En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Las células madre tienen el notable potencial de convertirse en muchos tipos diferentes de células en el cuerpo. Sirviendo como una especie de sistema de reparación para el cuerpo. En teoría, pueden dividirse sin límite para reponer otras células.

Cuando una célula madre se divide, cada nueva célula tiene el potencial de seguir siendo una célula madre o convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada. Esta prometedora área de la ciencia está llevando a los científicos a investigar la posibilidad de terapias basadas en células para tratar enfermedades in vitro. La diferenciación de las células madre embrionarias ocurre cuando se permite que las células se agreguen en un cultivo en suspensión.

En ausencia de embriones de ratón, alimentadores de fibroblastos y factor inhibidor de la leucemia, estos agregados celulares se denominan cuerpos embrionarios. El método de la gota colgante es un procedimiento eficaz para la diferenciación de células madre en cuerpos embrionarios in vitro. Hola, soy Sha Juan de la división de Medicina Cardiovascular de la Universidad de Stanford.

Hoy te mostraremos un procedimiento para la diferenciación individual de células madre embrionarias para empenetrar en el cuerpo utilizando el método de caída manual. Por lo general, utilizamos este método para diferenciar células madre embrionarias en cardiomiocitos. Este procedimiento, que incluye los siguientes pasos, la preparación de una suspensión de células madre embrionarias, la generación de cultivos de gotas manuales, la transferencia de cultivos de gotas manuales a placas de fijación ultra bajas y la placa de cuerpos embróillos en placas recubiertas de salientes.

Bien, comencemos. El primer paso del procedimiento es preparar una suspensión de células madre embrionarias de una sola célula. Debido a que cultivamos nuestras células madre embrionarias indiferenciadas cultivándolas en fibroblastos embrionarios de ratón, debemos separar las células y separarlas de los fibroblastos.

Para ello, intentamos anificar las células utilizando procedimientos estándar. Una vez finalizado el ensayo y el tratamiento, agregue medio de células madre embrionarias de ratón para neutralizar la tripsina. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 milésimas de pulgada.

A continuación, rompe las colonias celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra el fondo del tubo hasta obtener una suspensión fina de células sin grumos visibles. Ahora gira las células a mil RPM durante cinco minutos. Después de girar las células, aspire el supernat y vuelva a suspender las células con 10 milésimas de pulgada de célula madre embrionaria de ratón. Medio.

Transfiera la suspensión celular a un matraz T 75 precodificado con 0,1% de gelatina e incube a 37 grados con 5% de CO2 durante una hora. Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Pipetea el medio para recoger las células madre.

Haga girar las celdas a mil RPM durante cinco minutos y aspire el medio. A continuación, añada otras 10 milésimas de pulgada de medio de diferenciación y vuelva a suspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parezca haber una suspensión fina de las células. Cuente las células con un hemocitómetro.

Ahora estamos listos para cultivar la suspensión celular utilizando el método de gota colgante. Para comenzar el cultivo de gotas colgantes, use la mediana de diferenciación para diluir la suspensión de células madre a una concentración de 500 células por 20 microlitros. A continuación, invierta una cubierta de placa de cultivo de tejidos de 150 milímetros.

A continuación, pipetee 20 microlitros de la suspensión celular en la superficie interior de la cubierta de la placa. Con una pipeta multicanal, agregue 10 milésimas de pulgada de PBS en la placa. Invierta rápidamente la cubierta de la placa y colóquela suavemente sobre la placa para formar las gotas colgantes.

Una vez que la cubierta de la placa esté en su lugar, transfiera con cuidado la placa al cultivo de la incubadora. Las células permanecieron inalteradas durante dos días. Una vez finalizada la incubación, procederemos a transferir el cultivo de gotas colgantes a placas de fijación ultra bajas.

Después de dos días, voltee con cuidado la tapa de la placa a continuación, aspire 180 microlitros de medio de diferenciación fresco y coloque varias gotas en una placa de fijación ultra baja de 96 pocillos. A continuación, recoja las gotas con una pipeta y transfiéralas una a una a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en la incubadora sin tocar durante tres días.

Los cuerpos de los embriones continuarán creciendo en forma de bola. Cuando se complete la incubación, estaremos listos para colocar los cuerpos de los embriones. Con el fin de ayudar a los cuerpos embrionarios a seguir diferenciándose.

Los transferimos a un plato recubierto de gelatina de 48 pocillos. Para ello, primero rebozamos cada pocillo del plato con 300 microlitros de gelatina al 0,1%. Después de agregar la gelatina, incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, aspire la gelatina de la placa de 48 pocillos. A continuación, añada 300 microlitros de medio de diferenciación a cada uno. Bueno, ahora, uno por uno, transfiera los cuerpos de los embriones de las placas recubiertas de gelatina de 96 pocillos a las de 48 pocillos.

Por lo general, cambiamos el medio al día siguiente y luego cada dos días para mantener las células. Utilizamos este método para buscar mejores protocolos de diferenciación de células madre embrionarias. En los cardiomiocitos, acabamos de mostrar cómo realizar la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón utilizando cultivos de gotas colgantes.

Este método es eficaz porque la parte inferior redonda de la gota colgante permite la agregación de células madre embrionarias, proporcionando así un buen entorno para la formación de cuerpos de Embry. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el número de células madre embrionarias agregadas en una gota colgante se puede controlar variando el número de células en la suspensión celular inicial. Eso es todo.

Gracias por mirar. Buena suerte con tu experimento.