Modelado de enfermedades mitocondriales utilizando organoides cerebrales: un enfoque en la encefalomiopatía mitocondrial, la acidosis láctica y los episodios similares a accidentes cerebrovasculares

El objetivo de nuestra investigación es comprender los medidores de enfermedad mitocondrial y encontrar fármacos para tratarla. El reto es mantener la capacidad para ensayos de alto rendimiento, aunque la técnica contenga formación de organoides. Para empezar, retira el medio de las placas de cultivo pluripotente inducidas cuando estén aproximadamente entre un 70 y un 80% de confluencia.

Lava las células con PBS. Añade 350 microlitros de solución enzimática a las células e incuba. Añade 800 microlitros de medio de ajuste para tallos para detener la reacción.

Tras transferir la suspensión de la celda a un tubo nuevo, centrifugarla a 190G durante cinco minutos a 22 grados Celsius. A continuación, vuelve a suspender el pellet en un mililitro de medio de diferenciación. Tras contar las células, siembra 3000 células en 100 microlitros en cada pozo de una placa de unión baja en forma de U de 96 pozos.

Incubar durante seis días a 37 grados Celsius, con un 5% de dióxido de carbono. Tras la incubación, se utiliza una pipeta de gran calibre para transferir los organoides desde la placa de 96 pozos a una placa de 10 centímetros. Pipetear 50 microlitros de medio suplementado DMEM/F12 en cada pozo de una nueva placa de 96 pozos.

Recoge los organoides en tubos de dos mililitros. Retira el medio con cuidado sin aspirar los organoides y añade 1,5 mililitros de medio suplementado de DMEM/F12. Después de pipetar el último lavado, añade 500 microlitros de medio fresco.

Luego transfiere los organoides a una placa de 10 centímetros. Añade cinco mililitros de medio para facilitar la selección de cada organoide. Transfiere todos los organoides a cada pozo de una placa de 96 pozos usando una micropipeta ajustada a 50 microlitros, e incubar durante tres días.

En el noveno día, recoge los organoides en tubos de dos mililitros y lávate tres veces con DMEM/F12. Luego vuelve a suspender los organoides en un medio de diferenciación. Transfiere aproximadamente 10 organoides por pozo a una placa de seis pozos y ajusta el volumen final de medio en cada pozo a dos mililitros.

Cultiva la placa de forma estática durante seis días a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. El día 15, recoge los organoides en tubos de 15 mililitros. Después de dejar que los tubos se asienten, añade un nuevo medio de diferenciación suplementado con B27 y vitamina A tras pipetear el sobrenadante.

Transfiere aproximadamente 10 organoides por pozo a una placa de seis pozos. Cultiva el organoide de forma estática durante 15 días a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Recubre las placas de cultivo con la solución diluida de poli-L-Ornitina.

Incuba las placas durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, lava los pozos tres veces durante cinco minutos cada una con PBS. Ahora añade solución de laminina diluida a los pozos.

Incuba las placas durante tres horas a 37 grados Celsius, o durante la noche. Centrifuga la suspensión organoide a 200G durante cinco minutos. Retira el sobrenadante y añade un mililitro de solución enzimática.

Mezcla bien e incuba a 37 grados Celsius durante cinco minutos antes de centrifugar. Tras retirar el sobrenadante y añadir un mililitro de solución de dispersión, coloca cuidadosamente la solución aislante bajo la suspensión. Luego centrifuga la suspensión a 200G durante cinco minutos.

Ahora, pipeta un mililitro de medio neuronal en el tubo. Mezcla la solución y pasa la suspensión por un colador de 70 micrómetros hasta un tubo de 50 mililitros. Tras contar las células, sembra la suspensión celular a una densidad de 100.000 celdas por centímetro cuadrado sobre placas recubiertas de poli-L-Ornitina y laminina.

Cambia el medium cada cuatro a siete días hasta el día 60. Para fijar los organoides y crear inmunofluorescencia, primero se extraen los organoides en microtubos. Enjuaga los organoides con PBS y luego fija los organoides en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la fijación, lava los organoides fijos tres veces con PBS. Guarda los organoides a cuatro grados Celsius hasta que se usen. 30 días después de la siembra para el cultivo neuronal 2D, retira el medio de cultivo de las placas.

Luego lava las células con PBS. Fija las células con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Extrae el paraformaldehído y luego lava las células con PBS tres veces.

Guarda las celdas fijas a cuatro grados Celsius hasta que se usen. Para recoger los organoides para RTQPCR, transfiere los organoides a microtubos. Pipetear PBS en los tubos para lavar los organoides.

Ahora, añade 350 microlitros de tampón de lisis a los organoides y luego congela rápidamente en nitrógeno líquido. Guarda los tubos a menos 80 grados Celsius hasta que los uses. Se indujeron con éxito organoides cerebrales que contenían neuronas positivas para FOXG1 a partir de la línea IPSC sana 414C2 en el día 30, y se obtuvieron redes neuronales cultivadas en 2D al día 60.

Los niveles de heteroplasmia de la variante M.3243A a G fueron confirmados por QPCR. Las líneas dos a ocho tenían baja heteroplasmia, y las líneas dos a seis tenían alta heteroplasmia. Los organoides cerebrales derivados de la línea de baja heteroplasmia dos a ocho mostraron tamaños y morfologías similares a los de controles sanos.

Los organoides generados a partir de la línea de alta heteroplasmia dos a seis mostraron un tamaño reducido de 0,3 milímetros cuadrados y morfología irregular con un valor de circularidad de 0,82. La mayoría de las neuronas inducidas a partir de la línea 414C2 y de la línea dos a la línea ocho fueron positivas en FOXG1 en los días 30 y 60. Las neuronas positivas para FOXG1 rara vez se detectaron en organoides o en neuronas cultivadas en 2D derivadas de la línea dos a seis.

Nuestros resultados sugieren que los modelos organoides basados en IPSC derivados del paciente representan una plataforma útil para estudiar espejos, mecanismos y para el cribado de fármacos. Nuestros métodos convencionales, con un tiempo de cultivo corto y una rentabilidad, ofrecen herramientas prácticas para investigar la fisiopatología de MELIS. Nos gustaría buscar posibles fármacos para MELIS utilizando compuestos con administración de pacientes organizados en el futuro.