Summary
يوصف نظام ثقافة 3D لتكون الدم باستخدام دم الحبل السري البشري وابيضاض الدم خلايا نخاع العظام. وتستند هذه الطريقة على استخدام مادة البولي يوريثين سقالة الاصطناعية التي يسهل اختراقها المغلفة مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية. هذا سقالة قابل للتكيف لاستيعاب مجموعة واسعة من الخلايا.
Abstract
الخلايا الجذعية المكونة للدم تتطلب المكروية فريدة من نوعها من أجل الحفاظ على دم تشكيل خلية 1؛ نخاع العظم (BM) هي عملية معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) تكون الدم فيها الأنسجة وينظم من قبل microenvironments الخلوية نظمت مكانيا يطلق عليه منافذ 2-4. تنظيم منافذ BM أمر بالغ الأهمية بالنسبة لوظيفة أو اختلال وظيفي من BM طبيعي أو خبيثة 5. ولذلك فإن فهم أفضل للالمكروية في الجسم الحي باستخدام محاكاة المجراة سابقا يساعدنا على توضيح المحددات الجزيئية والخلوية وmicroenvironmental من leukemogenesis 6.
حاليا، يتم استزراع الخلايا المكونة للدم في المختبر في ثنائي الأبعاد (2D) قوارير زراعة الأنسجة / 7 لوحات جيدة تتطلب إما التعاون مع ثقافة خيفي أو الخلايا اللحمية xenogenic أو إضافة السيتوكينات الخارجية 8. هذه الشروط هي مصطنعة وتختلف في الجسم الحي 9،10 تعدد القدرات.
هنا، نقدم رواية نخاع العظام 3D منظومة الثقافة التي تحاكي البيئة في الجسم الحي، وتدعم نمو 3D multilineage تكون الدم في غياب عوامل النمو الخارجية. السقالة المسامية العالية المستخدمة في هذا النظام مصنوعة من البولي (بو)، ويسهل عالية الكثافة نمو الخلايا عبر مساحة محددة أعلى من ثقافة أحادي الطبقة التقليدية في 2D 11. وأوضحت أن عملنا هذا النموذج دعم نمو دم الحبل السري البشري (CB) خلايا وحيدات النوى (متعددة الجنسيات) 12 وخلايا اللوكيميا الأولية في غياب السيتوكينات الخارجية. هذا التقليد الأعمى 3D رواية توفر منصة قابلة للتطبيق لتطوير نموذج تجريبي لدراسة الإنسان تكون الدم واكتشاف علاجات جديدة لسرطان الدم.
Protocol
1. سقالة تصنيع وبيو functionalization، من السقالات
- الى افتعال PU السقالات (حجم المسام 100-250 ملم، المسامية 90-95٪) في شكل أقراص طبق بيتري، استخدم فصل المرحلة التي يسببها حراريا 13 عملية من خلال إعداد حل البوليمر (5wt٪ في Dioxan)، يليه تجميد واللاحقة مذيب التسامي (الشكل 1A).
- قطع القرص سقالة إلى مكعبات من 0.5 × 0.5 مم 0.5 × قبل طلاء مع بروتينات ECM (الشكل 1B).
- مخزنة مسبقا الرطب والسقالات التي غمر بها في الإيثانول (70٪) لمدة 1 دقيقة، ثم نقل إلى فوسفات المالحة (PBS) لمدة 20 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي ثم لمدة 10 دقيقة في 3630 XG وإضافة محلول البروتين.
- أجهزة الطرد المركزي والسقالات في حل بروتين في 1420 XG لمدة 20 دقيقة.
- من أجل كسر الجمود في المسام السطح، وتسمح للخلايا المصنف على اختراق أعمق في سقالة، أجهزة الطرد المركزي والسقالات مرة أخرى بمبلغ 910 XG لمدة 10 دقيقةفي برنامج تلفزيوني.
