Name: Flujo de trabajo Cell Surface Capture para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda a cuantificar el proteoma de superficie celular mediante captura de membrana y espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite identificar antígenos específicos en células tumorales para inmunoterapia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Dr. Kamal Mandal (Departamento de Medicina de Laboratorio, UCSF) por su ayuda en la configuración de la carrera LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) por su ayuda con el análisis de datos, y a la Dra. Audrey Reeves (Departamento de Medicina de Laboratorio, UCSF) por su ayuda con el análisis de datos. El trabajo relacionado en el laboratorio de A.P.W. cuenta con el apoyo de la CA226851 R01 de los NIH y el Chan Zuckerberg Biohub. La Figura 1 y la Figura 2B se realizaron utilizando BioRender.com.

NOTA: Se utilizaron células de plasmocitoma AMO1 para este experimento de proteoma de superficie celular. El mismo protocolo también podría usarse para otros tipos de células, incluida una amplia gama de líneas celulares en suspensión y adherentes9, así como varios tipos de muestras primarias10. Sin embargo, el número de células (material de partida para el experimento) normalmente tiene que ser optimizado para una cobertura de proteoma equivalente. Para obtener detalles relacionados con materiales y equipos, consulte la Tabla de materiales. Para obtener más información sobre los tampones y las soluciones de reactivos y su composición, consulte la Tabla 1.
1. Marcaje de la superficie celular con biotina
<ol>
	<li>Cuente las células cultivadas y el pellet aproximadamente 3,5 × 107 células vivas por centrifugación (5 min a 500 × g, 24 °C). 
	NOTA: Las células de plasmocitoma AMO1 se sometieron a medios frescos cada 3 días antes de la recolección.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet añadiendo 1 mL de solución salina fría (4 °C) tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) (sin calcio, sin magnesio) y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Vuelva a granular las celdas (como en el paso 1.1) y repita el paso de lavado (paso 1.2) una vez más (dos lavados en total).</li>
	<li>Después del segundo lavado, granule las células (como en el paso 1.1) y vuelva a suspenderlas en 990 μL de D-PBS frío pipeteando suavemente.</li>
	<li>Prepare previamente una solución madre de 160 mM de metaperiodato de sodio (NaIO4). Dividir en alícuotas de 50 μL y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 10 μL de 160 mM de solución de metaperiodato de sodio a la suspensión celular en el paso 1.4, mezclar bien e incubar en un rotor de extremo a extremo durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Una vez completada la incubación, granule las células (como en el paso 1.1), decante el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de D-PBS frío. Repita este paso de lavado dos veces (tres lavados en total). Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en 989 μL de D-PBS.</li>
	<li>Prepare previamente una solución madre de hidrazida de biocitina 100 mM. Divida en alícuotas de 50 μL y almacene a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 1 μL de anilina y 10 μL de hidrazida de biocitina 100 mM a la suspensión celular en el paso 1.6, mezclar bien e incubar en un rotor de extremo a extremo durante 60 min a 4 °C.</li>
	<li>Una vez completada la incubación, granule las células (como en el paso 1.1), decante el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de D-PBS frío. Repita este paso de lavado dos veces (tres lavados en total).</li>
	<li>Después del tercer lavado, aspire el sobrenadante con cuidado con una pipeta y congele a presión el pellet de celda colocando el tubo en el líquido N2. Coloque el pellet congelado a -80 °C, hasta que esté listo para proceder con la lisis y la extracción.</li>
</ol>
2. Lisis celular y extracción de biotina
<ol>
	<li>Descongele el pellet de celda congelado en hielo.</li>
	<li>Agregue 500 μL de tampón de lisis 2x al pellet, mezcle bien y vórtice durante 30 s. 
	NOTA: Es posible que se requiera un pipeteo vigoroso y un vórtice para lisar completamente el pellet. Algunos residuos insolubles (es decir, ADN) son aceptables, ya que se eliminan en la siguiente etapa de sonicación.</li>
	<li>Sonicar el lisado celular en hielo (tres ráfagas, 20 s cada una, 60% de ciclo de trabajo).</li>
	<li>Centrifugar el lisado para pellet los restos restantes (10 min a 17.200 × g a 4 °C).</li>
	<li>Mientras se centrifuga el lisado, agregue 100 μL de perlas de resina de neutravidina y agarosa a una columna de filtración. Conecte la columna a un colector de vacío, aplique una aspiradora suave y lave las perlas haciendo fluir 3 mL de tampón de lavado 1 sobre ellas.</li>
	<li>Retire la columna de filtración del colector de vacío, tape la parte inferior y agregue el lisado celular clarificado a la columna con las perlas. Tapar la parte superior de la columna e incubar el lisado con las perlas en un rotor de extremo a extremo durante 120 min a 4 °C. 
