Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

Summary

Die Myofibroblasten ist ein einfluss Stromazellen des Magen-Darm-Trakt, die wichtige physiologische Prozesse in normalen und Krankheitszustände regelt. Wir beschreiben eine Technik, die für die Isolierung von primären Myofibroblasten aus Maus und menschlichen Dickdarmgewebe, das für die in vitro Experimente verwendet werden können, ermöglicht.

Abstract

Die Myofibroblasten eine Stromazellen des Magen-Darm-Trakt (GI), die gewonnen hat beträchtliche Aufmerksamkeit für seine kritische Rolle in vielen Funktionen GI. Während mehrere Myofibroblasten Zelllinien sind im Handel erhältlich, diese Zellen in vitro zu untersuchen, Forschungsergebnisse aus einer Zelllinie, experimentelle Zellkulturbedingungen ausgesetzt haben inhärente Beschränkungen aufgrund der übermäßig reduktionistischen Art der Arbeit. Einsatz von Primär Myofibroblasten bietet einen großen Vorteil in Bezug auf die Bestätigung in einer Zelllinie identifiziert experimentellen Befunde. Isolierung von primären Myofibroblasten aus einem Tiermodell erlaubt die Untersuchung von Myofibroblasten unter Bedingungen, die stärker nachzuahmen der Krankheitszustand untersucht. Isolation von Primär-Myofibroblasten aus menschlichen Dickdarmgewebe bietet wohl die wichtigsten experimentellen Daten, da die Zellen kommen direkt von Patienten mit der Grunderkrankung. Wir beschreiben eine etablierte Technik, die u seintilized Primär Myofibroblasten sowohl aus Maus und Mensch Dickdarmgewebe zu isolieren. Diese isolierten Zellen wurden charakterisiert, um alpha-smooth muscle Aktin und Vimentin-positiven und-negativen Desmin, im Einklang mit subepithelialen Myofibroblasten Darm sein. Primär Myofibroblasten Zellen in Zellkultur gezüchtet und für experimentelle Zwecke über eine begrenzte Anzahl von Durchgängen verwendet werden.

Introduction

Die Regelung der Funktionstrakt gastrointestinale (GI) ist mit komplexen, dynamischen Wechselwirkungen zwischen der Schleimhautschicht und der zugrunde liegenden Mesenchym. Diese Interaktionen dienen in der Regel, um die Homöostase aufrecht zu erhalten, kann aber auch auf die Entwicklung von Krankheitszuständen führen, unter pathologischen Bedingungen ^ein. Myofibroblasten sind eine Subpopulation von Stromazellen an der Epithelschicht, die in einer Umgebung mit parakrin Zell-Subpopulationen, um eine Reihe von kritischen Prozessen, die GI-Trakt Schleimhautregeneration, Reparatur und Fibrose ² einschließen, regeln, welcher unterhalb kommunizieren.

Die 18Co-Zelllinie ist ein Beispiel eines menschlichen Kolon-Myofibroblasten Zelllinie, die weit verbreitet ist, um Myofibroblasten Funktion zu studieren, weil es viele der Eigenschaften von Primär in situ Myofibroblasten Aktien. Dazu gehören die Proteinexpression von einer glatten Muskel-Aktin (α-SMA) und Vimentin, als auch die Expression einer ReiheZelloberflächenrezeptoren wie der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor oder Rezeptoren für Lysophosphatidsäure ^3,4. Da dieser gemeinsamen Merkmale ultra sowie Ähnlichkeiten in biologischen Funktion ⁵ hat die 18Co-Zelllinie wurde ausgiebig verwendet, um Myofibroblasten Funktion im Zusammenhang mit vielen Krankheitszuständen, wie entzündliche Darmerkrankung oder Darmkrebs ^3,6 studieren. Allerdings gibt es inhärente Beschränkungen und Bedenken bei der Verwendung einer Zelllinie. Dazu gehören genotypische Instabilität über die Zeit, die Zelllinien aus Primärzellen unterscheidet, Änderung der Phänotyp und die biologische Funktion der Zelle, einschließlich Wachstumsraten und Wechselwirkungen mit anderen Zellpopulationen. Zellinien fehlt auch die normalen Komponenten der GI-Mikroumgebung (Epithel-, Stroma-und Gefäß Komponenten), die eine große Einschränkung ihrer Verwendung ist. Daher sind die Schlussfolgerungen aus experimentellen Zelllinie gezogen Forschung erfordert eine weitere Bestätigung, um die ri reduzierensk von Fehlinterpretationen.

