Summary
Un système de culture en 3D pour l'hématopoïèse est décrit en utilisant du sang de cordon humain et les cellules leucémiques de moelle osseuse. Le procédé est basé sur l'utilisation d'un polyuréthane poreux synthétique revêtue d'échafaudage protéines de matrice extracellulaire. Cet échafaudage est adaptable pour accueillir une large gamme de cellules.
Abstract
Les cellules souches hématopoïétiques besoin d'un micro-environnement unique afin de soutenir la formation des cellules sanguines 1; la moelle osseuse (BM) est un complexe en trois dimensions (3D) des tissus dans lequel l'hématopoïèse est régulée par l'espace organisé microenvironnements cellulaires appelées niches 2-4. L'organisation des niches BM est critique pour la fonction ou le dysfonctionnement de la normale ou maligne BM 5. Par conséquent, une meilleure compréhension de la dans le micro vivo utilisant un mimétisme ex vivo pourrait nous aider à élucider les déterminants moléculaires, cellulaires et microenvironnement de la leucémogenèse 6.
Actuellement, les cellules hématopoïétiques sont cultivées in vitro dans deux dimensions (2D) des flacons de culture de tissus ou bien les plaques 7 nécessitant soit co-culture avec allogéniques ou xénogéniques cellules stromales ou l'ajout de cytokines exogènes 8. Ces conditions sont artificielles et diffèrent de la in vivo 9,10 pluripotence.
Ici, nous présentons un nouveau système 3D de la culture de la moelle osseuse qui simule l'environnement in vivo la croissance 3D et soutient l'hématopoïèse multilignée en l'absence de facteurs de croissance exogènes. Le très poreuse échafaudage utilisé dans ce système constitué de polyuréthane (PU), facilite la croissance cellulaire à haute densité à travers une surface spécifique supérieure à la culture monocouche classique en 2D 11. Notre travail a indiqué que ce modèle a soutenu la croissance de sang de cordon humain (CB) des cellules mononucléaires (MNC) 12 et les cellules leucémiques primaires en l'absence de cytokines exogènes. Ce mimétisme roman 3D fournit une plate-forme viable pour le développement d'un modèle expérimental pour étudier l'homme de l'hématopoïèse et d'explorer de nouveaux traitements pour la leucémie.
Protocol
1. Fabrication d'échafaudage et de Bio-fonctionnalisation des échafaudages
- À fabriquer des échafaudages PU (taille de pores de 100 à 250 mm, une porosité de 90-95%) en forme de disques boîtes de Petri, utiliser la séparation de phase induite thermiquement 13 processus en préparant une solution de polymère (5% en poids dans du dioxanne) suivie par congélation et postérieure sublimation solvant (figure 1A).
- Couper le disque échafaudage en cubes de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm avant le revêtement avec des protéines ECM (figure 1B).
- Pré-humides, les échafaudages en les immergeant dans de l'éthanol (70%) pendant 1 min, puis transférer dans du tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 min. Puis centrifuger pendant 10 min à 3630 xg et ajouter la solution de protéines.
- Centrifuger les échafaudages dans la solution de protéine à 1420 xg pendant 20 min.
- Afin de débloquer les pores de la surface, et de permettre aux cellules ensemencées à pénétrer plus profondément dans l'échafaud, centrifuger les échafaudages une fois de plus à 910 xg pendant 10 mindans du PBS.
- Stériliser les échafaudages en utilisant une combinaison de 8 minutes d'exposition à 230 V, 50 Hz, 0,14 Une lampe UV, à l'immersion pendant 2 h dans de l'éthanol (70%). Après cela, lavez-les échafaudages à deux reprises dans du PBS avant d'ajouter Dulbecco modifié par Iscove moyen (IMDM) additionné de 30% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline et de streptomycine (P / S). Placez les échafaudages dans un incubateur humidifié pendant 3 jours à 37 ° C et 5% de CO 2 avant de les utiliser. Échafaudages stériles sont placés dans un 24 plaques de culture de tissus bien (un échafaudage par puits).
2. Isolement de cellules mononucléaires et de semis d'échafaudage
- Extrait de l'homme MNC du sang de cordon ou leucémiques échantillons de moelle osseuse, en utilisant Ficoll-Paque centrifugation en gradient de densité (35 min à 1500 rpm) (figure 1C).
