Name: En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón mediante el método de gota colgante. Esta técnica permite formar cuerpos embrioides para estudios de biología celular y medicina regenerativa.

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<ol><li> Gelatinizar T75 frasco con una solución de gelatina al 0,1% y la placa se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos durante la noche un día antes. </li><li> Saque las células MES de incubar, se aspira el medio, enjuague el cultivo de células ES con PBS, se añaden 0,05% de solución de tripsina para cubrir el fondo del plato (2 placas ml/100mm). </li><li> Se incuba a 37 ° C durante aproximadamente un minuto, hasta que las células son desprendimiento de la placa. </li><li> Suavemente triturar (pipeta de arriba y abajo) de las células trypsinized cuatro a seis veces para dispersar las células madre embrionarias con una pipeta Pasteur conectada,. Transferencia de las células madre embrionarias se dispersaron en un tubo de centrífuga de 15 ml cónicos que contengan precalentado (37 ° C) medio MES. </li><li> Recoger las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante, agregar 10 ml de medio de MES y la pipeta hacia arriba y abajo para formar una suspensión de células individuales. </li><li> La transferencia de la suspensión celular en un matraz T75 pre-recubiertas con gelatina al 0,1% y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante una hora * Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Pipeta hasta el medio para recolectar las células madre. </li><li> Vuelta a las células a 1000 rpm durante 5 min y se aspira el medio de MES. A continuación, añadir otra de 10 ml de medio de diferenciación MES y volver a suspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parece que hay una suspensión fina de las células. </li><li> Recuento de células con un medio de diferenciación hemocitómetro utilizar para diluir la suspensión de células madre a una concentración de 400 a 500 células por 20 ul (20ul/drop) en un recipiente estéril. </li><li> Levante la tapa, con cuidado invertir y colocar en la parte superior de la cápsula que contiene 10 ml de PBS. Con una pipeta multicanal, hacer filas de las gotas de 20 ul en la superficie interna hasta convertido de la tapa de la placa de cultivo de tejidos. </li><li> Coloque cuidadosamente el plato en la incubadora por 2 días. Después de dos días, con cuidado a su vez sobre la cubierta de la placa, aspirar el medio 180 ul diferenciación fresca y poner unas gotas en el pocillo de una placa de 96 pozos ultra adjunto. Luego de recogida la caída de las gotas de pipeta y la transferencia, una por una, a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en el reposo durante tres días incubadora. </li><li> Cubrir cada pocillo de una placa de tejido de 48 pocillos con 300ul de 0,1% de gelatina. Después de añadir la gelatina, se incuba la placa durante la noche a 37 ° C, un día antes antes de la transferencia de la EBS. </li><li> Al día siguiente, se aspira que la gelatina de la placa de 48 pocillos. A continuación, añadir 300 ul de medio de diferenciación a cada pocillo. Transferir el EBs de la 96 y placas a los 48 y recubiertos de gelatina placas de uno por uno. Cambiar el medio al día siguiente y luego cambiar el medio de cada dos días para mantener las células. </li><li> Contracciones espontáneas cardiaomyocyte debe ser evidente en los últimos 7 días. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

Las desventajas del método de gota son los siguientes: el volumen de líquido de una caída se limita a menos de 50 ul por el mantenimiento de las gotas colgando de la tapa por la tensión superficial, y es imposible cambiar el medio para colgar gotas. La observación de la formación de EBS en gotas directamente con el microscopio es también muy difícil durante el cultivo. Más aún, el método de la gota colgante consta de dos pasos, por lo tanto, una serie de pasos del método de gota puede ser un problema.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Reactivo</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos aminos no esenciales</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reactivo</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>factor inhibidor de la leucemia (LIF)</td><td>Reactivo</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos con adherencia ultrabaja</td><td>Herramienta</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

en la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (mes), las células con el método de gota

