La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación

El objetivo general de este protocolo es visualizar los procedimientos paso a paso involucrados en el ensayo de mutación Lambda Select cII en células cultivadas de roedores transgénicos o los animales correspondientes tratados con agentes químicos y físicos de interés. Este método de prueba puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de mutaciones, tales como, ¿es un compuesto de prueba mutagénico? Y si es así, ¿qué tan potente es un mutágeno?

¿Induce mutaciones específicas de secuencia? La principal ventaja de esta técnica es que es un compuesto de prueba mínimo o prácticamente cualquier compuesto. El método se puede utilizar para pruebas de mutagenicidad en células de mamíferos utilizando un gen reportero cromosómicamente integrado.

Para constituir una sola reacción de empaquetamiento, agregue cinco microgramos de ADN genómico en un tubo de microcentrífuga que contenga la primera mezcla de reacción. A continuación, incubar el tubo a 30 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la incubación, agregue 12 microlitros de la segunda mezcla de reacción al tubo y deje reposar otros 90 minutos a 30 grados centígrados.

Después de 90 minutos, agregue 1,1 mililitros de tampón SM al tubo. A continuación, vórtice vigorosamente el tubo con el ADN empaquetado a temperatura ambiente durante unos 10 segundos. Dé rápidamente un giro de pulso en la microcentrífuga.

A continuación, deje el tubo en hielo hasta su uso. A continuación, agregue 50 microlitros de cloroformo por cada mililitro de ADN empaquetado. Si la muestra no se va a procesar el mismo día, agite la muestra suavemente y guárdela a cuatro grados centígrados hasta dos semanas.

Prepare 16 tubos estériles de fondo redondo y 16 placas de agar TB1 para una sola muestra de ADN empaquetada. Utilice diez tubos para la cribado y seis para la valoración. A continuación, alícuota 300 microlitros de cultivo de recubrimiento G1250 en cada tubo de fondo redondo.

A continuación, para valorar, agregue 10 microlitros de ADN empaquetado a 990 microlitros de tampón SM y dilución 1:100. A continuación, vórtice la muestra. Agregue 20 o 100 microlitros de la solución de ADN 1:100 a cada uno de los tres tubos de título 20 o título 100 respectivamente.

Para fines de detección, agregue 100 microlitros de la muestra de ADN empaquetada sin diluir a cada uno de los 10 tubos de detección. Procese los 16 tubos de titulación y cribado. Agita los tubos durante 10 segundos para mezclar los componentes.

A continuación, incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos para que la E. coli huésped absorba los fagos. A continuación, agregue 2,5 mililitros de agar superior TB1 fundido. Mantenga esa temperatura a 55 grados centígrados en los tubos de titulación y cribado adecuados.

Después de agregar, vórtice inmediatamente los tubos suavemente. Ahora, vierta el agar TB1 en la placa de agar TB1 de título o cribado adecuada. Deje reposar los platos durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente.

Una vez que el agar se haya solidificado, invierta y deje las 10 placas de cribado en la incubadora estacionaria a 24 grados centígrados durante 46 a 48 horas. Deje las seis placas de titulación restantes en una incubadora estacionaria a 37 grados centígrados durante toda la noche o un día. Después de la incubación a 37 grados centígrados, cuente el número de placas formadas en todas las placas de 3 títulos 20 y 100 títulos.

Después de la incubación a 24 grados centígrados, cuente el número de placas formadas en las 10 placas de cribado. Para verificar las placas mutantes putitivas, extraiga la placa con una punta de pipeta estéril de diámetro ancho. A continuación, transfiera la placa a un tubo de microcentrífuga estéril lleno de 500 microlitros de tampón SM estéril.

A continuación, incubar el tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente durante al menos dos horas a temperatura ambiente. A continuación, mezcle un microlitro de la solución de fago con núcleo con 200 microlitros del cultivo de siembra G1250 en un tubo de fondo redondo estéril. A continuación, incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, coloque la solución de fago con núcleo en 2,5 mililitros de agar superior TB1 fundido e incube a 24 grados centígrados durante 46 a 48 horas. Una vez que las placas secundarias sean visibles, utilice una punta de pipeta para recoger una sola placa mutante Lambda cII bien aislada. Transfiera la placa a un tubo de microcentrífuga lleno de 25 microlitros de agua destilada doble en una pipeta varias veces.

Deje el tubo en agua hirviendo durante cinco minutos. A continuación, centrifugar el tubo a 18.000 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la centrifugación, transfiera 10 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenga 40 microlitros de la mezcla maestra de PCR.

Después de la amplificación por PCR, purifique el producto paraamplificado de base 432 con el gen cII y sus regiones flanqueantes incorporadas mediante el kit de purificación por PCR. A continuación, secuencie el transgén cII utilizando un analizador de ADN para detectar las mutaciones. Las placas obtenidas tanto en la placa de título 20 como en la de título 100 son claramente visibles si se colocan junto a una caja de luz blanca y sobre un fondo oscuro.

Aquí, el diagrama de barras muestra la potencia mutagénica de varios productos químicos en los compuestos físicos probados. Esto se hace analizando el grado de aumento en la frecuencia relativa de mutantes cII aislados de los blastos de fibras embrionarias de ratón. El diagrama de barras muestra todos estos reactivos de prueba que muestran un aumento de pliegue estadísticamente significativo en la frecuencia de mutantes cII.

A continuación, se demuestran los espectros de mutación del transgén cII en los blastos de fibras embrionarias de ratón irradiados con UVB. El gráfico circular muestra un aumento significativo en la frecuencia relativa de la transición de citidina simple o en tándem a timidina en los dinucleótidos de pirimidina en comparación con el control. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho a diez horas si se realiza correctamente, excluyendo los tiempos de preparación para la placa de rayas bacterianas en el cultivo.

En la secuenciación del ADN, después de puntuar los mutantes cII. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de mutaciones de un compuesto de prueba en un sistema modelo in vitro.