- Resuspendre MNC en IMDM contenant 30% de FBS et 1% P / S.
- 100 pi de semences de suspension de MNC (2 × 10 6 cellules / échafaudage) sur les échafaudages en utilisant une pipette de micro-.
- Incuber la échafaudages ensemencés à 37 ° C sous 5% de CO 2 pendant 10 minutes pour les cellules à s'installer dans les échafaudages.
- Compléter chaque puits avec 1,5 ml de IMDM contenant 30% de FBS et 1% P / S et le lieu des plaques ainsi dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant la durée de l'expérience.
- Les échafaudages ensemencés subissent quotidiennement le changement de tous les médias.
3 Dans la prolifération des cellules in situ et de morphologie:. MTS, SEM et cytospins
- Test MTS: Retirer de la culture unique des Nations Unies tête de série et deux échafaudages ensemencés et les placer dans un 24 propre bien-nouvelle plaque. Ajouter 1 ml de milieu et 200 ul de la solution MTS et incuber pendant 3 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Prenez 8 x 100 échantillons ul du surnageant; place dans une plaque de 96 puits et l'absorbance mesure à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
- Microscopie électronique à balayage (MEB): À différents moments de ela culture e, enlever les échafaudages ensemencés avec MNC dans les médias, et de fixer à 2,5% du PBS tamponnée solution de glutaraldéhyde pendant 40 min à 4 ° C, puis laver deux fois avec du PBS.
- Déshydratés, les échafaudages dans une série graduée de l'éthanol (25, 50, 70, 80, 90, 95 et 100%), chacun pour 10 min et sec dans un environnement aseptique pendant 4 heures.
- Spécimens section, puis les enrober par pulvérisation avec de l'or dans une atmosphère d'argon pendant 2 min avant l'évaluation SEM, utilisez une tension d'accélération de 20 kV.
- Cytospins: Recueillir 2,0 x 10 4 cellules par lame en aspirant les cellules de l'échafaud à différents moments de la culture.
- Centrifuger les cellules sur une lame de verre pendant 3 min à 1500 rpm.
- Colorer les lames avec Wright-Giemsa modification et d'observer à l'aide d'un microscope optique. F-voir Soft Imaging System peut être utilisé pour prendre des photos.
- Laver les lames avant observation au microscope.
- M analyse ultiphoton: échafaudages fixer sur les points de temps différents avec la vapeur d'éthanol (70%) pendant la nuit et puis sécher et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse plus loin. Avant de visualisation avec la section microscope multiphotonique l'échafaud en 30 um d'épaisseur des lames et mouillé avec du PBS.
- Bloquer le échafaudages ensemencés dans du PBS avec 10% de sérum de veau foetal pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber les échafaudages nuit à 4 ° C dans l'obscurité avec une dilution de 1:50 de l'anticorps monoclonal primaire: anticorps de souris anti CD71 humain.
- Laver les échantillons trois fois dans du PBS et la tache avec l'anticorps secondaire: anti-souris Alexa Fluor 488 pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver les échantillons trois fois avec du PBS et d'observer avec un microscope confocal à l'aide d'une émission d'eau objectif x60 objectif.
- Fluorophore Alexa Fluor 488 est excité à 488 nm par des lasers impulsionnels. Volocity 5.3.2 du logiciel peut être utilisé pour l'analyse d'image ultérieure.
- Avant l'analyse cellulaire dans le cytomètre en flux (FC), étiqueter les cellules d'intérêt avec les anticorps correspondants immunofluorescence pour la détection. Un certain nombre d'échantillons sont préparés selon l'une des anticorps sélectionnés pour la détection. Pour la détection MNC la combinaison suivante d'anticorps sont utilisés: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- Aspirer les cellules de l'échafaud à différents moments et de centrifugeuses. Dissoudre une cellule d'environ 1x10 6 cellules culot dans 100 pi de tampon FC (azoture de sodium PBS + 0,1%) et ajouter 10 ul de chaque colorant fluorescent anticorps. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 ° C, laver deux fois avec du PBS et enfin re-mettre en suspension dans un tampon FC.
- Calcul de l'échantillon dans l'teinté cytomètre de flux avec la commande pour régler l'isotype "négativité" de l'expression d'anticorps et d'étalonner les canaux de détection de la commande du cytomètre en flux.