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Las células madre tienen el potencial extraordinario para convertirse en muchos tipos celulares diferentes. Cuando una célula madre se divide, cada nueva célula tiene la capacidad de seguir siendo una célula madre o convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada, Esta prometedora de la ciencia está llevando a los científicos a investigar la posibilidad de terapias basadas en células para tratar la enfermedad. Cuando la cultura en suspensión sin factores de antidiferenciación, las células madre embrionarias se diferencian y espontánea forma tridimensional agregados multicelulares. Estos agregados de células se llaman cuerpos embrioides (EB). Colgando cultura gota es una formación muy utilizado EB método de inducción. La parte inferior redondeada de gota colgante permite la agregación de células madre embrionarias que pueden proporcionar las células MES un buen ambiente para la formación de EBS. El número de células madre embrionarias aggregatied en una gota se puede controlar variando el número de células en la suspensión inicial de la célula para ser colgado como una gota de la tapa de la placa de Petri. El uso de este método que puede reproducible forma homogénea EBs de un número determinado de células madre embrionarias.

Este vídeo demuestra cómo llevar a cabo en la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón a cuerpos embrioides utilizando el método de gota.

En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Las células madre poseen el potencial extraordinario de desarrollarse en muchos tipos celulares diferentes. Cuando una célula madre se divide, cada célula nueva tiene el potencial de...

Las células madre tienen la notable capacidad de desarrollarse en muchos tipos diferentes de células en el cuerpo. Actúan como un sistema de reparación para el organismo. Teóricamente, pueden dividirse sin límite para renovar otras células.Cuando una célula madre se divide, cada célula nueva tiene la posibilidad de permanecer como célula madre o convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada. Esta prometedora área de la ciencia está llevando a los científicos a investigar la posibilidad de terapias basadas en células para tratar enfermedades in vitro. La diferenciación de células madre embrionarias ocurre cuando se permite que las células se agreguen en cultivo de suspensión.En ausencia de fibroblastos embrionarios de ratón, células alimentadoras y factor inhibidor de la leucemia, estos agregados celulares se denominan cuerpos embrionarios. El método de la gota colgante es un procedimiento eficaz para la diferenciación de células madre en cuerpos embrionarios in vitro. Hola, soy Sha Juan, del laboratorio de la división de Medicina Cardiovascular de la Universidad de Stanford.Hoy les mostraremos un procedimiento para la diferenciación individual de células madre embrionarias en cuerpos embriónicos utilizando el método de gotas manuales. Normalmente utilizamos este método para diferenciar células madre embrionarias en cardiomiocitos. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: preparar una suspensión de células individuales de células madre embrionarias, generar cultivos de gotas manuales, transferir los cultivos de gotas manuales a placas de adherencia ultrabaja y sembrar los cuerpos embriónicos en placas recubiertas con gelatina.Vale, comencemos. El primer paso del procedimiento consiste en preparar una suspensión simple de células de células madre embrionarias. Dado que cultivamos nuestras células madre embrionarias indiferenciadas haciendo que crezcan sobre fibroblastos embrionarios de ratón, debemos separar las células y aislarlas de los fibroblastos.Para hacer esto, se realiza la tripsinización de las células utilizando procedimientos estándar. Una vez completado el tratamiento con tripsina, agregue medio de células madre embrionarias de ratón para neutralizar la tripsina. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.Luego, desintegre las colonias celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra el fondo del tubo hasta obtener una suspensión fina de células sin grumos visibles. Ahora, centrifugue las células a mil RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células con 10 mils de medio para células ES de ratón.Transfiera la suspensión celular a un matraz T 75 previamente recubierto con gelatina al 0,1 % e incube a 37 grados con 5 %CO₂ durante una hora. Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Aspire el medio para recolectar las células madre.Centrifugar las células a mil RPM durante cinco minutos y aspirar el medio. A continuación, agregar otros 10 ml de medio de diferenciación y resuspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parezca haber una suspensión fina de células. Contar las células utilizando un hemocitómetro.Ahora estamos listos para cultivar la suspensión celular utilizando el método de gota colgante. Para iniciar el cultivo por gota colgante, use medio de diferenciación para diluir la suspensión de células madre hasta una concentración de 500 células por 20 microlitros. A continuación, invierta la tapa de una placa de cultivo de tejidos de 150 milímetros.Luego, pipetee 20 microlitros de la suspensión celular sobre la superficie interna de la tapa de la placa. Utilizando una pipeta multicanal, agregue 10 ml de PBS a la placa. Invierta rápidamente la tapa de la placa y colóquela suavemente sobre la placa para formar las gotas colgantes.Una vez que la tapa de la placa esté colocada, transfiera cuidadosamente la placa al cultivo en incubadora. Las células permanecen sin disturbios durante dos días. Una vez finalizada la incubación, procederemos a transferir el cultivo en gota colgante a placas de adherencia ultra baja.Después de dos días, gire cuidadosamente la tapa de la placa y luego aspire 180 microlitros de medio de diferenciación fresco, y coloque varias gotas en una placa de 96 pocillos de adherencia ultrabaja. A continuación, recoja las gotas con una pipeta y transfiéralas una por una a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en el incubador sin moverlas durante tres días.Los cuerpos embrionarios continuarán creciendo con forma esférica. Cuando la incubación esté completa, estaremos listos para sembrar los cuerpos embrionarios. Con el fin de ayudar a los cuerpos embrionarios a continuar diferenciándose.Los transferimos a una placa de 48 pocillos recubiertos con gelatina. Para ello, primero recubrimos cada pocillo de la placa con 300 microlitros de gelatina al 0,1 %. Después de agregar la gelatina, incubar la placa durante la noche a 37 grados Celsius.Al día siguiente, aspire la gelatina de la placa de 48 pocillos. Luego añada 300 microlitros de medio de diferenciación a cada uno. Ahora, transfiera uno por uno los cuerpos embrionarios de la placa de 96 pocillos a las placas de 48 pocillos recubiertas con gelatina.Normalmente cambiamos el medio al día siguiente y luego cada dos días para mantener las células. Utilizamos este método para buscar mejores protocolos para la diferenciación de células madre embrionarias. En los cardiomiocitos, acabamos de mostrar cómo realizar la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón mediante cultivos en gotas colgantes.Este método es eficaz porque el fondo redondeado de la gota colgante permite la agregación de células madre embrionarias, creando así un buen entorno para la formación de cuerpos embrionarios. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la cantidad de células madre embrionarias que se agrupan en una gota colgante puede controlarse modificando el número de células en la suspensión celular inicial. Eso es todo.Gracias por vernos. Buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Nos muestran un método sencillo y rápido para cargar previamente definidos el número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides.

Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

Se describe el uso de un ensayo basado en células ES de ratón para identificar ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. El método ofrece una plataforma estandarizada que cuantifica la eficiencia de forma fiable cardiogénico, y es aplicable al estudio de los linajes de células.

Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

El video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) a cuerpos embrioides (EBs) por el método de gota colgante. Al suspender las mESC en gotas colgantes e incubarlas, las células se agregan para formar EB, que se diferencian aún más en células progenitoras neuronales (NPC) utilizando un medio de diferenciación suplementado con ácido retinoico (AR).

Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias de ratón mediante el método de la gota colgante

Este video muestra un método para la generación in vitro de células progenitoras neurales (NPCs) a partir de células madre embrionarias de ratón (mESCs). Las mESCs se cultivan en suspensión para formar cuerpos embrioides (EBs), que luego son guiados para diferenciarse en NPCs mediante tratamiento con ácido retinoico en un cultivo adherente.

Una técnica para generar células progenitoras neurales a partir de células madre embrionarias de ratón

Este protocolo describe en detalle el método para generar progenitores neurales a partir de células madre embrionarias utilizando un método de monocapa sin suero. Estos progenitores se pueden utilizar para derivar tipos de células neuronales maduras o para estudiar el proceso de especificación neuronal y son susceptibles de escalado en formato multipocillo para el cribado de compuestos.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

Este protocolo describe un método para generar progenitores interneurona cortical y poste-mitotic interneurona precursores de células madre embrionarias del ratón usando un método modificado de cuerpo para monocapa embryoid. Estos progenitores/precursores puede ser usado en vitro fluorescencia ordenados y trasplantado en neocortex neonatal para el estudio de determinación de destino o utilizado en aplicaciones terapéuticas.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

Aprende la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón mediante el método de gota colgante. Esta técnica permite formar cuerpos embrioides para estudios de biología celular y medicina regenerativa.

En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

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