	NOTA: Al tapar la parte superior de la columna, sostenga firmemente la tapa inferior en su lugar, de lo contrario, puede desprenderse y el lisado celular puede filtrarse durante la incubación.</li>
	<li>Prepare los tampones de lavado 1, 2 y 3 (aproximadamente 5 mL de cada tampón de lavado por muestra, consulte la Tabla 1) y colóquelos en un baño de agua a 42 °C</li>
	<li>Una vez que el lisado haya terminado la incubación, vuelva a colocar la columna de filtración en el colector de vacío, aplique un vacío suave y lave las perlas haciendo fluir 5 mL de tampón de lavado 1 sobre ellas. 
	NOTA: Se pueden utilizar más de 5 ml de los tampones de lavado para el lavado; El lavado adicional puede reducir la unión no específica del fondo a las cuentas.</li>
	<li>Repita el paso de lavado con 5 ml de tampón de lavado 2.</li>
	<li>Repita el paso de lavado con 5 ml de tampón de lavado 3.</li>
	<li>Una vez que el tampón de lavado final haya fluido completamente a través de las perlas, retire la columna del colector. Añada 100 μl de solución "Lyse" a las perlas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL con una pipeta. Gire brevemente el tubo para asentar las perlas y retire 50 μL de la solución sin alterar las perlas asentadas. 
	NOTA: Los reactivos de este paso y de todos los pasos posteriores utilizan un kit de preparación de muestras de proteómica disponible en el mercado. El kit proporciona un flujo de trabajo de preparación de muestras optimizado y simplificado. Sin embargo, estos pasos también se pueden realizar independientemente del kit, utilizando un flujo de trabajo de proteómica tradicional como se describe en Verma et al.9. Si las cuentas permanecen pegadas al costado o a la parte inferior de la columna, permita que las cuentas que se han transferido al tubo se asienten y use una solución "Lyse" adicional en el tubo para transferir las cuentas restantes.</li>
	<li>Coloque el tubo en un bloque de calor/agitador a 65 °C y agite a 1.000 rpm durante 10 min. 
	NOTA: Este paso es necesario para la reducción y alquilación de los residuos de cisteína antes de la digestión.</li>
</ol>
3. Digestión de proteínas
<ol>
	<li>Vuelva a suspender la tripsina seca (tubo "Digest" en el kit, almacenado a -20 °C) añadiendo 210 μL de la solución "Resuspend". Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarte de que toda la tripsina seca se vuelva a suspender.</li>
	<li>Una vez completada la incubación, agregue 50 μL de la solución de tripsina resuspendida a las perlas. Incubar el tubo a 37 °C, agitando a 500 rpm durante al menos 90 minutos para digerir la proteína.</li>
	<li>Una vez completada la digestión, transfiera la solución que contiene las perlas a una columna de centrifugación e inserte la columna en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL. Girar el tubo (500 × g durante 5 min a temperatura ambiente [RT]) para separar la solución peptídica digerida de las perlas. 