Primäre Myofibroblasten aus Mensch und Maus Dickdarmgewebe erhalten werden, um in einer Zelllinie ⁷ identifiziert experimentellen Ergebnisse zu bestätigen. Das Verfahren wurde ursprünglich von Mahida, et al. ⁸ beschrieben, und unser Protokoll ist eine von vielen gut beschriebene Techniken, die verwendet werden kann, um primäre Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon ⁹ isolieren. Für jede Maus-Modell der Dickdarmerkrankung, kann diese Technik verwendet, um primäre Myofibroblasten zu isolieren, um zu studieren, wie sie mit Nachbarzellen interagieren, oder dazu beitragen, sowohl normalen oder pathologischen GI ^10,11 verarbeitet werden. Diese Technik kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Myofibroblasten tragen zur Heilung, Fibrose, und die Entwicklung von kolorektalen Adenomen und Karzinomen der Schleimhaut werden. Primär Myofibroblasten auch von humanen Kolon-Gewebe, das bei der Operation für gutartige (entzündliche Darmerkrankung, Strikturen, Divertikulitis) oder bösartig c reseziert worden ist, erhalten werden,ie Bedingungen. Isolierten primären Zellen aus Mensch und Maus Dickdarmgewebe in Zellkultur gezüchtet und über eine begrenzte Anzahl von Durchgängen verwendet werden.

Protocol

1. Erhalten Colon Tissue

Maus

Ein Protokoll zum Tierversuch durchzuführen, detailliert die Gründe und Ziele der Forschung, vorgelegt und von unserem institutionellen Amt für Tierforschung Aufsicht genehmigt wurde.

1. Euthanize die Maus mit inhalativen Isofluran durch Genickbruch folgte.
2. Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt, Einfahren der Dünndarm entfernt und Identifizierung der Doppelpunkt. Fahren Sie die Blase und Gebärmutter (falls vorhanden), die seitlich und Identifizierung des Schambeins und schneiden Sie es mit einer feinen Schere, um den Mastdarm aus.
3. Präparieren Sie die dorsalen Mesenterium des Mastdarms aus der Dickdarm-und Dickdarm zu mobilisieren, die aus dem After, um den Blinddarm, und es durchschneiden, um den Darm aus dem Dünndarm zu trennen.
4. Man gibt die Probe in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
5. Füllen Sie eine Spritze mit 10 ml eiskaltem PBS und spülen den Darm Lumen mehrmals, um den Inhalt zu löschen, dann schneiden Sie den Doppelpunkt open der Länge nach mit einer Schere.
6. Setzen Sie den Doppelpunkt in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 20 ml eiskaltem PBS. Der Darm nicht in einer bestimmten Ausrichtung angeordnet werden. Waschen Sie den Doppelpunkt durch den Austausch des PBS, bis die Flüssigkeit klar ohne Feinstaub.

Mensch

Ein Protokoll für die menschliche Gewebe von chirurgischen Patienten zu erhalten, detailliert die Bedeutung der Erhalt dieser Gewebe sowie eine Bewertung der potenziellen Risiken und Vorteile, vorgelegt und von unserem institutionellen Amt des Human Research Protection Program genehmigt wurde.

1. Forschungskooperation mit einem kolorektalen Chirurgen notwendig ist, um in der Lage, menschliches Gewebe für Ihre Forschung zu erhalten. Ein Protokoll der menschlichen Dickdarmgewebe zu erhalten, sollte eingereicht werden und die Ihr Institutional Review Board genehmigt werden.
2. Schriftliche Einverständniserklärung von dem Patienten vor dem chirurgischen Eingriff erhalten.
3. Der Chirurg wird einen Doppelpunkt Resektion im Stand durchführenard Mode. Sobald der Darm aus dem Patienten entfernt worden ist, wird die Probe sofort entnommen Pathologie. Eine 0,5 in voller Dicke Abschnitt Darmwand nicht für die pathologische Auswertung benötigt wird und wird unmittelbar auf eiskaltem PBS gelegt. Dieses Exemplar sollte nicht die Dickdarm-Mesenteriums und epiploicum Anhänge sollten ebenfalls entfernt werden, da das Vorhandensein von Fett wird die Verdauung beeinflussen.

