Name: Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la activación de PARP1/PARP2 en células mamíferas mediante un reportero de fusión PBD-EGFP. Este método permite analizar la acumulación de PAR en tiempo real sin lisis celular.

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<table><tbody><tr><td>Reactivos, productos químicos y péptidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros steriflip Durapore de 0,45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de 20 x 20 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Platos para cultivo celular, 100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Platos para cultivo celular, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>Platos para cultivo celular de 6 pocillos</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Cryoviales de 2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>Dietil éter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtros estériles desechables, 0,45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 pruebas</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>Diapositivas de microscopio de vidrio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal inactivado por calor</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas Kim grandes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Kit Lenti-X GoStix Plus</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo) tetrahidrofurano-2-il]-4H-piridin-3-carboxamida)</td><td>Marie Migaud o NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de PARG (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de PARPi (Veliparib, ABT-888)</td><td>MedChemExpress</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (reactivo de transfección)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) medio de montaje antidesvanecimiento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>Líneas celulares&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(derivado de células de riñón embrionario humano transformadas con el antígeno T grande SV40)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428&nbsp;</td><td>Regalo generoso de</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(Línea celular de tumor de glioblastoma humano)</td><td>Dr. Ian Pollack (Universidad de Pittsburgh)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(células epiteliales pigmentarias de retina humana inmortalizadas hTERT)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(Línea celular de osteosarcoma humano)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>ADN recombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Existencias de laboratorio# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Existencias de laboratorio# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Existencias de laboratorio# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR es el dominio WWE de RNF146, residuos de aminoácido 100-182, fusionado con EGFP; contiene un casete de resistencia a higromicina)</td><td>Existencias de laboratorio# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software y algoritmos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (para la preparación de figuras)</td><td>Adobe Systems</td><td>Versión 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Versión 10.5.0&nbsp;(Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización y análisis cuantitativo de la activación de parp1/parp2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

visualization-quantitative-analysis-genotoxin-induced-parp1parp2

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un método para supervisar la actividad de ubiquitina-proteasoma en células vivas se describe. Un degron-GFP desestabilizado-(GFP-dgn) y una estable GFP-dgnFS proteína de fusión se generan y se transduce en la célula usando un vector de expresión lentiviral. Esta técnica permite generar un GFP-dgn/GFP-dgnFS estable línea celular que expresa en la que se puede ubiquitina-proteasoma actividad fácilmente evaluada utilizando epifluorescencia o citometría de flujo.

Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

La actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 en células de cáncer sometidos a la mitosis se documentó en tiempo real por imagen confocal en vivo. 34 PJ-erradicar el cáncer de mama humano MDA-MB-231 células que albergan actividades extra-centrosomas en la mitosis. A diferencia de la mitosis bi-focal normal, las actividades extra-centrosomas no se agruparon en los dos polos del huso en la presencia de PJ-34.

La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

Este artículo describe los protocolos para evaluar el efecto de proteínas fluorescentes en la agregación y toxicidad del polyglutamine mal plegadas ampliación para la evaluación rápida de una proteína fluorescente recién desacostumbrada en el contexto de reporteros fluorescentes.

Efecto de proteínas fluorescentes de fusión socios en ensayos de toxicidad de poliglutaminas de levadura

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

En este estudio, presentamos un ensayo celular in vitro para identificar sustancias químicas teratogénicas. La dinámica de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) / factor de respuesta sérica (SRF) se midió en células reporteras pluripotentes inducidas (iPS) humanas, y el riesgo de teratogenicidad se evaluó cuantificando la interrupción química de esta vía de señalización.<br...

Ensayo de toxicidad para el desarrollo basado en el monitoreo en tiempo real de la interrupción de la señal del factor de crecimiento de fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aprende a visualizar y cuantificar la activación de PARP1/PARP2 en células mamíferas mediante un reportero de fusión PBD-EGFP. Este método permite analizar la acumulación de PAR en tiempo real sin lisis celular.

Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes (Video) | JoVE Journal

Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

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