Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten

De patiënt-afgeleide explantaten zijn een kortetermijnmethode die onmiddellijke geneesmiddelresponsgegevens levert die de uitkomsten van patiënten nauwkeurig kunnen voorspellen. De PD-platforms maken het mogelijk om medicijnresponsen te onderzoeken in een 3D-context die de pathologische en architecturale kenmerken van de regionale tumoren zo goed mogelijk weerspiegelt. Explantaten hebben het potentieel om nieuwe inzichten te bieden in het metabolisme en het werkingsmechanisme van een geneesmiddel en om de identificatie van nieuwe farmacodynamische biomarkers te vergemakkelijken.

Voordat u met het experiment begint, reinigt u alle chirurgische apparatuur met een 70% industriële gemethyleerde spiritusoplossing. Vul een kweekschaal van 10 centimeter met 25 milliliter vers medium op ijs. Breng het monster met een pincet over op een tandwasoppervlak En gebruik twee huidtransplantatiebladen om het weefsel in fragmenten van ongeveer twee tot drie kubieke millimeter te snijden.

Breng de explantaten over in een schaal van 10 centimeter en plaats zes tot negen stukjes van het weefsel in een buis van één milliliter met 10% niet-gebufferde formaline-oplossing gedurende een incubatie van 24 uur bij kamertemperatuur. Vul het gewenste aantal putten van een bord met zes putten met 1,5 milliliter vers medium per put. En plaats een organotypische kweekschaal in elke put, zodat deze bovenop het medium drijft.

Plaats zes tot negen explants op elke insteekschijf en bewaar gedurende een incubatietijd van 16 uur in een incubator van 5% koolstofdioxide om herstel mogelijk te maken. Voeg de volgende dag vers medium en medicijn toe aan elke put van een nieuw bord. Voeg een put toe voor de voertuigcontrole.

Wanneer alle medicamenteuze behandelingen zijn voorbereid, gebruikt u een pincet om één inzetstuk over te brengen naar elke put van de nieuwe zes putplaat voor een incubatie van 24 tot 48 uur in de kooldioxide-incubator. Breng na de medicamenteuze behandeling de schijven over in nieuwe zes putplaten met 10% formaline. En voeg een paar druppels 10% formaline toe aan de bovenkant van elke explant om volledige dekking met het fixeermiddel te garanderen gedurende 24 uur incubatie bij kamertemperatuur.

Week de volgende dag een passend aantal kleine histologiesponzen in 70% industriële gemethyleerde oplossing. En plaats de sponzen in histologiecassettes. Wanneer alle sponzen zijn geplaatst, brengt u alle explantaten van dezelfde medicijnbehandelingsconditie over op een enkele spons met de met het geneesmiddel behandelde kant van elke explant die contact maakt met de ingebrachte schijf.

Plaats een andere voorgekookte spons op elke explant en sluit de cassette om de explants in de cassette vast te zetten. Dompel de cassettes vervolgens onder in 70% industriële gemethyleerde oplossing voordat u doorgaat met de histologische verwerking. Voer na het scannen een trainingsanalyse uit en laad de scans met de stempels voor training in de juiste analysesoftware.

Navigeer in de weergave in één modus door de afbeeldingen en selecteer de scans die u wilt analyseren en de scan met intrinsieke fluorescentie. klik met de intrinsieke fluorescentiescan in één weergave op de autofluorescentiekiezer om een segment op een gebied met niet-gekleurd weefsel te tekenen. Klik op markeringen en kleuren bewerken en voer de markeringsnamen in het vak in dat aan elke fluorofoor is gekoppeld.

Klik op afbeeldingen voorbereiden zodat de software de intensiteit van intrinsieke fluorescentie kan aftrekken van alle geüploade afbeeldingen. Klik op de stap Weefselsegmenteren boven aan het scherm om het trainingsvenster voor weefselsegmentatie te openen. Voer in het deelvenster Weefselcategorieën de naam in van elke weefselcategorie die moet worden gesegmenteerd.