- Lire les vitraux échantillon w vec les trois anticorps différents et, enfin, représenter les données dans l'aide du logiciel WinList.
5. Les résultats représentatifs
Un exemple de cinétique de croissance hématopoïétiques cellulaires sans l'ajout de facteurs de croissance exogènes est montré dans la figure 2. En raison de la nature hétérogène de l'hématopoïèse, deux cellules différentes: normales et anormales des cellules hématopoïétiques sont illustrés. Dans la figure 2A, la prolifération cellulaire des CBMNC humaine est évident après 28 jours de culture. La figure 2B montre la cinétique de croissance dans le mimétisme utilisant des cellules leucémiques primaires. La prolifération cellulaire est évaluée en utilisant le test de MTS, qui mesure l'activité métabolique cellulaire par rapport à l'absorbance. Dans les deux cas, les cellules prolifèrent et établie dans le modèle. Les différences de cinétique de croissance sont observées; cellules hématopoïétiques normales établissent la culture plus vite que les cellules leucémiques.
_content "> La morphologie des cellules récoltées, même après 28 jours de culture en l'absence de facteurs de croissance exogènes était typique de cellules hématopoïétiques normales (figure 3A) et des cellules leucémiques (figure 3B). sections centrales des échafaudages ont été analysés par MEB après les échafaudages ont été retirés de la culture et a montré la propagation des cellules ensemencées dans toute l'échafaud, pour s'établir en grappes et en "niche comme« structures (figure 3A '& B'). Figure C montre la taille des pores et la distribution dans un unseeded échafaudage utilisé comme un contrôle. microscopie multiphotonique après 28 jours a été utilisée pour mettre en évidence la répartition des cellules dans l'échafaud 3D in situ et il a montré la présence d'îles érythroïde dans les sections centrales de l'échafaud (figure 4) par l'expression du marqueur CD71 qui est positif dans les érythroblastes. Cela prouve l'importance de la maturité et les cellules à échéance duérythropoïèse anneau. Enfin, les graphiques de cytométrie en flux de l'ensemencement des cellules avant montre la différence dans le phénotype des cellules hématopoïétiques, où la figure 5A représente les cellules normales hématopoïétiques: CBMNCs de l'homme et la figure 5B illustre les cellules hématopoïétiques anormales de cellules leucémiques primaires:. Les niveaux de CD235a + et CD45 + correspondant à érythrocytes et les leucocytes sont respectivement plus élevés dans l'échantillon normal que dans le leucémique soulignant la nature hemoblastic des leucémies.
Figure 1. Illustration des processus impliqués dans la fabrication et la PU échafaudage bio-fonctionnalisation. A) PU est dissous dans du dioxane (5% en poids) et par le processus de séparation de phase induite thermiquement et postérieure par sublimation solvant l'échafaudage est produit, tel que décrit par Safinia et al 13. B) Le disque échafaudage est ensuite coupé intcubes o de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm, puis revêtu par centrifugation avec extracellulaires matrice (ECM) protéines. C) MNC sont extraites du cordon ombilical humain CB ou de l'aspiration BM en utilisant la centrifugation en gradient de densité et de graines (2x10 6 cellules / échafaudage) dans la échafaudages en PU avec une micropipette.
. Figure 2 prolifération cellulaire mesurée par le test SCM: A) en utilisant humaine sang de cordon MNC; B) en utilisant des cellules leucémiques primaires. Les colonnes indiquent la croissance des cellules dans le temps lorsque ensemencées dans le échafaudages PU sans l'ajout de cytokines exogènes.
Figure 3: La morphologie cellulaire et de la distribution autour des échafaudages à l'aide cytospins, Scanning micrographies électroniques. (AB) représentatifs de Wright-Giemsa cytospins tachées de cellules A) de sang de cordon mononucléaires collectées à partir d'échafaudages PU après 28 jours de culture, et B) des os aspiration cellules leucémiques recueillies auprès des échafaudages PU après 14 jours de culture. Les deux expériences ont été réalisées dans un état de cytokine libre. (A'-B ') représentant les sections centrales des micrographies SEM PU échafaudage de A') semé le sang du cordon multinationales et B ') des cellules leucémiques après avoir été cultivées pendant 28 jours, et C) de contrôle d'échafaudage sans cellules.
