Un flujo de trabajo modular para el análisis cuantitativo, estructural y funcional de biopelículas de Leptospira

Estudiamos biofilms como estructuras protectoras que permiten la persistencia ambiental y del huésped, investigando la dinámica de la formación, la composición molecular, las características adaptativas y la contribución a la infección. Combinar bioanálisis cristalino, imagen por texto temporal, microscopía confocal, microscopía electrónica de barrido y transcriptómica en nuestros laboratorios impulsa la investigación en biofilm mediante análisis multidimensional integrado. Para empezar, cultiva células de Leptospira en medio EMJH en tubos de vidrio con tapa de rosca de fondo plano.

Incubar los cultivos en condiciones aeróbicas a 30 grados Celsius sin agitar hasta que alcancen la fase logarítmica media. Asegurarse de que los cultivos alcancen una densidad óptica entre 0,2 y 0,4 a 405 nanómetros, lo que corresponde a dos a cinco veces diez a la potencia de ocho celdas por mililitro. Utilizando un microscopio de campo oscuro a 20x de aumento, verifica que las células estén en modales y no agrupadas.

Diluir el cultivo arrítmico arrítmico de log medio verificado a una proporción de uno a 100 en un medio EMJH fresco para obtener aproximadamente una vez 10 a la potencia de seis células por mililitro y mezclar suavemente por inversión sin vórtice. Ahora se utilizan pinzas estériles para colocar una membrana hidrofílica policarbonatosa estéril de 0,1 micrómetros plana en el fondo de cada pozo, en una placa estéril de 24 pozos con tapa. Añade un mililitro de medio EMJH estéril a cada pozo y deja remojar la membrana durante dos horas a 30 grados Celsius.

A continuación, retira la solución de remojo de cada pozo sin desplazar la membrana y añade 1,5 mililitros de suspensión bacteriana diluida, asegurando que la membrana permanezca firmemente en su lugar en el fondo. Luego, coloca una bandeja llena de agua dentro de la incubadora para mantener la humedad. Incubar la placa a 30 grados Celsius en condiciones estáticas para permitir la formación de biofilm.

Dejando la placa hasta tres semanas para cepas de crecimiento lento. En el momento deseado, aspira cuidadosamente la mayor cantidad posible de medio de cultivo sin alterar el biofilm. Enjuaga cada pozo suavemente con un mililitro de PBS estéril manteniendo la membrana plana contra el fondo.

Añade un mililitro de aldehído de paraforma al 4% en PBS a cada pozo e incuba a 37 grados Celsius durante 30 minutos para fijar las muestras de biopelícula. Después de la incubación, retira el fijador y enjuaga suavemente dos veces con un mililitro de PBS. Añade un mililitro de solución de violeta cristalina al 0,1% de peso por volumen a cada pozo e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos, asegurándose de que la cubierta esté completamente sumergida.

Luego descarta el tinte violeta cristalino de cada pozo y enjuaga dos veces con un mililitro de PBS. Inclina el plato y vacía todo el líquido que quede. Deja la placa a temperatura ambiente para que seque al aire hasta que el sustrato parezca completamente seco, preferiblemente durante la noche.

A continuación, añade 500 microlitros de tampón eluciano compuesto por un 50% de etanol y un 50% de ácido acético glacial en volumen a cada pozo. Pipetea arriba y abajo para disolver completamente la mancha unida a la biopelícula. Ahora, transfiere 200 microlitros de cada muestra a una microplaca ópticamente clara de 96 pozos.

Mide la absorbancia a 570 nanómetros y resta valores de fondo de los controles no inoculados procesados en todos los pasos. Registrar la media y la desviación estándar para al menos tres réplicas técnicas. Obtén las biopelículas en placas de pozo como se ha demostrado antes.

Añade una solución de aldehído paraforma al 4% y glutaraldehído al 1% en un tampón de sodio molar de 0,2 molares a pH 7,4 en los pozos. Incuba las muestras fijas durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Retira el fijador y enjuaga la muestra dos veces con PBS para preservar la biopelícula unida a la superficie minimizando el desprendimiento.

Ahora sumerge la capa de cubierta en tetróxido de osmio al 1% diluido en PBS e incuba durante una hora para mejorar el contraste de la microscopía electrónica de barrido. Luego enjuaga el sustrato dos veces con PBS. Deshidrata las muestras sumergiéndolas secuencialmente durante 10 minutos cada una en series de etanol graduado.

A continuación, añade 500 microlitros de hexametildisilazano e incuba durante cinco minutos. Luego sustituyal por hexametildisilazano fresco y incuba durante cinco minutos más. Después, retira el exceso de solución y deja que la muestra se seque completamente al aire bajo una campana extractora.

Ahora monta las muestras secas sobre muñones de microscopía electrónica de barrido usando cinta de carbono conductora de doble cara. Recubre las muestras con una capa fina, aproximadamente 10 nanómetros de oro o platino, para mejorar el contraste electrónico en la imagen. Finalmente, carga los muñones preparados en el microscopio electrónico de barrido utilizando el soporte de muestra adecuado.

Evacua la cámara durante la noche si es posible para mejorar la calidad de las imágenes. Luego adquiere imágenes secundarias de electrones a cinco a quince kilovoltios utilizando aumentos adecuados para visualizar la ultra estructura de la biopelícula. Tras 21 días de incubación, la tinción de violeta cristalino reveló patrones visibles de biofilm tanto en filtros de policarbonato como en las cubiertas de vidrio para Leptospira interrogans y Leptospira biflexa.

Cada especie presenta huellas arquitectónicas distintivas como formas en forma de puntos, ramificadas o reticuladas. Las mediciones de absorbancia a 570 nanómetros confirmaron una mayor retención de violeta cristalino en biofilms de Leptospira byflexa en comparación con los interrogadores de Leptospira en todos los puntos temporales, lo que indica una mayor acumulación de biomasa en la cepa. La microscopía electrónica de barrido de biofilms de leptospira interrogans capturó depósitos tempranos de matriz extracelular en biopelículas de tres días de antigüedad, una cara basal madura y canalizada con estructura tridimensional a los 14 días y consolidación matricial completamente desarrollada con arquitectura densa a los 21 días.

Nuestro protocolo optimizado sincroniza lecturas complementarias de culturas idénticas, aumentando la robustez, reduciendo la variabilidad y revelando información dinámica y estructural, disponible con enfoques de método único. Al integrar análisis complementarios, nuestros hallazgos estandarizaron la evaluación de biofilmes, aclararon la dinámica y la arquitectura de las leptospiras. Vinculan la estructura con la virulencia y refuerzan la investigación comparativa reproducible.

Futuros mutantes para vincular la regulación con la morfología y dinámica de la biopelícula, aclarar la persistencia ambiental y evaluar estrategias que alteren la información de la biopelícula o promuevan la dispersión.