	NOTA: En esta etapa, el tratamiento con PNGasa se puede realizar en las perlas una vez que se separan de la solución peptídica, para eluir los fragmentos de péptidos biotinilados de las perlas de estreptavidina. Esta muestra de péptidos se puede transportar a través del resto del flujo de trabajo como una muestra de péptido secundaria separada que se puede analizar y comparar con la muestra primaria de la tripsinización en cordón. Es probable que el enfoque PNGase proporcione datos complementarios a la tripsinización en perlas, dada la especificidad adicional para las asparaginas N-glicosiladas capturadas basadas en la modificación de la cadena lateral detectable por MS12. Sin embargo, el inconveniente de este enfoque de elución secuencial es el requisito de dos veces el tiempo del instrumento del espectrómetro de masas por análisis de muestra.</li>
	<li>Añadir 100 μL de la solución "Stop" para detener la reacción de digestión y acidificar la solución peptídica.</li>
</ol>
4. Desalinización de péptidos
<ol>
	<li>Con un adaptador de tubo, coloque una columna de desalinización en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL. Agregue toda la solución de péptido acidificado a la columna. Gire la columna (3.800 × g durante 3 minutos) para que la solución fluya a través de la columna. Los péptidos ahora están unidos a la columna; Deseche el flujo.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución "Wash 1" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Deseche el flujo.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución "Wash 2" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Deseche el flujo.</li>
	<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mL, etiquetado. Añadir 100 μL de solución "Elute" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Añadir otros 100 μL de solución "Elute" a la columna y centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Los péptidos ahora se eluyen de la columna al tubo.</li>
	<li>Coloque la solución peptídica en una centrífuga al vacío y deje que se seque durante la noche. Coloque los péptidos secos a -80 °C hasta que estén listos para cuantificar y analícelos en el espectrómetro de masas.</li>
</ol>
5. Resuspensión y cuantificación de péptidos
<ol>
	<li>Vuelva a suspender los péptidos secos en 20 μL de disolvente A (0,1% de ácido fórmico, 2% de acetonitrilo).</li>
	<li>Centrifugar los péptidos resuspendidos (17.200 × g durante 10 min) para pellet cualquier residuo insoluble.</li>
	<li>Preparar patrones de péptidos para el ensayo de cuantificación colorimétrica de péptidos.
	<ol>
		<li>Coloque 5 μL de solución madre peptídica de 1,000 mg/mL en un pocillo de una placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Realice una dilución en serie de siete pasos en la placa con agua desionizada (DI), de la siguiente manera, con 5 μL de cada patrón por pocillo: 1.000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL y 15,625 mg/mL. Coloque 5 μL de agua desionizada en un octavo pozo para el blanco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque 4 μL de agua desionizada en tres pocillos separados de la placa de 96 pocillos. Agregue 1 μL de la solución de péptido resuspendido a cada pocillo, para un volumen total de 5 μL. 
	NOTA: Al pipetear la solución peptídica para la cuantificación, pipetee cuidadosamente desde la parte superior de la solución para evitar alterar los residuos sedimentados.</li>
	<li>Calcule la cantidad de reactivo de trabajo que se necesita (se requieren 45 μL por pocillo). Prepare el volumen requerido del reactivo de trabajo del ensayo colorimétrico; vórtice el reactivo de trabajo para asegurar la mezcla adecuada de los componentes.</li>
	<li>Añada 45 μL del reactivo de trabajo a cada uno de los pocillos patrón y de muestra. 
	NOTA: Realice los patrones por duplicado y utilice una pipeta multicanal para garantizar una diferencia mínima en el momento en que se añade el reactivo a los pocillos.</li>
	<li>Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar a 37 °C durante 15 min.</li>
	<li>Analice la placa en un lector automático de placas. Utilice los valores de absorbancia registrados para las muestras estándar para generar una curva estándar lineal. Determine la ecuación de la curva estándar y el valor R2. Si el valor de R2 es razonable (≥0,95), utilice la curva estándar para determinar la concentración de péptidos resuspendidos, teniendo en cuenta la dilución quíntuple en la placa de ensayo colorimétrico.</li>
</ol>
6. Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) análisis de los péptidos digeridos
<ol>
	<li>Ajuste la concentración de las muestras de péptidos a 0,2 μg/μL añadiendo el disolvente A y transfiera 10 μL a un tubo de baja unión a proteínas de 0,6 mL.</li>
	<li>Coloque el tubo en el muestreador automático LC.</li>
	<li>Establezca los parámetros LC y MS/MS, de acuerdo con Figura 2 y Figura 3.</li>
	<li>Inyecte 5 μL (1 μg) de la muestra peptídica en la configuración LC-MS/MS para su análisis. 
