Name: Un flujo de trabajo modular para el análisis cuantitativo, estructural y funcional de biopelículas de Leptospira (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a analizar biopelículas de Leptospira mediante ensayos de cristal violeta, microscopía confocal y electrónica de barrido. Este protocolo modular estandariza la evaluación cuantitativa, estructural y funcional para investigación reproducible.

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<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 & micro; Membrana hidrofílica estéril de policarbonato</td><td>it4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio estéril de 12 mm</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% de paraformaldehído (PFA) y nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 21G</td><td>BD Medicina</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 24 pozos</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>Plato de fondo de cristal de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>Plato Hi-Q4 con fondo de cristal de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pozos</td><td>NIDO</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje antifade y nbsp;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>Recubridor de carbono</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>Trazador CFDA/SE</td><td>Bioleyenda</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo carbón conductor</td><td>Ciencia de la Microscopía Electrónica</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>Violeta cristalino (CV)</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo oscuro</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B equipada con condensador fiel oscuro (cat n&deg 11505142)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>Microscopio confocal SP8</td></tr><tr><td>Microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>Leptospira Base Media EMJH&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&nbsp; 279410</td><td>Medio EMJH para Leptospira</td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio (OsO4)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>Propidium yodur&nbsp;</td><td>Biotium</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>Amortiguador de cacodilato sódico &nbsp;</td><td>Química Termocientífica</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Varioskan Lux</td><td>Termo Científica</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina estéril tamponada con fosfato</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>Jeringuilla (1 mL)</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de ácido nucleico fluorescente verde SYTO9 &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

un flujo de trabajo modular para el análisis cuantitativo, estructural y funcional de biopelículas de leptospira

