: La frecuencia de mutantes cII se calcula dividiendo el número total de placas formadas en las placas de cribado por el número total de placas proyectadas. Utilizando el ejemplo anterior, si el número total de placas contadas en las placas de diez cribado es 112, la frecuencia de mutantes de cII para esta muestra de ADN sería 112 ÷ 640.000 = 17.5 x 10-5.</li>
</ol>6. verificación de la Putative λ cII mutantes, amplificación por PCR y secuenciación de ADN
<ol><li>La placa en cuestión con una punta de la pipeta estéril, ancha de base y expulsar (transfiriendo hacia arriba y hacia abajo) en un tubo de microcentrífuga estéril que contiene 500 μl de tampón estéril de SM.</li>
	<li>Incubar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche, para permitir que las partículas de fago a eluir del agar enchufe.</li>
	<li>En un tubo de fondo redondo de2 mm de 14 x 100 estéril, mezclar 200 μL de la cultura de la galjanoplastia G1250 con 1 μl de la solución núcleo de fago e incubar por 30 min a TA.</li>
	<li>Placa de la muestra con 2,5 mL de agar superior de 55 ° C fundido de TB1 e incubar la placa a 24 ° C 46 – 48 h (condiciones selectivas), como se describe en las secciones 4.8, 4.10.</li>
	<li>Una vez que han formado las placas secundarias, utilice una punta de pipeta para escoger cuidadosamente un solo λ verificado bien aislada cII-placa mutante (evitar tocar el agar inferior). Nota: Replating las placas mutante putativo cII sirve dos propósitos: (i) artefactos de la galjanoplastia puede a veces confundirse con pequeñas placas; y (ii) un núcleo de la agarosa de una placa de proyección puede contener no-mutante phage(s) junto con un mutante fago. Placas secundarias de una baja densidad replating proporcionará una plantilla mutante incontaminada por PCR y posterior análisis de la secuencia del ADN.</li>
	<li>Transferir la placa a un tubo de microcentrífuga con 25 μl de agua destilada doble mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Coloque el tubo en agua hirviendo durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugar a velocidad máxima (18.000 x g) durante 3 minutos a TA.</li>
	<li>Transferir inmediatamente el 10 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga con 40 μl de una mastermix PCR en la que las concentraciones finales de los reactivos son 1 x Taq PCR buffer, 10 pmol cada uno de los iniciadores de avance y retroceso, 12.5 nmol de cada dNTP y 2.5 U de Taq ADN polimerasa. Nota: Los iniciadores e inversas son las siguientes: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posiciones -68 a -50 en relación con la cII comienzo codon) y 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (posiciones +345 a +365 en relación con el codón de inicio del cII ), respectivamente.</li>
	<li>Ampliar la plantilla utilizando los siguientes parámetros de ciclismo: una 3 min de desnaturalización a 95 ° C, seguido de 30 ciclos de 30 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C y 1 min a 72 ° C, con una extensión final de 10 min a 72 ° C.</li>
	<li>Purificar el producto PCR bp 432 que contiene el gen de la cII y flanqueando las regiones usando kits de purificación de PCR disponibles en el mercado, según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Realizar la secuencia de la DNA usando una plataforma de secuenciación adecuados y analizar las secuencias de ADN resultantes para detectar mutaciones en el transgén de la cII (véase la nota de abajo). Nota: Esto es mejor logra alineación con la secuencia de la cII de referencia utilizando el software, como el servidor de alineamiento de secuencia T-café basada en web. Para obtener instrucciones sobre cómo utilizar el programa, visite: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El ensayo Select cII λ se utiliza para la detección de mutaciones en el transgén de la cII de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de roedores de BB3. El genoma de estos animales transgénicos contiene múltiples copias de tándem del vector lanzadera λLIZ cromosómico integrado, que lleva la cII (294 bp) y lacI (1.080 bp) los transgenes, como el reportero mutacional de genes1, 2 ,...