	NOTA: Los ajustes de LC-MS/MS que se muestran aquí solo son representativos de las ilustraciones. Dependiendo de la disponibilidad de los instrumentos LC y MS, los usuarios pueden modificar la configuración del gradiente LC y los parámetros MS/MS para obtener una cobertura profunda del proteoma. Para este trabajo, el análisis de datos de MS se realizó utilizando MaxQuant https://www.maxquant.org/, el análisis de datos secundarios se realizó utilizando Perseus https://maxquant.net/perseus/ y el análisis de vías utilizando https://reactome.org/.</li>
</ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+silico+human+surfaceome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The in silico human surfaceome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 10988-10997 (2018).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advance+in+tumor+specific+antigens%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22AME+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research advance in tumor specific antigens: A narrative review.</a> AME Medical Journal. 6, 35(2021).</li>
<li>Li, Y., Qin, H., Ye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+enrichment+methods+for+cell+surface+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling.</a> Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Chandler, K. B., Costello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics+and+glycoproteomics+of+membrane+proteins+and+cell-surface+receptors%3A+present+trends+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities.</a> Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).</li>
<li>Ferguson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfaceome+of+multiple+myeloma+cells+suggests+potential+immunotherapeutic+strategies+and+protein+markers+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance.</a> Nature Communications. 13 (1), 4121(2022).</li>
<li>Karcini, A., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SKBR3+cell-membrane+proteome+reveals+telltales+of+aberrant+cancer+cell+proliferation+and+targets+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10847(2022).</li>
<li>Köhnke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiomic+approach+for+identification+of+novel+immunotherapeutic+targets+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML.</a> Biomarker Research. 10 (1), 43(2022).</li>
<li>Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+workflow+of+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics+of+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e61786(2021).</li>
<li>Leung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+and+thematic+remodeling+of+the+surfaceome+and+glycoproteome+on+isogenic+cells+transformed+with+driving+proliferative+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).</li>
<li>Nix, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+proteomics+reveals+CD72+as+a+target+for+in+vitro-evolved+nanobody-based+CAR-T+cells+in+KMT2A%2FMLL1-rearranged+B-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL.</a> Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+from+T+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Hosen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activated+conformation+of+integrin+%CE%B27+is+a+novel+multiple+myeloma-specific+target+for+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).</li>
<li>Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glycosylation%3A+A+new+road+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery.</a> Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).</li>
<li>Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+proteomics+in+the+discovery+of+cell-surface+markers+on+stem+cells%3A+Scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface.</a> Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).</li>
<li>Itzhak, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+approach+for+mapping+protein+subcellular+localization+reveals+the+spatial+proteome+of+mouse+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons.</a> Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).</li>
<li>Kirkemo, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+tethered+promiscuous+biotinylators+enable+comparative+small-scale+surface+proteomic+analysis+of+human+extracellular+vesicles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells.</a> eLife. 11, 73982(2022).</li>
<li>Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+bottom-up+proteomics+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows.</a> Current Protocols. 1 (3), 85(2021).</li>
<li>Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+popular+proteomics+software+workflows+for+label-free+proteome+quantification+and+imputation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PLoS One. 10 (3), 0121314(2015).</li>
<li>Griss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReactomeGSA-efficient+multi-omics+comparative+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).</li>
<li>Waas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SurfaceGenie%3A+a+web-based+application+for+prioritizing+cell-type-specific+marker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates.</a> Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>van Oostrum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mouse+B+cell+types+using+surfaceome+proteotype+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps.</a> Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).</li>
<li>Berg Luecke, L., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+streptavidin+bead+binding+capacity+to+improve+quality+of+streptavidin-based+enrichment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies.</a> Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La proteómica basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa que ha permitido la caracterización imparcial de miles de proteínas desconocidas a una escala previamente imposible. Este enfoque nos permite identificar y cuantificar las proteínas, así como obtener una variedad de conocimientos sobre las capacidades estructurales y de señalización de células y tejidos, mediante la caracterización de la variedad de proteínas presentes en una muestra en particular. Más allá del perfil global de proteínas en una m...

