Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

Este protocolo nos permite investigar antígenos presentes en la superficie celular de varios tipos de células para encontrar antígenos específicos de ese tipo de célula o tejido. La técnica que presentamos aquí permite el enriquecimiento de las proteínas de la membrana celular a partir de un lisado de célula entera y, en última instancia, el análisis mediante proteómica basada en espectrometría de masas. Por lo tanto, una aplicación específica de este protocolo es aplicarlo a las células tumorales para buscar antígenos presentes en la superficie de esas células cancerosas y no células normales que podrían servir como nuevos objetivos para las inmunoterapias contra el cáncer.

Una cosa a tener en cuenta sobre este protocolo es que puede ser importante optimizar la entrada de muestra para el experimento de interés. Por lo tanto, es posible que se necesiten varias iteraciones o valoraciones para encontrar las condiciones óptimas. Así que la demostración del procedimiento correrá a cargo de Akul Naik, un especialista junior de nuestro laboratorio.

Para comenzar, retire el pellet de células congeladas marcadas con biotina a menos 80 grados centígrados y descongélelo en hielo. Agregue 500 microlitros de 2X Lysis Buffer al pellet, mezcle bien y agite vigorosamente durante 30 segundos. Sonicar el lisado celular en hielo y centrifugar el lisado a 17,200 G durante 10 minutos a 4 grados centígrados para peltear los restos restantes.

Mientras el lisado se centrifuga, agregue 100 microlitros de perlas de resina NeutrAvidin Agarose a una columna de filtración conectada al colector de vacío. Aplique una aspiradora suave y lave las perlas haciendo fluir 3 mililitros de Wash Buffer 1 sobre ellas. Retire la columna de filtración del colector de vacío, tape la parte inferior y agregue el lisado celular clarificado a la columna con las perlas.

Tape la parte superior de la columna e incube el lisado con las perlas en un rotor de extremo a extremo durante 120 minutos a 4 grados centígrados. Después de completar la incubación del lisado, vuelva a colocar la columna de filtración en el colector de vacío y aplique un vacío suave. Lave las perlas haciendo fluir cinco mililitros de tampón de lavado 1 sobre ellas.

Repita el paso de lavado con cinco mililitros de tampón de lavado 2 y tampón de lavado 3. Una vez que el tampón de lavado final haya fluido completamente a través de los cordones, retire la columna del colector. A continuación, añada 100 microlitros de solución de lisa a las perlas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mililitros con una pipeta.

Gire brevemente el tubo para asentar las cuentas y retire 50 microlitros de la solución. A continuación, coloque el tubo en un agitador de bloques de calor a 65 grados centígrados durante 10 minutos a 1000 RPM agitando. Vuelva a suspender la tripsina seca en el tubo de digestión del kit agregando 210 microlitros de la solución de resuspensión y pipeteándola hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que toda la tripsina seca se vuelva a suspender.

Al final de la incubación de las perlas, retírelo del agitador de bloques de calor y agregue 50 microlitros de la solución de tripsina resuspendida a las perlas. Incubar el tubo a 37 grados centígrados, agitando a 500 RPM durante al menos 90 minutos para digerir la proteína. Una vez completada la digestión, transfiera la solución que contiene las perlas a una columna de centrifugación e inserte la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros de baja unión a proteínas.

Gira el tubo para separar la solución peptídica digerida de las perlas. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución de parada para detener la reacción de digestión y acidificar la solución peptídica. Con un adaptador de tubo, coloque una columna de desalinización en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mililitros.

Agregue toda la solución de péptido acidificado a la columna. Gire la columna a 3.800 G durante 3 minutos, de modo que la solución fluya a través de la columna. Descarte el flujo a través, ya que los péptidos ahora están unidos a la columna.

Agregue 200 microlitros de solución Wash 1 a la columna, centrifugue a 3, 800 G durante 3 minutos a temperatura ambiente y luego deseche el flujo. Repita el paso de lavado con 200 microlitros de solución Wash 2. Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mililitros etiquetado.

Añadir 100 microlitros de solución de elución a la columna y centrifugar a 3.800 G durante 3 minutos a temperatura ambiente. Los péptidos ahora se eluyen de la columna al tubo. Coloque la solución peptídica en una centrífuga al vacío y deje que se seque durante la noche.

Coloque los péptidos secos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para cuantificar y analizar en el espectrómetro de masas. Se realizó un análisis de proteoma para caracterizar las proteínas de la superficie celular enriquecidas mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem. Se obtuvo una concentración final de péptidos de aproximadamente 630 nanogramos por microlitro mediante el ensayo de cuantificación colorimétrica de péptidos.

Los datos de espectrometría de masas analizados con MaxQuant y el posterior análisis del conjunto de datos de las proteínas de la superficie celular arrojaron 601 proteínas de superficie en la muestra, aproximadamente el 27% de todas las proteínas identificadas. Aquí se muestra un gráfico que representa la distribución de la proteína identificada en la puntuación de Andrómeda, y el diagrama de dispersión ilustra la correlación entre muestras. Los diagramas de caja representaban la variación de una ejecución a otra.

Y el gráfico de distribución muestral representó la calidad de los datos de las réplicas. Lo más importante a tener en cuenta es dónde están los péptidos en cada paso. Inicialmente, están en solución, luego, se unen a las perlas hasta la digestión, luego, se unen a la columna de desalinización hasta que finalmente se eluyen.

Siguiendo este procedimiento, hay varias formas de validar un puñado de las proteínas identificadas, como la citometría de flujo dirigida y la proteómica dirigida. Esto proporcionará información más detallada sobre los niveles de expresión de estas proteínas en la muestra.