2. Entblößen Epithelzellen

1. Inkubieren der gesamten Maus Kolon in 25 ml 5 mM EDTA in HBSS (Raumtemperatur) in einem 50 ml konischen Röhrchen. Legen Sie die konische Röhrchen in einem 37 ° C Luft-Bad Schütteln (250 rpm) für 15 min. Nach 15 Minuten vorsichtig abgießen der Flüssigkeit und füllen Sie den Schlauch mit 25 ml 5 mM EDTA, wiederholen Sie für insgesamt 5 Wäschen. Für menschliche Dickdarm, nach Erhalt einer ½ Zoll-Streifen der Darmwand von der Pathologe schneiden den Doppelpunkt mit einer Schere in vier gleich große Stücke schneiden. Legen zwei der Stücke in einen 50 ml konischen Röhrchen undDie restlichen zwei Stücke von Dickdarm-Gewebe in einem separaten 50 ml konischen Röhrchen. Dann inkubiert mit 25 ml 5 mM EDTA in HBSS und führen Waschungen wie oben beschrieben.
2. Zweimal Spülen Sie den Dickdarm in 20 ml eiskaltem PBS.
3. Die Maus Dickdarmgewebe in eine neue 50 ml konischen Röhrchen, enthaltend 20 ml RPMI-5, 10 U Dispase und 2.000 U Kollagenase D (Raumtemperatur). Für den menschlichen Dickdarmgewebe, verwenden Sie die doppelte Menge an Dispase und Kollagenase (20 U Dispase, 4.000 U Kollagenase D).
4. Das Röhrchen wird in einem 37 ° C schütteln Luftbad vertikal ausgerichtet (Wenn horizontal platziert, es gibt zu viel Be-und Zellschäden). Schütteln bei 250 rpm für bis zu 60 min. Nach Kontakt mit dem Dispase und Collagenase D, wird der Dickdarmgewebe zu starten, um zu verdauen und die Dickdarmgewebe beginnt zu sehnig aussehen. Dies dauert in der Regel ca. 30 min. Wenn der Darm hat diese Erscheinung, entfernen den Dickdarm von den Enzymen.
5. Schütteln Sie jedes Rohr nach oben und unten 2-4 mal zu brechen das Gewebe. PEllet das Gewebe bei 200 × g in einer Tischzentrifuge (4 º C) für 5 min. Vorsichtig gießen Sie den Überstand und entsorgen.

3. Myofibroblasten Isolierung und Kultur

1. Resuspendieren jedes Pellet durch Zugabe von 10 ml ACK-Lysepuffer (47 ° C). Zentrifuge wieder bei 200 g für 5 min (4 ° C), abgießen und den Überstand verwerfen.
2. Resuspendieren jedes Pellets durch Zugabe von 10 ml RPMI-5 mit einer Pipette.
3. Geben Hälfte der Zellsuspension (5 ml) über einen 70 &mgr; m-Mesh-Sieb mit einer 10 ml Pipette in ein 100 mm TC-behandelten Teller. Dann fügen Sie weitere 15 ml RPMI-5. Wiederholen mit den verbleibenden 5 ml der Zellsuspension in einen anderen 100 mm TC-behandelten Teller. Eine Maus Doppelpunkt wird daher ergeben zwei 100 mm TC-behandelt Gerichte. Eine ½ Zoll-Streifen der menschlichen Dickdarmgewebe wird insgesamt vier 100-mm-TC-behandelt Gerichte ergeben.
4. Platzieren der Gewebekulturplatten in einer 10% CO _2-Inkubator bei 37 ° C Die Kulturbedingungen sind die gleichen foder Maus und humane primäre Zellen.
5. Nach 3 Std., sanft abwaschen nicht-adhärenten Zellen mit zwei Änderungen HBSS. Die Trümmer Floating sollte vorsichtig ausgewaschen werden. Adhärente Zellen epithelialen Zellen, Makrophagen und Myofibroblasten besteht. Eine Woche nach der Aussaat, Myofibroblasten nur teilen, Makrophagen und Epithelzellen altern nach dem ersten Durchgang. In frischem RPMI-5 und wachsen die Zellen in Zellkultur.
6. Die Zellen werden durch Trypsinierung für 5 min agiert und sind gespalten 02.01.