Las proteínas sirven como las unidades fundamentales por las cuales se llevan a cabo la mayoría de las funciones celulares. Caracterizar la estructura y función de las proteínas relevantes es un paso esencial para comprender los procesos biológicos. Durante la última década, los avances en la tecnología de espectrometría de masas, el software de análisis y las bases de datos han permitido la detección y medición precisas de proteínas a escala de todo el proteoma1. La proteómica basada en espectrometría de masas se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones, desde el análisis científico básico de las vías bioquímicas, hasta la identificación de nuevos objetivos farmacológicos en un entorno traslacional, hasta el diagnóstico y seguimiento de enfermedades en la clínica2. A la hora de seleccionar nuevas dianas farmacológicas, la caracterización del proteoma de la superficie celular es especialmente importante, ya que más del 65% de los fármacos humanos actualmente aprobados se dirigen a las proteínas de la superficie celular3. El campo de la inmunoterapia contra el cáncer también depende totalmente de los antígenos de superficie celular específicos del cáncer para dirigirse y eliminar específicamente las células tumorales4. Por lo tanto, la proteómica basada en espectrometría de masas puede servir como una herramienta prometedora para identificar nuevas proteínas de la superficie celular destinadas a intervenciones terapéuticas.
Sin embargo, existen varias limitaciones cuando se utilizan métodos proteómicos convencionales para estudiar las células tumorales en busca de nuevos objetivos de proteínas de la superficie celular. Una preocupación principal es que las proteínas de superficie constituyen una fracción muy pequeña del total de moléculas de proteínas en una célula. Por lo tanto, los fragmentos de estas proteínas están enmascarados por una gran abundancia de proteínas intracelulares cuando se realiza el análisis de espectrometría de masas del lisado de células completas5. Esta limitación dificulta la caracterización precisa del proteoma de la superficie celular con un flujo de trabajo de proteómica tradicional. Para hacer frente a este desafío, es necesario desarrollar formas de enriquecer las proteínas de la superficie celular a partir del lisado de la célula completa, antes del análisis en el espectrómetro de masas. Uno de estos métodos implica la oxidación y el marcaje de biotina de las proteínas de la superficie celular glicosiladas en las células intactas, y el posterior enriquecimiento de estas proteínas biotiniladas del lisado con un pulldown de neutravidina, un proceso que se ha denominado "captura de superficie celular"6. Dado que se cree que ~85% de las proteínas de la superficie celular de los mamíferos están glicosiladas7, esto sirve como un método eficaz para enriquecer el proteoma de la superficie celular a partir del lisado de toda la célula. Este artículo describe un flujo de trabajo completo, comenzando con células cultivadas, de etiquetado de biotina en la superficie celular y posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas (Figura 1). A lo largo de varias réplicas, este método proporciona una cobertura robusta del proteoma de la superficie celular de una muestra en particular. La utilización de este método para caracterizar el proteoma de la superficie celular tanto de células tumorales como sanas puede facilitar el descubrimiento de nuevos antígenos de superficie celular para identificar posibles dianas inmunoterapéuticas8.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X Kit de preparación de muestras iST</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>Kit de preparación de muestras de proteómica. Incluye reactivos para la reducción, alquilación y digestión. También incluyen columnas de desalinización y reactivos.</td></tr><tr><td>Pierce Ensayo de péptidos colorimétricos cuantitativos</td><td>Thermo</td><td>23275</td><td>Kit de cuantificación de péptidos. Incluye estándares de péptidos y componentes de reactivos de trabajo.</td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidrazida de biocitina</td><td>Biotium</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (sin sales de calcio y magnesio)</td><td>Instalación de cultivo celular de UCSF</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Halt Inhibidor de la proteasa y la fosfatasa cóctel de un solo uso</td><td>Thermo</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>resina de agarosa de neutravidina de alta capacidad</td><td>Thermo</td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Instalación de cultivo celular UCSF</td><td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis RIPA, 10x</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Metaperiodato de sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripano (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Urea (grado proteómico)</td><td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR Microcentrífuga</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>VWR</td><td>Branson Sonifier 240</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor de agitación</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de extremo a extremo</td><td>Labnet</td><td>Revólver Rotador</td><td></td>ajustable</tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC y UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Espectrómetro de masas Thermo</td><td></td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Biotek</td><td>Biotek Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vacío</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos LoBind de</td> proteínas <td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Tubos</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrífuga</tr><tr><td>Columnas de filtración</td><td>Bio-Rad</td><td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de centrifugación</td><td>Thermo</td><td>69725</td><td></td></tr></tbody></table>

flujo de trabajo "cell surface capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Durante la última década, la proteómica basada en espectrometría de masas ha permitido una caracterización en profundidad de sistemas biológicos en una amplia gama de aplicaciones. El proteoma de la superficie celular ("surfaceoma") en las enfermedades humanas es de gran interés, ya que las proteínas de la membrana plasmática son el objetivo principal de la mayoría de las terapias clínicamente aprobadas, así como una característica clave para distinguir diagnósticamente las células enfermas de los tejidos sanos. Sin embargo, la caracterización enfocada de las proteínas de membrana y superficie de la célula ha seguido siendo un desafío, principalmente debido a la complejidad de los lisados celulares, que enmascaran las proteínas de interés por otras proteínas de alta abundancia. Para superar esta barrera técnica y definir con precisión el proteoma de la superficie celular de varios tipos de células utilizando la proteómica de espectrometría de masas, es necesario enriquecer el lisado celular para las proteínas de la superficie celular antes del análisis en el espectrómetro de masas. Este artículo presenta un flujo de trabajo detallado para el etiquetado de proteínas de la superficie celular de células cancerosas, el enriquecimiento de estas proteínas a partir del lisado celular y la posterior preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas.

