Un modelo de bucle hemodinámico In Vitro para investigar la hemocitocompatibilidad y la activación de células host de dispositivos médicos vasculares

Aquí se presenta un protocolo para un modelo de bucle hemodinámico estandarizado. Este modelo permite probar la hemocompatibilidad de tubos de perfusión o stents vasculares para estar de acuerdo con la norma ISO (International Organization for Standardization) 10993-4.

Este modelo de bucle hemodinámico permite a los investigadores probar la compatibilidad hemo in vitro de dispositivos vasculares como tubos de perfusión o stents. en condiciones estandarizadas. Así que esta técnica no ejerce ningún impacto en la sangre por la fuerza mecánica y así evitar los resultados engañosos por la activación intrínseca de los componentes sanguíneos.

Antes de intentar un experimento, se debe practicar el montaje adecuado de la pieza mecánica, la construcción perfecta del sistema de cierre de bucle y la carga lenta de sangre en los bucles. Para preparar el conjunto de bucle, utilice una cortadora de tubo para cortar piezas de tubo de 250 centímetros de largo y cinco milímetros de diámetro interior en una superficie plana. Y enchufe los terminaciones abiertos de los tubos en una pieza corta de tubo de silicio que se ajuste al diámetro exterior del tubo de investigación para generar una forma de bucle.

Apriete cuidadosamente el tornillo de bloqueo del conector de la banda de tensión y ajuste la fuerza de cierre para que no quede ningún hueco entre las dos curvas. Si el tornillo de bloqueo está completamente apretado y la tensión de la banda de policarbonato parece demasiado baja para cerrar el espacio entre las dos flexiones, abra el sistema de bloqueo y corte unos milímetros de la banda de tensión. Para preparar un conjunto de bucle de stent, abra dos de los bucles y saque el tubo del sistema de banda de tensión.

A continuación, inserte el stent en el centro del tubo según las instrucciones del fabricante. Cuando se haya generado el número adecuado de bucles para el experimento, asegure los bucles en la base de bucle de la unidad de rotación, fuera de un baño de agua de 37 grados y conecte la base del bucle a la unidad de rotación dentro del baño de agua. A continuación, llene una jeringa de 10 mililitros por cada dos bucles de sangre que se recogerán con 150 microlitros o solución de heparina recién preparada y utilice una mariposa de calibre 21 para recoger suavemente la sangre en las jeringas, teniendo cuidado de evitar la homolisis o la activación celular debido al vacío excesivo.

Cuando se haya recogido toda la sangre, transfiera la sangre a un vaso de precipitados de vidrio y use una pipeta serológica de cinco mililitros, para mezclar suavemente la sangre y la heparina. Cuando se haya obtenido una solución homogénea con la punta de la pipeta no insertada completamente en el tubo, con cuidado, llene cada bucle con cinco mililitros de sangre. Cierre cada bucle después de que se haya llenado y confirme que el bucle, la banda de tensión y el bastidor están correctamente asegurados.

A continuación, gire los bucles durante tres horas a 30 revoluciones por minuto. Al final de la rotación, deje que los bucles se pongan de pie en el bastidor durante dos minutos para dejar que la sangre se acumule en los fondos del lazo antes de abrir cuidadosamente los conectores y tirar de la sangre de duplicados en vasos de vidrio individuales de 10 mililitros. Cuando se haya recogido toda la sangre, enjuague cada tubo con 10 mililitros de PBS y use un bisturí para cortar cuidadosamente una muestra de un centímetro del extremo de cada tubo.

Incubar las muestras durante la noche en 2%glutaraldehído a cuatro grados centígrados, seguido de una incubación de 15 minutos y un 1%tetróxido de osmio a temperatura ambiente. Al final de la incubación de tetróxido de osmio, deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol durante 20 minutos por concentración, seguida de una deshidratación de 30 minutos en 100% etanol. Al final de la incubación del 100% de etanol, deje que las muestras se sequen durante la noche a temperatura ambiente antes de tomar imágenes de las muestras mediante microscopía electrónica de barrido a una tensión de aceleración de cinco kilovoltas, utilizando un escáner de micro TC de rayos X.

Para el análisis citométrico de flujo de las muestras de sangre. Transfiera 100 microlitros de sangre de cada muestra a cada uno de los nueve tubos FACS de cinco mililitros y fije las muestras con la adición de 100 microlitros de 4% de formaldehído de potencia por tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Después del lavado, vuelva a suspender cada pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos por tubo, para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.

Al final de la incubación, lave las muestras por centrifugación en un mililitro de PBS por tubo y coloque las muestras sin sus sobrenadantes en hielo. Para preparar cuentas de compensación de manchas individuales, agregue cuatro gotas de cuentas positivas y cuatro gotas de cuentas negativas a volúmenes individuales de un mililitro de tampón FACS, y vórtice las soluciones para obtener suspensiones homogéneas de cuentas. Agregue 100 microlitros de cada solución a cada uno de los cuatro o cinco tubos FACS mililitros etiquetados como se indica y lave las perlas con un mililitro de tampón FACS por tubo.

A continuación, añada 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de vórtice adecuado a cada experimental y fluorescencia menos un tubo con una mezcla suave. Para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la incubación, lave las muestras con un mililitro de tampón FACS fresco por muestra y pellets resuspend en 250 microlitros de tampón FACS por tubo.

Antes de analizar las perlas en las muestras celulares por citometría de flujo, de acuerdo con los protocolos estándar. Las distribuciones de células sanguíneas se pueden visualizar en toda la superficie de dos bloops empalmadas mediante micro TC y imágenes de microscopios electrónicos de barrido, mientras que no se observan coágulos en bucles cerrados sin huecos. El análisis de todo el recuento de células sanguíneas, no muestra diferencias significativas en el número de eritrocitos entre cualquiera de las condiciones probadas, el número de plaquetas y leucocitos, sin embargo, se reduce drásticamente en el grupo de bucles de látex y el número de hemoglobina libre se incrementan dramáticamente, lo que indica una muy pobre biocompatibilidad del látex.

Mientras que todos los dispositivos vasculares probados inducen una mayor activación del sistema de coagulación y componente de complemento. Los bucles de PVC recubiertos de heparina exhiben una tendencia a la disminución de los niveles de ambos tipos de activaciones en comparación con los bucles de PVC recubiertos de polímero. Los bucles de látex exhiben los niveles más altos de TNF IL-6 y PMN elastase, destacando la potente activación de leucocitos por látex.

Las plaquetas positivas CD41 recuperadas de tubos de látex, presentan una intensidad de fluorescencia media extremadamente alta para CD62P, mientras que la expresión integrada se reduce drásticamente en granulocitos y linfocitos. De interés, los niveles integrales son más altos en monocitos de tubos de látex, lo que sugiere interacciones plaquetarias activadas por monocitos. De hecho, la tinción de agregados plaquetarios monocitos revela una mayor tendencia a la agregación en bucles de látex y stent.

A pesar de la frecuencia reducida de monocitos dentro de bucles de látex. Para evitar la activación intrínseca de los componentes sanguíneos es importante asegurar un cierre de bucle adecuado y manejar la sangre con cuidado. Así que siguiendo este procedimiento, es posible analizar la interacción entre proteínas alogénicas o TRUCKs y componentes sanguíneos que se utilizan en la inflamación o la investigación farmacéutica.