- تعقيم السقالات باستخدام مزيج من التعرض دقيقة و 8 في 230 فولت 50 هرتز،، 0.14 ألف مصباح، الأشعة فوق البنفسجية، مع غمر لمدة 2 ساعة في الإيثانول (70٪). بعد ذلك، وغسل السقالات مرتين في برنامج تلفزيوني قبل ان يضيف لIscove معدلة Dulbecco متوسطة (IMDM) تستكمل مع 30٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين والستربتوميسين (P / S). وضع السقالات في حاضنة مرطب لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل استخدامها. يتم وضع السقالات العقيمة في لوحات 24 ثقافة جيدا الأنسجة (واحد لكل سقالة أيضا).
2. وحيدات النوى عزل الخلايا والبذر سقالة
- استخراج الإنسان الشركات متعددة الجنسيات من دم الحبل السري أو ابيضاض الدم عينات نخاع العظام، وذلك باستخدام Ficoll-Paque الطرد المركزي المتدرج الكثافة (35 دقيقة عند 1500 دورة في الدقيقة) (الشكل 1C).
- Resuspend الشركات متعددة الجنسيات في IMDM تحتوي على 30 FBS٪ و 1٪ P / S.
- 100μl البذور من الشركات متعددة الجنسيات تعليق (2 × 10 6 خلية / سقالة) على السقالات باستخدام ماصة الصغيرة.
- احتضان والسقالات المصنفة على 37 درجة مئوية تحت CO 2 5٪ لمدة 10 دقائق للحصول على الخلايا ليستقر في السقالات.
- ملأ كل جيدا مع 1.5 مل من IMDM التي تحتوي على 30٪ FBS وألواح جيد 1٪ P / S وضعها في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 طوال مدة التجربة.
- والسقالات المصنفة تخضع يوميا تتغير من جميع وسائل الإعلام.
3 في انتشار الخلايا الطبيعي وعلم الصرف: MTS، ووزارة شؤون المرأة وCytospins
- MTS مقايسة: إزالة ثقافة من أمم متحدة واحدة في البطولة واثنين من السقالات المصنفة والمكان في 24 جديدة نظيفة جيدا لوحة. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام و 200 ميكرولتر من حل MTS والحضانة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- أخذ 8 × 100 عينة ميكرولتر من طاف؛ مكان في لوحة 96-جيدا والامتصاصية التدبير ب 490 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
- المجهر الإلكتروني (SEM): في نقطة زمنية مختلفة من الالثقافة الإلكترونية، وإزالة السقالات المصنف مع الشركات متعددة الجنسيات من وسائل الإعلام، وإصلاح مع 2.5٪ في برنامج تلفزيوني، مخزنة حل غلوتارالدهيد لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية، ثم تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- المجففة والسقالات في سلسلة متدرجة من الايثانول (25، 50، 70، 80، 90، 95، و 100٪)، ولكل لمدة 10 دقيقة وجافة في بيئة معقمة لمدة 4 ساعات.
- عينات القسم ثم تفل، معطف لهم مع الذهب في جو الأرجون لمدة 2 دقيقة قبل SEM التقييم، واستخدام الجهد تسارع من 20 كيلو فولت.
- Cytospins: جمع 2.0 × 4 10 خلية / الشريحة بواسطة الشفط الخلايا من سقالة في نقاط زمنية مختلفة في الثقافة.
- منبذة الخلايا على شريحة زجاجية لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة.
- وصمة عار على الشرائح مع رايت صبغة الجمسا التعديل ومراقبة باستخدام المجهر الضوئي. F-عرض يمكن استخدامها لينة نظام التصوير لالتقاط الصور.
- غسل الشرائح قبل مراقبة المجهر.