Klik op tekenen om gebieden rond groepen cellen in de betreffende weefselcategorie te tekenen. Schakel vervolgens over naar de volgende weefselcategorie en teken nieuwe gebieden. Wanneer alle trainingsregio's zijn gedefinieerd, gebruikt u de trainingsweefselsegmenter en wacht u tot de trainingsnauwkeurigheid is opgelost.

Eventueel tot een waarde in de buurt van 100%Klik allemaal om de weefsels te segmenteren. Nadat de kwaliteit van de weefselsegmentatie is geverifieerd, klikt u op celsegmentatie en selecteert u de cellulaire compartimenten die u wilt segmenteren. Als u de nucleaire component wilt configureren, gebruikt u de schuifregelaar voor de typische intensiteit om de drempelwaarde aan te passen die wordt gebruikt om de nucleaire pixels te detecteren.

Live feedback wordt gegeven door het voorbeeldvenster. Als u de clusters van nucleaire pixels wilt splitsen, selecteert u in het deelvenster Splitsen van nucleaire componenten de knop die de kleuringskwaliteit van de kernen het beste beschrijft en gebruikt u de schuifbalk om de splitsingsgevoeligheid aan te passen. Klik vervolgens op alles segmenteren om alle afbeeldingen te segmenteren.

Wanneer alle afbeeldingen zijn gesegmenteerd, voegt u in het deelvenster fenotypen de lijst met te detecteren fenotypen toe en voert u de naam van de fenotypen in het bijbehorende tekstvak in. Klik op Fenotypen bewerken om een bepaalde cel te selecteren en selecteer het bijbehorende fenotype in het vervolgkeuzemenu. Nadat u de selectie voor training hebt voltooid, klikt u op de treinclassificatie om het resultaat van elk fenotype te evalueren.

Ga verder met fenotype all, sla het project op en klik op exporteren. Selecteer het tabblad Batchanalyse en laad het project in het batchalgoritme of projectvak. Als u de afbeeldingen en tabellen wilt exporteren, selecteert u alle vakken in de exportopties, klikt u op Dia's toevoegen en laadt u alle afbeeldingen met de stempels voor de eerder voorbereide batches.

Klik vervolgens op uitvoeren naar de start batchanalyse van één stempel en exporteer de bijbehorende gegevens wanneer deze zijn verkregen. Multi-spectrale beeldvorming van NSCLC explant weefsel gekleurd voor markers van cel levensvatbaarheid, maakt de identificatie en fenotypering van individuele celpopulaties mogelijk, evenals de identificatie van tumor en stromale componenten binnen de explant tumor micro-omgeving. Weefsel- en celsegmentatie van cel levensvatbaarheid markers multi-spectrale beelden zoals aangetoond, kan worden gebruikt om celdood en proliferatie te kwantificeren in patiënt afgeleide explantaten behandeld met geneesmiddelen van belang.

In deze analyse werd bijvoorbeeld in weefselmonsters van tumoren behandeld met Nivolumab een hoger aantal stervende cellen geïdentificeerd in vergelijking met de met controle behandelde tumormonsters. Bovendien, zoals geïllustreerd, maakt het vermogen om ruimtelijke informatie uit gekleurde dissecties te extraheren, de berekening van intercell-afstanden mogelijk. Explants kunnen ook worden gebruikt voor uitgebreide ruimtelijke profilering of massacytometrie, waardoor honderden biomarkers tegelijkertijd met subsidiaire resolutie kunnen worden geprofileerd met behoud van de 3D-structuur van het monster.

PD's konden de werkzaamheid van immunotherapie voorspellen. Het zou bijvoorbeeld mogelijk kunnen zijn om gevoelige of resistente gevallen van immuuncheckpointremmers te onderscheiden en de mechanismen te onderzoeken die aan dit onderscheid ten grondslag liggen.