Figure 4. Micrographie multiphotonique d'un tête de série PU échafaud avec le sang du cordon multinationales après le 28 d dans la culture et colorées avec le marqueur CD71 érythroïde.
Figure 5. de cytométrie en flux 3D Dot-parcelles colorées pour CD45, CD71 et des marqueurs CD235a expression à la surface. Le contrôle isotypique obtenu est également présenté pour la comparaison de l'intensité relative de fluorescence. Le panneau A montre des cellules mononucléées de sang de cordon positifs pour les marqueurs ci-dessus; B Panel montre les cellules leucémiques humaines primaires.
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Discussion
Le système de culture ex vivo 3D présenté ici nous permet d'établir un biomimétisme 3D de l'hématopoïèse qui récapitule l'architecture d'origine BM et phénotype cellulaire indépendante des cytokines exogènes. Le modèle 3D fournit la structure et le microenvironnement qui permet normales et anormales des cellules hématopoïétiques à proliférer dans des conditions similaires à celles rencontrées in vivo.
La sélection du matériau polymère échafaudage représenté une étape cruciale dans la conception biomimétisme. Avantages importants dans les biomatériaux ont conduit à un intérêt croissant dans les polymères qui imitent l'environnement in vivo en fournissant de l'architecture requise, les propriétés structurales et biosignaux nécessaires. Les polymères doivent satisfaire aux exigences minimales essentielles pour leur application dans le domaine biomédical, car ils sont toujours en contact direct avec les cellules vivantes, qui sont sensibles à leur environnement immédiat. En général, un ibeaucoup échafaudage doit être biocompatible, très poreux, avec une résistance mécanique suffisante pour maintenir une structure définie en 3D, une grande surface par rapport en volume et de la fabrication reproductible. PU comprend toutes les propriétés ainsi que, bien que la porosité élevée et une résistance mécanique peut être adapté et modifié en fonction de la température de trempe au cours du processus TIPS. À la suite, ce biomimétisme peut être adapté pour d'autres types de cellules en augmentant ou en diminuant la taille de pores de porosité et au besoin.
L'échafaudage dans cette expérience est revêtue avec le type ECM collagène protéine I; cette protéine, conjointement avec d'autres protéines de la MEC ont été testés précédemment avec notre modèle 3D 11. Ceci a montré que le collagène de type I accéléré l'adhésion cellulaire et a été sélectionné pour cette raison. Le revêtement peut être modifié en utilisant des protéines ECM différents selon le type de cellules qui sont étudiées. L'avantage d'incorporer les protéines de la MEC à l'synthétique i échafaudagess que non seulement ils fournissent la séquence de cellules de liaison de l'adhésion cellulaire, mais aussi offrir des interactions secondaires avec d'autres protéines de la MEC et les interactions avec des facteurs de croissance qui stabilisent la liaison des cellules renforçant ainsi l'adhésion cellulaire, qui se traduit par une meilleure croissance cellulaire et la maturation.
De nombreuses études ont été réalisées sur l'hématopoïèse ex vivo utilisant à la fois en 2D et en 3D des systèmes, et chacun d'eux comprennent l'ajout de concentrations anormalement élevées de cytokines exogènes. Ces études ont contribué à élucider les déterminants moléculaires de l'hématopoïèse, mais les éléments cellulaires et microenvironnement partie intégrante de ce processus ont été difficiles à déchiffrer sur la base des limites de ces mêmes techniques.
La méthode décrite ici, un biomimétisme de la BM fait d'un échafaudage très poreux polymère couplé avec ECM revêtement est optimale pour le maintien et la stabilisation de la croissance de l'hématopoïèse normale et anormale, sansla nécessité d'une addition de cytokines. Le mimétisme supporte le multi-linéaire hématopoïèse rendant le système peut être utilisé comme une plate-forme de découverte de médicaments et l'étude scientifique des mécanismes de l'hématopoïèse in vivo ex normal et anormal.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Fonds Thomas Richard leucémie, la dame Tata Memorial Trust, le Northwick Park Hospital Fonds leucémie Research Trust et l'Institut national de recherche en santé (INDH), au Royaume-Uni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
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