Abkürzungen

HBSS: Hank-Salzlösung; RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute Medien; ACK: Ammonium-Chlorid-Kalium; FCS: fetales Kälberserum, TC-behandelt: Gewebekultur behandelt

Lösungen

ACK-Lysepuffer - (4,15 g NH ₄ Cl, 0,5 g KHCO _3, 18,6 mg Na ₂ EDTA, 400 ml H ₂ O, pH-Wert auf 7,2-7,4 mit 1 N HCl). Filter sterilisierbare durch einen 0,2 um Filter und bei 4 ° C RPMI-5 - (bis 500 ml machen: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-Glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM Natrium-Pyruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME in PBS).

Representative Results

Einmal isoliert, primäre menschliche Myofibroblasten in Zellkultur gezüchtet und über eine begrenzte Anzahl von Durchgängen verwendet werden (bis zu Passage 4). Diese Zellen werden als ein-smooth muscle Aktin und Vimentin positiv gekennzeichnet, und Desmin-negativ (Abbildung 1A), im Einklang mit Darm subepithelialen Myofibroblasten ^5,7. Sie haben auch eine charakteristische stern Morphologie (Fig. 1B). Primär Myofibroblasten kann dann verwendet werden, um eine Zelllinie identifiziert experimentellen Ergebnisse zu bestätigen. Dieser Ansatz wurde genutzt, um zu zeigen, dass die pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α (10 ng / ml) induziert die Hochregulation der EGF-Rezeptor-Expression und Signal in diesen Zellen ^7. Hochreguliert EGF-Rezeptor-Expression und Signalisierung wurde zunächst festgestellt, die Nutzung der oben genannten menschlichen Kolon-Myofibroblasten Zelllinie 18Co (Abbildung 2). In Fig. 2A zeigen wir, dass die Exposition von Zellen gegenüber TNF 18Co-45; um eine zeitabhängige Zunahme der EGF-Rezeptor-Expression führte. Dies verbessert mit EGF-induzierte COX-2 Expression und p42/44 MAPK-Phosphorylierung in diesen Zellen (2B) korreliert. Um diese experimentellen Ergebnisse zu validieren, wurden Experimente mit primären humanen Myofibroblasten aus chirurgisch entfernten Dickdarm von Patienten mit kolorektalem Karzinom isoliert wiederholt. Wie in 2C und 2D gezeigt, primäre menschliche Myofibroblasten ahmen die experimentellen Ergebnisse zunächst im 18Co-Zellinie ⁷ identifiziert.

Fig. 1 ist. Primäre Myofibroblasten aus humanen Kolon-Gewebe ⁷ isoliert werden. Isolierte primäre Zellen zeigen eine Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp, die konsequent sind ein-SMA und Vimentin positiv (Abbildung 1A) und zeigen eine sternförmige Morphologie (

2. Experimentelle Befunde in einer Zelllinie werden mit primären humanen Zellen Myofibroblasten ⁷ belegt. Der menschliche Kolon Myofibroblasten-Zelllinie 18Co wurde verwendet, um die TNF-α zeigen, induziert die Hochregulation von EGF-Rezeptor-Expression und Signalisierung in diesen Zellen (Fig. 2A). Diese Hochregulierung von EGF-Rezeptor-Expression wurde mit verbesserter EGF-Rezeptor-Signal zugeordnet ist, in Fig. 2B, in denen die nachfolgende Einwirkung von EGF führte zu verbesserten p42/44 MAPK-Phosphorylierung und COX-2-Expression gezeigt. Diese Effekte wurden vollständig mit dem EGF-Rezeptor-Inhibitor AG1478 gehemmt. Primäre humane Myofibroblasten aus chirurgisch entfernten Dickdarm von Patienten mit kolorektalem Karzinom isoliert bestätigen diese experimentellen Befunde (2Cund 2D). Tumor-Nekrose-Faktor-alpha TNF-α =, EGFR = EGF-Rezeptor, AG = AG1478, COX-2 = Cyclooxygenase-2. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

3. Primäre Myofibroblasten aus Maus Dickdarmgewebe isoliert werden. Ein Blick auf 10X primären Mauszellen Myofibroblasten. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die allgemeine Technik ist ähnlich wie bei der Verwendung von entweder Maus-oder menschlichen Kolon. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Myofibroblasten aus dem Dünndarm zu isolieren. Konkrete Angaben zur Isolierung von Myofibroblasten aus 1. Maus und 2. menschlichen Dickdarm werden nachstehend erörtert.