- M ultiphoton تحليل: السقالات فيكس في نقاط زمنية مختلفة مع بخار الإيثانول (70٪) بين عشية وضحاها ومن ثم الجافة ومخزن في -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. قبل التصور مع قسم مجهر multiphoton السقالة إلى شرائح سميكة ميكرومتر 30 و رطب مع برنامج تلفزيوني.
- منع السقالات المصنفة في برنامج تلفزيوني مع المصل 10٪ بقري جنيني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان والسقالات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام مع تخفيف 1:50 من الأجسام المضادة أحادية المنشأ الأساسي: الفأر CD71 الإنسان المضادة.
- غسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية: مكافحة فأر اليكسا فلور 488 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ونلاحظ مع المجهر متحد البؤر باستخدام X60 انبعاث المياه عدسة الهدف.
- هو متحمس Fluorophore اليكسا فلور 488 في 488 نانومتر ليزر نابض. ويمكن استخدام البرنامج لVolocity 5.3.2 تحليل الصور اللاحقة.
- قبل تحليل الخلوية في عداد الكريات تدفق (FC)، تسمية الخلايا في المصالح مع الأجسام المضادة للالمناعي المقابلة للكشف. يتم إعداد عدد من العينات وفقا للأضداد مختارة للكشف. للكشف عن الشركات متعددة الجنسيات تستخدم التركيبة التالية من الأضداد: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- نضح الخلايا من سقالة في نقاط زمنية مختلفة، والطرد المركزي. بحل بيليه خلية من حوالي 1x10 6 خلايا في 100 العازلة FC ميكروليتر (PBS أزيد الصوديوم + 0.1٪)، وإضافة 10 ميكرولتر من كل الأضداد صبغ مضان. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني، وأخيرا في نادي العازلة إعادة تعليق.
- تحميل العينة إلى تدفق عداد الكريات الملون مع سيطرة isotype لتعيين "سلبية" للتعبير عن الأجسام المضادة ومعايرة قنوات كشف مع التحكم في التدفق عداد الكريات.
- قراءة عينة ث الملون إيث الأجسام المضادة الثلاثة المختلفة، وتمثل أخيرا في البيانات باستخدام برنامج WinList.
5. ممثل النتائج
ويرد مثال للدم حركية النمو الخلوي دون إضافة عوامل النمو الخارجية في الشكل 2. وتتضح طبيعية وغير طبيعية الخلايا المكونة للدم: نظرا لطبيعة متجانسة من تكون الدم، واثنين من انواع مختلفة من الخلايا. في الشكل 2A، الانتشار الخلوي من CBMNC الإنسان هو واضح بعد 28 يوما في الثقافة. 2B ويبين الشكل حركية النمو في محاكاة باستخدام خلايا اللوكيميا الأولية. ويتم تقييم الخلوية انتشار استخدام فحص النظام التجاري المتعدد الأطراف الذي يقيس النشاط الأيضي الخلوية في ما يتعلق الامتصاصية. في كلتا الحالتين، فإن الخلايا تكاثرت، وأنشأ في هذا النموذج. ويلاحظ اختلافات في حركية النمو؛ الخلايا المكونة للدم الطبيعي في تأسيس ثقافة أسرع من خلايا اللوكيميا.