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

Cuando el inóculo se prepara correctamente, los cultivos entran en fase de logaritarítmica en 3-5 días y muestran valores de OD405 de ~ 0,2-0,4, con campos brillantes y altamente móviles bajo microscopía de campo oscuro (≥ el 90% de las células móviles) y sin grumos visibles. Las preparaciones subóptimas se presentan como bacterias lentas y motilidad heterogénea en todo el campo; Estas culturas suelen producir biofilms débiles y deben descartarse. En la práctica, confirmar la motilidad y la OD lado a lado justo antes de la siembra minimiza las pruebas fallidas. Establecer estas compuertas de control de calidad en la etapa del inoculo es el mejor predictor de éxito en aplicaciones posteriores. Aunque la metodología se optimizó para L. interrogans serovar Manilae L495, los mismos procedimientos también se aplicaron a la cepa Leptospira biflexa Patoc para demostrar la aplicabilidad entre especies. L. biflexa generalmente forma biopelículas menos cohesivas y más delgadas en comparación con L. interrogans, pero la secuencia característica del desarrollo y las características estructurales siguen siendo detectables con ajustes adecuados de parámetros. Incluir ambas especies subraya así la adaptabilidad del flujo de trabajo tanto a Leptospira patógenos como saprófitos.
Tras 21 días de incubación estática a 30 °C en una cámara humidificada (o el tiempo adecuado para la especie de Leptospira utilizada), las biopelículas se hacen visibles a simple vista tanto en las cubiertas de vidrio como en las membranas hidrofílicas de policarbonato. El crecimiento exitoso produce patrones CV característicos tras 2-3 semanas, como huellas punticuladas, ramificadas o reticuladas adheridas a la superficie (Figura 2A).
En una partida típica, L. interrogans tipo salvaje Manilae L495 alcanza ~ 50% de cobertura superficial en la semana 3, mientras que los mutantes con bajo biofilm se estancan cerca del ~ 20% y los fenotipos de alto biofilm se acercan al ~ 70-80%, estableciendo un rango dinámico práctico para el cribado. El grado de formación de biofilm también puede variar dependiendo de la especie y la cepa de Leptospira ; por ejemplo, la cepa de L. biflexa Patoc desarrolla biofilms visibles más rápidamente, y estudios previos consideraban estructuras tan pronto como 120 horas después de la inoculación como biopelículasmaduras 35.
La tinción de violeta cristalina proporciona un método fiable y reproducible para cuantificar la biomasa de biofilm. En biopelículas bien desarrolladas, la tinción da lugar a una coloración púrpura intensa localizada en la zona de la cubierta o membrana, lo que indica altos niveles de biomasa adherida (Figura 2A). Las señales visuales durante los pasos de tinción y solubilización también proporcionan indicadores útiles del éxito del protocolo. Por ejemplo, una distribución desigual de la CV o la mancha pálida pueden deberse a la subsiembra, evaporación o lavado agresivo que desprende biopelículas tempranas.
Las lecturas de absorbancia a 570 nm reflejan la cantidad de tinte retenido y, por tanto, la densidad relativa de biofilm (Figura 2B). En experimentos representativos, los cultivos de L. interrogans cultivados bajo condiciones óptimas muestran lecturas consistentes y reproducibles de OD₅₇₀ entre réplicas, reflejando una formación estable de biopelículas. En cambio, a menudo se observan grandes variaciones entre réplicas cuando las muestras sufren un pipeteo excesivo durante los cambios de medio, lo que indica una mala adhesión o desprendimiento parcial de biopelícula. Dicha variabilidad debe considerarse un signo de problemas técnicos, y las muestras afectadas deben ser excluidas o el protocolo revisado cuidadosamente. Cabe destacar que L. biflexa Patoc forma biopelículas más extensas tanto en las cubiertas de vidrio como en las membranas de policarbonato bajo condiciones similares, lo que se refleja en valores de absorción CV más altos, demostrando que el protocolo es adaptable y eficaz entre especies de Leptospira .
Una preparación exitosa del SEM puede revelar depósitos de matriz extracelular tan pronto como el día 3, seguidos de una arquitectura notablemente polarizada en biopelículas maduras: una cara basal rugosa y canalizada (a menudo con &gt; canales de 5 μm) que ancla una estructura interna porosa, y una cara apical más lisa donde las espiroquetas yacen entrelazadas en una matriz densa (Figura 2C, D, E, F). Los campos de alta magnificación capturan frecuentemente filamentos extracelulares ramificados y ocasionales protuberancias similares a setas; características que corresponden a la dinámica de coalescencia observada por el time-lapse (vídeo suplementario 1). En preparaciones subóptimas, pueden observarse matrices colapsadas, cargas y contornos celulares indistintos, que suelen reflejar una postfijación inadecuada, un recubrimiento conductor insuficiente o un secado deficiente. Cuando la polaridad basal-apical y los canales penetrantes son evidentes, las lecturas del SEM coinciden estrechamente con las estimaciones confocales de grosor y porosidad, confirmando la ejecución exitosa tanto de la preparación como de la imagen.
En series efectivas de time-lapse, los puntos aislados aparecen en un plazo de 24-72 horas y se agrupan progresivamente en agregados mayores que barren la superficie antes de que las limitaciones de espacio ralenticen su movimiento (Figura 3A, B, C). La segmentación cuantitativa produce un aumento monótono en el área total cubierta, mientras que los conteos agregados aumentan, alcanzan su pico y luego disminuyen a medida que las colisiones y fusiones dominan entre ~12 y 216 horas. Estas cinéticas (área hacia arriba, agregados en número inferior) indican acreción activa en lugar de simple sedimentación. Las carreras fallidas o al borde carecen de puntos tempranos, muestran curvas de área plana a lo largo del tiempo o sufren deriva de enfoque relacionada con temperatura/humedad inestables. Mantener un entorno estabilizado de 30 °C con un 95% de humedad y usar el enfoque automático en cada momento suele restaurar trayectorias claras adecuadas para comparar mutantes o tratamientos.
Pilas Z representativas de biofilms maduros muestran una arquitectura multicapa similar a espuma que suele superar los 50 μm de grosor, con la mayoría de las células teñiendo vivas (SYTO 9-positivo) y ocasionales vacíos centrales indicativos de reordenamientos colectivos durante el crecimiento (Figura 3D). Las sondas matriciales pueden utilizarse para investigar la composición matricial: WGA destaca epítopos polisacáridos, BOBO-3 marca abundante ADN extracelular y las tinciones selectivas para proteínas aportan poco fuera de la señal asociada a la célula (Figura 3E). Los resultados subóptimos incluyen pilas delgadas o discontinuas dominadas por yoduro de propidio, fotoblanqueo fuerte o ajustes de ganancia inconsistentes, cada uno de los cuales socava la comparabilidad cuantitativa. Interpretar conjuntamente el espesor, el biovolumen y las proporciones vivas/muertas (manteniendo constante la potencia láser, la ganancia del detector y el orificio estenopeico en todas las condiciones) confirma el estado de maduración y permite comparaciones directas con la ultraestructura del SEM y la biomasa CV.