1. Maus Colon

Spülung des Dickdarms Maus wird durch Anbringen eines 4 in 16 g Popper stumpfendig Nadel an einem Ende des Dickdarms erleichtert. Dies hilft auch beim Schneiden der Doppelpunkt der Länge nach. Sie können die Dickdarmgewebe auf die Nadel Akkordeon, legen Sie dann eine Spitze der Schere mit dem scharfen Ende nach oben und schieben Sie die Dickdarmgewebe über den Scherenrand beim Schneiden, um es der Länge nach zu öffnen.

In Schritt 2.1, ist es wichtig zu verstehen, dass Kernmaterial von toten Zellen, Zellklumpenbildung führen. Die Zugabe von DNase (50 mg / ml) verwendet werden, um dieses Problem anzugehen.

Der wichtigste Schritt ist der Schritt 2.4. Halten Sie eine ca.Reful Uhr der Dickdarmgewebe. Wenn der Darm beginnt zu sehnig aussehen, entfernen den Dickdarm von den Enzymen. Sie brauchen nicht, um den Darm für die gesamte 60 min inkubiert. Wenn der Dickdarmgewebe ist an der Dispase und Collagenase D zu lange ausgesetzt wird, die Zellen sterben. Dies ist ein häufiger Fehler, dass in einer niedrigen Zellausbeute führt.

Kontamination der Zellen ist ein weiteres häufiges Problem. Sorgfältige Technik entsprechenden Waschen und Filtrieren wird das Risiko einer Kontamination zu minimieren, mit sterilen Standardtechniken für die Zellkultur Arbeit verwendet.

2. Menschen Colon

Die Zeitdauer für die Inkubation mit den Enzymen ist abhängig von der Größe der Probe, die verdaut wird. Wir erhalten in der Regel eine ½-Zoll-Full Dicke Streifen von menschlichen Darmwand. Es ist eine Modifikation in Schritt 2.3 bei der Isolierung von Myofibroblasten aus menschlichen Dickdarmgewebe. Für Schritt 2.3 für den menschlichen Dickdarm müssen die Menge des Dispase (20 U) und CO-Doppelllagenase D (4000 U) eingesetzt. Eine noch größere Segment der Doppelpunkt eine längere Inkubationszeit erforderlich. Auch im Auge behalten, dass die spezifische Aktivität der Enzyme kann mit viel variieren, so dass Sie möglicherweise die Inkubationszeit entsprechend anpassen.

Sowohl primäre Maus und Mensch Myofibroblasten 0nce in Kultur gezüchtet, sollten die isolierten Zellen ausgewertet werden, um die Reinheit der Zellen prüfen und zu bestätigen, dass die Zellen Myofibroblasten-like. Dies kann mit einer Vielzahl von Verfahren einschließlich immunhistochemischer Färbung (Antikörper Marker Myofibroblasten sind:-Aktin des glatten Muskels und Vimentin erfolgen; monoklonalen Antikörper gegen CD68 spezifisch an Makrophagen, ist CD31 spezifisch an Endothelzellen und CD45 spezifischen Immunzellen; Antikörper gegen E-Cadherin und verschiedene Zytokeratine spezifisch für Epithelzellen. mRNA-Expression kann auch durch ^RT-PCR-12 beurteilt werden. Durchflusszytometrie kann auch für die Zellanalyse ¹³ verwendet werden.

in vitro und Co-Kultur-Experimente. Primäre Zellen können auch in das subkutane Gewebe von Mäusen, Zell-Zell-Interaktionen zu studieren ¹⁴ implantiert werden. Zukünftige Anwendungen können Re-Implantation von Primär Myofibroblasten in der Darmwand von einem syngenen Maus Verwendung der Maus Koloskopie folgenden genetischen Manipulation beinhalten.

Eine Reihe von Alternativmethoden zu primären Myofibroblasten aus Mensch und Maus zu isolieren Doppelpunkt sind ebenfalls beschrieben worden. Zwei sind unten aufgeführt:

1. Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348 (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K