Para este experimento, caracterizamos el proteoma de la superficie celular de una línea celular tumoral mediante etiquetado N-proteínas de membrana glicosiladas de células intactas con biotina, y enriquecer estas proteínas marcadas a partir del lisado total de células mediante una precipitación con neutravidinaFigura 1). Además, realizamos un análisis del proteoma mediante LC-MS/MS para caracterizar las proteínas de superficie celular enriquecidas. A diferencia del análisis del prot...

Aquí, describimos un flujo de trabajo de proteómica para la caracterización del proteoma de la superficie celular de varios tipos de células. Este flujo de trabajo incluye el enriquecimiento de proteínas en la superficie celular, la posterior preparación de muestras, el análisis mediante una plataforma LC-MS/MS y el procesamiento de datos con software especializado.

Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Este protocolo nos permite investigar antígenos presentes en la superficie celular de varios tipos de células para encontrar antígenos específicos de ese tipo de célula o tejido. La técnica que presentamos aquí permite el enriquecimiento de las proteínas de la membrana celular a partir de un lisado de célula entera y, en última instancia, el análisis mediante proteómica basada en espectrometría de masas. Por lo tanto, una aplicación específica de este protocolo es aplicarlo a las células tumorales para buscar antígenos presentes en la superficie de esas células cancerosas y no células normales que podrían servir como nuevos objetivos para las inmunoterapias contra el cáncer.Una cosa a tener en cuenta sobre este protocolo es que puede ser importante optimizar la entrada de muestra para el experimento de interés. Por lo tanto, es posible que se necesiten varias iteraciones o valoraciones para encontrar las condiciones óptimas. Así que la demostración del procedimiento correrá a cargo de Akul Naik, un especialista junior de nuestro laboratorio.Para comenzar, retire el pellet de células congeladas marcadas con biotina a menos 80 grados centígrados y descongélelo en hielo. Agregue 500 microlitros de 2X Lysis Buffer al pellet, mezcle bien y agite vigorosamente durante 30 segundos. Sonicar el lisado celular en hielo y centrifugar el lisado a 17,200 G durante 10 minutos a 4 grados centígrados para peltear los restos restantes.Mientras el lisado se centrifuga, agregue 100 microlitros de perlas de resina NeutrAvidin Agarose a una columna de filtración conectada al colector de vacío. Aplique una aspiradora suave y lave las perlas haciendo fluir 3 mililitros de Wash Buffer 1 sobre ellas. Retire la columna de filtración del colector de vacío, tape la parte inferior y agregue el lisado celular clarificado a la columna con las perlas.Tape la parte superior de la columna e incube el lisado con las perlas en un rotor de extremo a extremo durante 120 minutos a 4 grados centígrados. Después de completar la incubación del lisado, vuelva a colocar la columna de filtración en el colector de vacío y aplique un vacío suave. Lave las perlas haciendo fluir cinco mililitros de tampón de lavado 1 sobre ellas.Repita el paso de lavado con cinco mililitros de tampón de lavado 2 y tampón de lavado 3. Una vez que el tampón de lavado final haya fluido completamente a través de los cordones, retire la columna del colector. A continuación, añada 100 microlitros de solución de lisa a las perlas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mililitros con una pipeta.Gire brevemente el tubo para asentar las cuentas y retire 50 microlitros de la solución. A continuación, coloque el tubo en un agitador de bloques de calor a 65 grados centígrados durante 10 minutos a 1000 RPM agitando. Vuelva a suspender la tripsina seca en el tubo de digestión del kit agregando 210 microlitros de la solución de resuspensión y pipeteándola hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que toda la tripsina seca se vuelva a suspender.Al final de la incubación de las perlas, retírelo del agitador de bloques de calor y agregue 50 microlitros de la solución de tripsina resuspendida a las perlas. Incubar el tubo a 37 grados centígrados, agitando a 500 RPM durante al menos 90 minutos para digerir la proteína. Una vez completada la digestión, transfiera la solución que contiene las perlas a una columna de centrifugación e inserte la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros de baja unión a proteínas.Gira el tubo para separar la solución peptídica digerida de las perlas. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución de parada para detener la reacción de digestión y acidificar la solución peptídica. Con un adaptador de tubo, coloque una columna de desalinización en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mililitros.Agregue toda la solución de péptido acidificado a la columna. Gire la columna a 3.800 G durante 3 minutos, de modo que la solución fluya a través de la columna. Descarte el flujo a través, ya que los péptidos ahora están unidos a la columna.Agregue 200 microlitros de solución Wash 1 a la columna, centrifugue a 3, 800 G durante 3 minutos a temperatura ambiente y luego deseche el flujo. Repita el paso de lavado con 200 microlitros de solución Wash 2. Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,7 mililitros etiquetado.Añadir 100 microlitros de solución de elución a la columna y centrifugar a 3.800 G durante 3 minutos a temperatura ambiente. Los péptidos ahora se eluyen de la columna al tubo. Coloque la solución peptídica en una centrífuga al vacío y deje que se seque durante la noche.Coloque los péptidos secos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para cuantificar y analizar en el espectrómetro de masas. Se realizó un análisis de proteoma para caracterizar las proteínas de la superficie celular enriquecidas mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem. Se obtuvo una concentración final de péptidos de aproximadamente 630 nanogramos por microlitro mediante el ensayo de cuantificación colorimétrica de péptidos.Los datos de espectrometría de masas analizados con MaxQuant y el posterior análisis del conjunto de datos de las proteínas de la superficie celular arrojaron 601 proteínas de superficie en la muestra, aproximadamente el 27% de todas las proteínas identificadas. Aquí se muestra un gráfico que representa la distribución de la proteína identificada en la puntuación de Andrómeda, y el diagrama de dispersión ilustra la correlación entre muestras. Los diagramas de caja representaban la variación de una ejecución a otra.Y el gráfico de distribución muestral representó la calidad de los datos de las réplicas. Lo más importante a tener en cuenta es dónde están los péptidos en cada paso. Inicialmente, están en solución, luego, se unen a las perlas hasta la digestión, luego, se unen a la columna de desalinización hasta que finalmente se eluyen.Siguiendo este procedimiento, hay varias formas de validar un puñado de las proteínas identificadas, como la citometría de flujo dirigida y la proteómica dirigida. Esto proporcionará información más detallada sobre los niveles de expresión de estas proteínas en la muestra.

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

La comunicación entre celulares es fundamental para el control de diversas actividades fisiológicas dentro y fuera de la célula. En este trabajo se describe un protocolo para la medición de la naturaleza espacio-temporal de las secreciones de células individuales. Para ello, se utiliza un enfoque multidisciplinario que integra nanoplasmonic etiqueta libre de detección con imágenes de células vivas.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Descrito es un flujo de trabajo proteómico para identificar socios de interacción de proteínas a partir de una fracción subcelular nuclear utilizando el enriquecimiento de inmunoafinidad de una proteína dada de interés y espectrometría de masas sin etiquetas. El flujo de trabajo incluye fraccionamiento subcelular, inmunoprecipitación, preparación de muestras asistidas por filtro, limpieza fuera de línea, espectrometría de masas y una canalización bioinformática aguas abajo.

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Aprenda a cuantificar el proteoma de superficie celular mediante captura de membrana y espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite identificar antígenos específicos en células tumorales para inmunoterapia.

Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

Explorar más videos