El proceso de formación de biofilm de Leptospira suele seguir fases distintas, aunque los tiempos y valores exactos pueden variar según la especie o la cepa. Usando la cepa L. interrogans Manilae L495 como referencia, la progresión esperada durante 21 días incluye una fase inicial (días 0-3) en la que las bacterias permanecen mayormente planctónicas con biofilm mínimo (Figura 4A). Esto es seguido por una fase de crecimiento exponencial (días 3-7) durante la cual tanto las bacterias planctónicas como las asociadas a biofilm aumentan, alcanzando alrededor de 9 x 10⁸ células/mL, acompañadas de la formación y expansión de agregados de biofilm. Entre los días 7 y 12, las bacterias planctónicas disminuyen significativamente, mientras que las células asociadas a biopelículas alcanzan su pico, representando aproximadamente el 80% de la población. Finalmente, durante la fase de maduración (días 12-21), el número de bacterias de biofilm disminuye sin aumentar las células planctónicas, aunque el tamaño y la complejidad de la biopelícula continúan creciendo. Observar esta secuencia de cambios indica que el protocolo captura eficazmente el desarrollo dinámico y la maduración de las biopelículas de Leptospira .
Cuando se realiza correctamente, el protocolo de infección utiliza inóculos que contienen ~2 leptospiras de 10⁸ en 200 μL de EMJH, preparadas a partir de cultivos planctónicos bien definidos (5 días) o biofilm (21 días). Aunque estos dos tipos de cultivo representan estados fisiológicos distintos, esta diferencia es intencionada, ya que el experimento busca determinar si los biofilms de Leptospira —caracterizados por una actividad metabólica reducida y diferenciación estructural— mantienen la capacidad de iniciar la infección. Este contraste está respaldado por estudios transcriptómicos que muestran grandes cambios en la expresión génica entre planctónica y biopelícula Leptospira35,36. Los agregados de biofilm se cosechan cuidadosamente para preservar su estructura y permanecen intactos tras pasar por una aguja de 21 G, como se confirma antes de la inyección (Figura 4C, D). Tras la inyección intraperitoneal, los hámsters sirios dorados suelen mostrar signos clínicos de leptospirosis en un plazo de 3 a 5 días (por ejemplo, letargo, pelaje despeinado, postración). Los controles negativos inyectados solo con medio EMJH no muestran signos de enfermedad. La progresión y gravedad de los signos clínicos, así como el tiempo hasta la eutanasia, varían según el inóculo: las bacterias planctónicas suelen inducir síntomas más tempranos y agudos, mientras que los agregados derivados de biofilm pueden causar una infección retardada pero persistente (Figura 4B). Monitorizar dos veces al día durante hasta 21 días permite captar el curso completo de la enfermedad.
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Tinción, cuantificación e imágenes ultraestructurales de violeta cristalino de biopelículas de Leptospira. (A) Tinción de violeta cristalino (CV) de biofilms crecidos sobre diferentes sustratos. La tinción CV permite visualizar la arquitectura de biofilm y los patrones iniciales de fijación para diferentes especies y sustratos. i. L. interrogantes sobre filtros de policarbonato; ii. L. biflexa en filtro de policarbonato; iii. L. interrogantes sobre la cubierta de cristal; iv. L. biflexa sobre cubierta de cristal. (B) Ejemplo de formación cuantitativa de biofilm evaluada mediante la absorbancia CV (OD570 nm) a lo largo del tiempo para L. interrogans y L. biflexa. Esta lectura cinética captura tanto la dinámica temprana de adhesión como la acumulación de biomasa, destacando diferencias en el crecimiento de biopelículas entre especies patógenas y saprófitas. Esta cifra ha sido modificada respecto a27. (C-E) Microscopía electrónica de barrido (SEM) de biopelículas de L. interrogans: (c) biopelícula de hace 3 días que muestra la formación temprana de microcolonias y la deposición inicial de la matriz extracelular; (d) biofilm de 14 días que muestra arquitectura madura con una extensa organización matricial y tridimensional; (e-f) Biofilm de 3 semanas que ilustra la consolidación estructural y la maduración de la matriz sobre cultivos prolongados. Esta combinación de tinción CV, mediciones cuantitativas de OD e imágenes SEM ofrece una visión completa del desarrollo de biopelículas, desde la inserción temprana hasta la organización ultraestructural madura, permitiendo la comparación directa entre especies y duraciones de cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Visualización de la formación de biofilm de Leptospira . Las imágenes de contraste de fase adquiridas con una BioStation muestran el desarrollo de biofilm a (A) 48 h, (B) 96 h y (C) 144 h. (D) reconstrucción CLSM de un biofilm de Leptospira que muestra biovolumen total con cortes ortogonales para visualización 3D. (E) Tinción confocal de una biopelícula madura con DAPI (verde) y WGA (rojo), destacando células bacterianas y componentes de la matriz extracelular. Esta cifra ha sido modificada respecto a37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Cuantificación resuelta en el tiempo de fracciones planctónicas y biofilmadas y evaluación funcional de biopelículas de Leptospira . (A) La cinética de la formación de biofilm medida por absorbancia a 405 nm. Para cada punto temporal, se tomaron lecturas del pozo total, la fracción de biofilm y el sobrenadante que contiene leptospiras planctónicas, permitiendo distinguir entre bacterias adheridas y bacterias que nadan libremente. (B) Ejemplos de curvas de supervivencia de hámsters inyectados con agregados de biofilm, leptospiras planctónicas o control EMJH. Los animales inyectados con biofilm muestran una virulencia reducida, algunos sobreviviendo 21 días, mientras que las leptospiras planctónicas provocan una mortalidad rápida. (C-D) Validación preliminar de la integridad del biofilm: los agregados son visibles en la jeringuilla antes de la inyección (C) y permanecen intactos tras pasar por una aguja de 21 G (D, flechas blancas), confirmando que la estructura del biofilm se conserva durante el manejo. Esta cifra ha sido modificada respecto a36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

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