Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

Nuestro laboratorio estudia las vías de reparación del ADN dependientes de PARP1 y PARP2 y las vías de respuesta al daño del ADN en células normales y transformadas. Un desafío en el campo es el análisis cuantitativo de la activación de PARP1 y PARP2 en células evitando la lisis celular. Esto permite estudios de localización subcelular.

Para empezar, añade 375 microlitros de suero fetal bovino y DMEM libre de penicilina y estreptomicina a un tubo de microcentrifugación estéril de 1,5 mililitros. Luego, añade 10 microlitros de un reactivo transfeccionante a base de lípidos y todos los plásmidos necesarios al tubo. Golpea suavemente el tubo de microcentrifugación para mezclar el medio, el reactivo de transfección y el ADN plasmídico.

Incubar a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos para permitir la formación de complejos de ADN y reactivos de transfección. A continuación, añade el plásmido y la mezcla de reactivos de transfección gota a gota al plato de 60 milímetros que contiene las células cultivadas de 293FT sin retirar el medio y devuelve las células a la incubadora durante 48 horas. Luego, recoge el medio de cultivo de las células transfectadas de 293FT.

Para aislar las partículas de lentivirus, filtrar el medio recogido mediante un filtro estéril de 0,45 micrómetros para separar los restos celulares de las partículas lentivirales. Para la transducción, cultivar las células deseadas durante 24 horas y verificar que la confluencia celular esté entre el 20% y el 40%. A continuación, añade un mililitro de virus, un mililitro de medio de crecimiento y dos microlitros de Polybrene a un tubo cónico de 15 mililitros, mezclados suavemente por inversión. Ahora, retira el medio de crecimiento de la placa de seis pozos.

Añade la mezcla de virus, medio y Polybrene a cada pozo. Colocar las células con la mezcla de transducción en una incubadora que contenga una atmósfera humidificada a 32 grados Celsius y un 5% de dióxido de carbono durante 16 a 18 horas. Para validar la expresión de los aminoácidos RNF146, de 100 a 182 EGFP, semilla 200.000 células que expresan LivePAR por plato de cultivo que contiene llabos de cobertura.

Deja que las células se adhieran entre 24 y 36 horas a las cubiertas, condiciona el medio y comienza a replicar. Después, expone las células que expresan LivePAR a los reactivos dados. Añade los compuestos directamente al medio que contiene las células en los deslizamientos de la cubierta y haz girar suavemente el medio en los platos de cultivo celular para distribuir los compuestos.

Incuba los platos de 60 milímetros a 37 grados Celsius durante 60 a 90 minutos. Para fijar las células, retira el medio y lava las células con PBS. Prefija las células con un 4% de formaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de retirar el formaldehído, lava las células tres veces con PBS. Luego, añade tres mililitros de metanol frío y acetona a las células en una proporción de 7:3 para fijarlas. Coloca los platos a menos 20 grados Celsius durante nueve minutos.

Luego, retira la solución de metanol y acetona. Después de lavar las células tres veces con PBS, pipetea 15 microlitros de medio antifundido que contenga DAPI sobre una lámina de vidrio. Monta suavemente la cubierta sobre el medio de montaje con las celdas mirando hacia dentro, minimizando las burbujas.

Centra y asegura la tapa, acobla el desliz en la corredera de cristal y sella los laterales aplicando una pequeña cantidad de esmalte transparente para clavos en los bordes. Coloca las láminas en la oscuridad para que el esmalte de las uñas se seque. Después de descargar e instalar Image J, abre Image J e instala el archivo de texto macro LivePAR_Macro haciendo clic en Plugins, seleccionando Macros y seleccionando Instalar.

Abre todos los archivos confocales en la Imagen J y guarda los archivos como archivos TIFF para preservar los originales. Luego, abre un documento de hoja de cálculo y guárdalo como Date_CellLineFociAnalysis. Analiza un archivo TIFF a la vez.

Pulsa 1 para encontrar los núcleos. Cuando se abra la ventana del gestor de ROI, selecciona todas las entradas y pulsa añadir para superponer el área del núcleo sobre la imagen original. Eliminar núcleos identificados incorrectamente y excluir los núcleos que no estén completamente dentro del marco.

Luego, dibuja el núcleo usando la herramienta de Selección a Mano Libre y pulsa 2 para cuantificar los focos PAR. Selecciona cada núcleo en el gestor de ROI y cuenta el número de focos por núcleo. Copia y pega los datos cuantificados en el documento abierto de la hoja de cálculo después de puntuar todos los núcleos del archivo.

De forma similar, repite el análisis para todos los archivos TIFF. Cuando termines, traza focos PAR por núcleo en el software que elijas. Las células de control del vehículo mostraron tinción pancelular de EGFP.

Las células tratadas con genotoxina mostraron acumulación de focos nucleares que representan la localización dentro del núcleo. El pretratamiento con el inhibidor de PARP1 e inhibidor de PARP2 veliparib resultó en la pérdida de los focos de PAR. La cuantificación del número de focos de PAR por núcleo en función del tiempo y las condiciones de tratamiento mostró resultados similares.

Este protocolo nos permite cuantificar la activación de los ejes de señalización de PARP1 y PARP2 en respuesta a genotoxinas y tras alteraciones genéticas. Hemos empleado técnicas tradicionales de inmunofluorescencia con este ensayo para validar la colocalización de proteínas con poliADP-ribosa. De cara al futuro, utilizaremos este ensayo para pruebas de genotoxicidad para análisis de alto rendimiento de PARP1, PARP2 o inhibidores de PARP, y para identificar factores novedosos implicados en la señalización de PARP1 y PARP2.