Producción de neuronas humanas inducibles por neurogenina 2 en un biorreactor de suspensión tridimensional

El uso de biorreactores para traducir células madre pluripotentes inducidas o protocolos de cultivo IPSC de 2D a 3D permite la generación de células en grandes cantidades para aplicaciones a gran escala, como exámenes de alto rendimiento. Este protocolo de diferenciación neuronal rápida en un entorno fisiológico 3D mejora las interacciones de las células iniciadoras y proporciona un alto rendimiento celular durante un período más corto con una baja variación de lote a = lote, lo que reduce el costo y el tiempo. El Banco Europeo de Células Madre Pluripotentes Inducidas está aplicando enfoques similares para la generación rápida y rentable de células diferenciadas en múltiples linajes, incluidas otras células cerebrales y cardiomiocitos.

Comience el precultivo cuando la célula madre pluripotente inducida por humanos, o cultivo de iPSC humana, sea de 60 a 80% confluente. Aspire el medio completamente de las iPSC humanas y enjuague suavemente las células con 1X DPBS dos veces. Agregue dos mililitros de solución de tripsina EDTA precalentada a la placa de Petri de seis centímetros e incube las células durante tres minutos a 37 grados centígrados en una incubadora.

Luego, golpee suavemente los platos para facilitar el desprendimiento de células o incube durante uno o dos minutos más si las células no se desprenden. Luego, resuspenda las células en cada plato agregando cinco mililitros de medio de mantenimiento IPSC sin alimentador con inhibidor ROCK. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros o 50 mililitros y mezcle suavemente con pipeteo para garantizar la singularización celular.

Determine el número de células en 100 microlitros de suspensión celular utilizando un contador celular automatizado y transfiera el volumen deseado de suspensión celular a un tubo de 50 mililitros. Centrifugar las células a 300 G durante tres minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células en dos mililitros de medio de mantenimiento IPSC sin alimentador con inhibidor ROCK.

Llene cada tubo de 50 mililitros con 18 mililitros del medio. Luego, dispense 20 mililitros de suspensión celular en cada tubo del biorreactor. Coloque los tubos en el sistema de biorreactor y establezca los parámetros de cultivo por una duración ilimitada.

Inicie el programa de precultivo a través de la pantalla del biorreactor. Para cambiar el medio al día siguiente, deje que el agregado se asiente en los tubos del biorreactor durante unos cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Agregue 15 mililitros de medio de mantenimiento IPSC fresco sin alimentador sin inhibidor de ROCK por tubo y continúe el cultivo en el biorreactor de sobremesa durante 24 horas.

Para iniciar la diferenciación neuronal, deje que el agregado se asiente en los tubos del biorreactor y aspire cuidadosamente el sobrenadante de las células, dejando aproximadamente cinco mililitros de sobrenadante en el tubo. Luego, agregue 35 mililitros de medio de inducción neural que consiste en medio neurobasal y dos microgramos por mililitro de doxiciclina. Coloque los tubos de nuevo en el biorreactor de sobremesa y continúe el cultivo.

Realice cambios de medios todos los días durante dos días, como se demostró anteriormente. Después de aspirar el sobrenadante como se mostró anteriormente, transfiera los agregados a un tubo estéril de 15 mililitros o 50 mililitros y enjuague suavemente los agregados dos veces con DPBS. Aspire cuidadosamente el sobrenadante tanto como sea posible sin alterar los agregados.

Luego agregue de dos a cinco mililitros de enzima de disociación celular precalentada al pellet, dependiendo del tamaño del pellet, e incube las células durante aproximadamente 10 minutos a 37 grados centígrados en un baño de agua. Resuspender suavemente los agregados sedimentados cada dos minutos hasta que los agregados se disocien. Agregue el medio neurobasal precalentado, tres veces el volumen de la enzima de disociación celular previamente agregada, y resuspenda las células cuidadosamente para garantizar la singularización celular.

Determine el número de células y transfiera el volumen correspondiente de suspensión celular para criopreservación a un tubo de 15 mililitros o 50 mililitros. Centrifugar a las celdas a 300 G durante tres minutos. Aspire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en el volumen correspondiente del medio de congelación que contiene 10% de sulfóxido de dimetilo.

Alícuota la suspensión celular en viales adecuados para la criopreservación. Transfiera los viales inmediatamente a un recipiente de congelación de velocidad lenta preenfriado lleno de 2-propanol y coloque el recipiente a menos 80 grados centígrados durante la noche. Coloque los viales a menos 150 grados centígrados al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.

Después de que los cultivos adherentes de iPSCs humanas se separaron, singularizaron y transfirieron a suspensión, los agregados se formaron en 24 horas y continuaron creciendo. Después de dos días de inducción transgénica, las neuronas tempranas podrían ser criopreservadas para su posterior maduración. Se observó una proliferación persistente de las iPSCs humanas durante los primeros días en suspensión, y el número de cultivos celulares alcanzó su punto máximo después de dos días de inducción.

Sin embargo, el cultivo prolongado durante más de cuatro días en suspensión no mejoró el rendimiento celular, ya que los agregados se volvieron cada vez más resistentes a la singularización enzimática. Además, en comparación con el día cero, el diámetro agregado aumentó en un 50% en el segundo día y casi se duplicó en el día cinco. Aunque el aumento del diámetro limita el suministro de nutrientes a los agregados, la viabilidad de las células no se vio afectada en el día dos o cinco de diferenciación.

El perfil de expresión génica temporal, así como la tinción inmunoquímica para los marcadores neuronales beta tres tubulina y proteína asociada a microtúbulos, o MAP2, confirmaron la identidad celular neuronal de las células criopreservadas del día dos. Además, los cultivos neuronales se enriquecieron en transcripciones de proteínas tau asociadas a microtúbulos, o MAPT, y mostraron una disminución concomitante en la expresión del factor de transcripción regulador de la pluripotencia POU5F1 Se formó una densa red neurítica dentro de la primera semana después de la descongelación, lo que también sugirió una maduración creciente de los cultivos neuronales. Este protocolo sienta las bases para la traducción en biorreactores a gran escala y totalmente automatizados, que muestran un aumento significativo adicional en la capacidad de salida de células para futuras aplicaciones a gran escala.

Una vez probado con neurogenina 2, el uso de factores de transcripción determinantes lineales para acelerar la diferenciación se ha aplicado a muchos tipos de células y enfermedades diferentes para facilitar el modelado de iPSC.