وقد تم تحليل _content "> ومورفولوجيا الخلايا تحصد حتى بعد 28 يوما من تاريخ الثقافة في ظل غياب عوامل النمو الخارجية كان نموذجيا من الخلايا المكونة للدم الطبيعي (الشكل 3A) وخلايا اللوكيميا (الشكل 3B). الفروع المركزية للالسقالات بواسطة SEM بعد تمت إزالة السقالات من ثقافة وأظهرت انتشار الخلايا المصنفة في جميع أنحاء سقالة، تأسيس أنفسهم في مجموعات وفي هياكل "المتخصصة مثل" (الشكل 3A '& B "). يبين الشكل جيم حجم المسام وتوزيعها في غير المصنف تستخدم سقالة كمجموعة تحكم. تم استخدام المجهر Multiphoton بعد 28 يوما لتسليط الضوء على توزيع الخلايا داخل سقالة 3D في الموقع وأنها أظهرت وجود جزر محمر في الفروع المركزية للسقالة (الشكل 4) من التعبير عن علامة CD71 وهو أمر ايجابي في erythroblasts، وهذا يدل على أهمية دو ناضجة والخلايا الناضجةعصابة تكون الكريات الحمر. أخيرا، الرسوم البيانية التدفق الخلوي للخلايا قبل البذر يظهر الاختلاف في النمط الظاهري للخلايا المكونة للدم، حيث 5A الرقم يمثل الخلايا المكونة للدم الطبيعي: CBMNCs الإنسان و5B الشكل يوضح الخلايا المكونة للدم غير طبيعية: خلايا اللوكيميا الأولية. مستويات CD235a + و CD45 + المقابلة لكريات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء هي على التوالي أعلى في عينة من الطبيعي في ابيضاض الدم تسليط الضوء على طبيعة الأرومات من اللوكيميا.
الشكل 1. توضيحات من العمليات التي تنطوي عليها PU سقالة تصنيع والحيوية functionalization. A) يذوب في PU Dioxan (5wt٪)، وبواسطة عملية مرحلة الانفصال التي يسببها حراريا والتسامي مذيب لاحقة يتم إنتاج سقالة، كما وصفها سافينيا وآخرون 13. B) ثم يتم قطع القرص سقالة مادبامكعبات س من 0.5 × 0.5 × 0.5 ملم ومن ثم المغلفة بواسطة الطرد المركزي مع اضافية البروتينات الخلوية (ECM) المصفوفة. ج) يتم استخراج من الشركات متعددة الجنسيات CB السري الإنسان أو من طموح BM باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة والمصنفة (2x10 6 خلية / سقالة) في السقالات PU مع micropipette.
قياس الانتشار الرقم الخلوي 2 باستخدام الفحص MTS: أ) استخدام الإنسان الحبل الشركات المتعددة الجنسيات في الدم ب) باستخدام خلايا اللوكيميا الأولية. الأعمدة تظهر نمو الخلايا مع مرور الوقت عندما بذرت في السقالات PU دون إضافة السيتوكينات الخارجية.
الشكل 3: مورفولوجيا الخلايا والتوزيع في جميع أنحاء السقالات باستخدام cytospins، scanniنانوغرام الميكروسكوب الالكتروني. (أ ب) الممثل رايت بالغيمزا cytospins الملون من وخلايا دم الحبل السري) وحيدات النوى التي تم جمعها من السقالات PU بعد 28 يوما من ثقافة، وباء) العظام والخلايا التي تم جمعها من ابيضاض الدم يستنشق السقالات PU بعد 14 يوما من ثقافة. وقد أجريت تجارب على حد سواء في حالة خلوى الحرة. (A'-B ') المقاطع المركزية ممثل الميكروسكوب PU SEM سقالة من A') المصنفة الحبل الدم، والشركات المتعددة الجنسيات 'ب) خلايا اللوكيميا بعد أن تم زرعها لمدة 28 يوما، وجيم) مع عدم وجود سيطرة سقالة الخلايا.
الشكل 4. Multiphoton صورة مجهرية من المصنف سقالة بو دم الحبل مع الشركات المتعددة الجنسيات بعد 28 د في الثقافة والملون مع علامة محمر CD71.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وبحكم ثقافة 3D فيفو نظام المقدمة هنا تمكننا من تأسيس تقليد الطبيعة 3D من تكون الدم الذي يلخص بنية الأصلي BM والنمط الظاهري الخلوية مستقل من السيتوكينات الخارجية. نموذج 3D يوفر هيكل والمكروية التي تمكن الخلايا المكونة للدم العادية وغير العادية لتتكاثر في ظروف مماثلة لتلك التي واجهتها في الجسم الحي.