Una amplia gama de modelos de animales transgénicos y sistemas de detección de mutación se han desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos Big Blue (denominado en adelante BB) y λ Select cII sistema de detección de mutación han sido empleados para experimentos de mutagenesis por este grupo y muchos otros investigación grupos en todo el mundo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Durante los últimos 16 años, hemos investigado los efectos mutagénicos de diversos agentes químicos o físicos con estos animales transgénicos o sus correspondientes cultivos celulares de fibroblastos embrionarios trataron con un compuesto de prueba y posteriormente analizaron el fenotipo y genotipo del transgén cII por el λ Select cII análisis y secuenciación de ADN, respectivamente10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. el genoma de estos animales transgénicos contiene bacteriófago λ transporte vector (λLIZ) integrado en el cromosoma 4 como un concatemer de cabeza a la cola de copia múltiple1,2,25. El vector de la lanzadera λLIZ lleva dos genes del reportero mutacional, es decir, el lacI y cII los transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. el ensayo Select cII λ se basa en la recuperación de los vectores de transporte λLIZ de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de animales transgénicos1,2,25 . Los vectores de transporte λLIZ recuperado luego se empaquetan en cabezas de fago λ capaces de infectar a un huésped indicador Escherichia coli. Posteriormente, se cultivan las bacterias infectadas bajo condiciones selectivo para permitir puntuación y análisis de mutaciones en el cII transgen1,3.
Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de selección cII λ, que consiste en el aislamiento de ADN genómico de células/órganos de animales transgénicos tratados en vitro/en vivo con una prueba compuesta, recuperación de la λLIZ traslados de vectores de la DNA genomic, empaquetado de los vectores en fagos λ infecciosa, infección del huésped e. coli con los bacteriófagos, identificación de la cII-mutantes en condiciones selectivas para determinar la frecuencia de mutantes de cII , y Análisis de la secuencia de ADN para establecer el espectro de mutación de la cII . El protocolo se puede aplicar a rata Ratón transgénico de la célula las culturas tratados en vitro con un agente químico físico de interés, o tratado de los tejidos/órganos de los animales correspondientes en vivo con el test químico/agente1, 2,4,48,49,50,51,52. Una presentación esquemática de la prueba de selección cII λ se muestra en la figura 1.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratorios, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Grado bacteriológico</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Kit de secuenciación de ciclos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Caseína Peptona</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Glicerol en polvo</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>QIAquick kit de purificación de PCR</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 reacciones de purificación de PCR</td></tr><tr><td>Acetato de sodio Trihidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Taq5000 ADN polimerasa&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tiamina</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., adquirida por BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 reacciones de envasado</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>Ninguna</td></tr></tbody></table>

la lambda seleccione cii sistema de detección de mutación

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Un número de modelos animales transgénicos y sistemas de detección de mutación ha sido desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos y el Lambda (λ) Seleccione cII sistema de detección de mutación han sido utilizados para experimentos de mutagenesis por muchos grupos de investigación en todo el mundo. Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de mutación de cII en seleccionar Lambda, que se puede aplicar a cultivos de células de ratones/ratas transgénicas o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. El protocolo consta de los siguientes pasos: (1) aislamiento de ADN genómico de las células o los órganos/tejidos de los animales transgénicos trataron en vitro o en vivo, respectivamente, con un compuesto de prueba; (2) recuperación del vector lanzadera lambda lleva un gen reportero mutacional (es decir, transgén cII ) de la DNA genómico; (3) envases de los vectores rescatados en bacteriófagos infecciosos; (4) que infecta a una bacteria huésped y cultivo selectivo condiciones para permitir la propagación de las mutaciones inducidas cII ; y (5) anotar la cII-mutantes y ADN la secuencia de análisis para determinar la frecuencia de mutantes cII y el espectro de la mutación, respectivamente.

Dependiendo de la distribución de los datos, se utilizan pruebas paramétricas o no paramétricas para determinar la significancia de la diferencia en la frecuencia de mutantes cII entre los grupos tratamiento y control (es decir, inducido versus frecuencias de mutante espontáneas) . Comparación de las frecuencias de mutante inducida por cII en los grupos de tratamiento diferentes es hecha por varios (pares) pruebas estadísticas, según sea el caso. La prueba hiper...

Se describe un protocolo detallado para el ensayo de mutación Lambda seleccione cII en cultivos de células de roedores transgénicos o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. Este enfoque ha sido ampliamente utilizado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos.