يمثل اختيار المواد البوليمرية سقالة خطوة حاسمة في تصميم تقليد الطبيعة. وقد أدت مزايا هامة في المواد الحيوية إلى تزايد الاهتمام في البوليمرات التي تحاكي البيئة في الجسم الحي من خلال توفير البنية المطلوبة، والخصائص الهيكلية وbiosignals اللازمة. يجب أن البوليمرات تلبية الحد الأدنى من المتطلبات الأساسية لتطبيقها في مجال الطب البيولوجي لأنها دائما على اتصال مباشر مع الخلايا الحية، والتي تعتبر حساسة لبيئتهم المباشرة. بشكل عام، وأناوينبغي أن تكون الصفقة سقالة حيويا، التي يسهل اختراقها للغاية، مع القوة الميكانيكية بما فيه الكفاية للحفاظ على بنية محددة 3D، وارتفاع نسبة المساحة السطحية لكل حجم وتلفيق استنساخه. PU تضم جميع هذه الخصائص معا على الرغم من أن يمكن تكييفها والمسامية العالية والقوة الميكانيكية وتغيرت تبعا لدرجة الحرارة التبريد أثناء عملية النصائح. ونتيجة لذلك، يمكن تكييف هذا تقليد الطبيعة إلى أنواع أخرى من الخلايا عن طريق زيادة أو خفض حجم المسامية والمسام حسب الحاجة.
وهي مغلفة السقالة في هذه التجربة مع الكولاجين ECM نوع من البروتين أنا، وهذا البروتين، وجرى اختبار جنبا إلى جنب مع غيرها من البروتينات ECM سابقا مع نموذجنا 3D 11. وأظهر هذا أن نوع الكولاجين أنا تسارعت التصاق الخلية واختير لهذا السبب. يمكن تعديل الطلاء باستخدام بروتينات ECM مختلفة اعتمادا على نوع من الخلايا التي تجري دراستها. ميزة لإدراج بروتينات ECM إلى الاصطناعية السقالات أناق أن ليس فقط لأنها توفر تسلسل الخلية ملزم للالتصاق الخلية، ولكن تقدم أيضا التفاعلات الثانوية مع بروتينات ECM الأخرى والتفاعل مع عوامل النمو أن استقرار ملزم للخلايا وبالتالي تعزيز التصاق الخلية، مما يؤدي الى نمو الخلايا وأفضل نضوج.
أجريت دراسات عديدة على تكون الدم المجراة سابقا باستخدام كل من 2D و 3D النظم، وجميع من لهم تشمل إضافة تركيزات عالية بشكل غير طبيعي من السيتوكينات الخارجية. وقد ساعدت هذه الدراسات لتوضيح المحددات الجزيئية لتكون الدم، ولكن العناصر الخلوية وmicroenvironmental جزءا لا يتجزأ من هذه العملية كان من الصعب أن يحل على أساس القيود المفروضة على هذه التقنيات ذاتها.
الطريقة الموضحة هنا، وهو تقليد الطبيعة من BM مصنوعة من سقالة 1 البوليمرية المسامية العالية مقرونة طلاء ECM هو الأمثل للحفاظ على استقرار ونمو تكون الدم طبيعية وغير طبيعية من دونالحاجة إلى أي إضافة من السيتوكينات. ويدعم محاكاة متعددة مباشر تكون الدم مما يجعل نظام مناسب للاستخدام كمنصة لاكتشاف المخدرات والدراسة العلمية إلى آليات طبيعية وغير طبيعية تكون الدم المجراة سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الصندوق توماس ريتشارد سرطان الدم، وشركة تاتا ميموريال سيدة الثقة، والثقة مستشفى نورثويك بارك صندوق أبحاث سرطان الدم والمعهد الوطني للبحوث الصحية (NIHR)، المملكة المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N. Methods in Cell Biology. Prescott, D. 14, Academic Press Inc. New York. 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