La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

El objetivo general de este protocolo es visualizar los procedimientos paso a paso involucrados en el ensayo de mutación Lambda Select cII en células cultivadas de roedores transgénicos o los animales correspondientes tratados con agentes químicos y físicos de interés. Este método de prueba puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de mutaciones, tales como, ¿es un compuesto de prueba mutagénico? Y si es así, ¿qué tan potente es un mutágeno?¿Induce mutaciones específicas de secuencia? La principal ventaja de esta técnica es que es un compuesto de prueba mínimo o prácticamente cualquier compuesto. El método se puede utilizar para pruebas de mutagenicidad en células de mamíferos utilizando un gen reportero cromosómicamente integrado.Para constituir una sola reacción de empaquetamiento, agregue cinco microgramos de ADN genómico en un tubo de microcentrífuga que contenga la primera mezcla de reacción. A continuación, incubar el tubo a 30 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la incubación, agregue 12 microlitros de la segunda mezcla de reacción al tubo y deje reposar otros 90 minutos a 30 grados centígrados.Después de 90 minutos, agregue 1,1 mililitros de tampón SM al tubo. A continuación, vórtice vigorosamente el tubo con el ADN empaquetado a temperatura ambiente durante unos 10 segundos. Dé rápidamente un giro de pulso en la microcentrífuga.A continuación, deje el tubo en hielo hasta su uso. A continuación, agregue 50 microlitros de cloroformo por cada mililitro de ADN empaquetado. Si la muestra no se va a procesar el mismo día, agite la muestra suavemente y guárdela a cuatro grados centígrados hasta dos semanas.Prepare 16 tubos estériles de fondo redondo y 16 placas de agar TB1 para una sola muestra de ADN empaquetada. Utilice diez tubos para la cribado y seis para la valoración. A continuación, alícuota 300 microlitros de cultivo de recubrimiento G1250 en cada tubo de fondo redondo.A continuación, para valorar, agregue 10 microlitros de ADN empaquetado a 990 microlitros de tampón SM y dilución 1:100. A continuación, vórtice la muestra. Agregue 20 o 100 microlitros de la solución de ADN 1:100 a cada uno de los tres tubos de título 20 o título 100 respectivamente.Para fines de detección, agregue 100 microlitros de la muestra de ADN empaquetada sin diluir a cada uno de los 10 tubos de detección. Procese los 16 tubos de titulación y cribado. Agita los tubos durante 10 segundos para mezclar los componentes.A continuación, incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos para que la E. coli huésped absorba los fagos. A continuación, agregue 2,5 mililitros de agar superior TB1 fundido. Mantenga esa temperatura a 55 grados centígrados en los tubos de titulación y cribado adecuados.Después de agregar, vórtice inmediatamente los tubos suavemente. Ahora, vierta el agar TB1 en la placa de agar TB1 de título o cribado adecuada. Deje reposar los platos durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente.Una vez que el agar se haya solidificado, invierta y deje las 10 placas de cribado en la incubadora estacionaria a 24 grados centígrados durante 46 a 48 horas. Deje las seis placas de titulación restantes en una incubadora estacionaria a 37 grados centígrados durante toda la noche o un día. Después de la incubación a 37 grados centígrados, cuente el número de placas formadas en todas las placas de 3 títulos 20 y 100 títulos.Después de la incubación a 24 grados centígrados, cuente el número de placas formadas en las 10 placas de cribado. Para verificar las placas mutantes putitivas, extraiga la placa con una punta de pipeta estéril de diámetro ancho. A continuación, transfiera la placa a un tubo de microcentrífuga estéril lleno de 500 microlitros de tampón SM estéril.A continuación, incubar el tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente durante al menos dos horas a temperatura ambiente. A continuación, mezcle un microlitro de la solución de fago con núcleo con 200 microlitros del cultivo de siembra G1250 en un tubo de fondo redondo estéril. A continuación, incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de 30 minutos, coloque la solución de fago con núcleo en 2,5 mililitros de agar superior TB1 fundido e incube a 24 grados centígrados durante 46 a 48 horas. Una vez que las placas secundarias sean visibles, utilice una punta de pipeta para recoger una sola placa mutante Lambda cII bien aislada. Transfiera la placa a un tubo de microcentrífuga lleno de 25 microlitros de agua destilada doble en una pipeta varias veces.Deje el tubo en agua hirviendo durante cinco minutos. A continuación, centrifugar el tubo a 18.000 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la centrifugación, transfiera 10 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenga 40 microlitros de la mezcla maestra de PCR.Después de la amplificación por PCR, purifique el producto paraamplificado de base 432 con el gen cII y sus regiones flanqueantes incorporadas mediante el kit de purificación por PCR. A continuación, secuencie el transgén cII utilizando un analizador de ADN para detectar las mutaciones. Las placas obtenidas tanto en la placa de título 20 como en la de título 100 son claramente visibles si se colocan junto a una caja de luz blanca y sobre un fondo oscuro.Aquí, el diagrama de barras muestra la potencia mutagénica de varios productos químicos en los compuestos físicos probados. Esto se hace analizando el grado de aumento en la frecuencia relativa de mutantes cII aislados de los blastos de fibras embrionarias de ratón. El diagrama de barras muestra todos estos reactivos de prueba que muestran un aumento de pliegue estadísticamente significativo en la frecuencia de mutantes cII.A continuación, se demuestran los espectros de mutación del transgén cII en los blastos de fibras embrionarias de ratón irradiados con UVB. El gráfico circular muestra un aumento significativo en la frecuencia relativa de la transición de citidina simple o en tándem a timidina en los dinucleótidos de pirimidina en comparación con el control. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho a diez horas si se realiza correctamente, excluyendo los tiempos de preparación para la placa de rayas bacterianas en el cultivo.En la secuenciación del ADN, después de puntuar los mutantes cII. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de mutaciones de un compuesto de prueba en un sistema modelo in vitro.

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