Summary
तीव्र मस्तिष्क आघात की तारीख के लिए कोई पर्याप्त उपचार है कि एक गंभीर चोट है. माइक्रोस्कोपी multiphoton अनुलंबीय तीव्र मस्तिष्क आघात विकास की प्रक्रिया का अध्ययन और कृन्तकों में चिकित्सा संबंधी रणनीतियों की जांच के लिए अनुमति देता है. मस्तिष्क के vivo दो photon इमेजिंग के साथ अध्ययन तीव्र मस्तिष्क आघात के दो मॉडल इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन कर रहे हैं.
Abstract
तीव्र मस्तिष्क आघात अक्सर अलग दुर्घटनाओं में सिर क्षति का परिणाम है और आबादी का एक बड़ा हिस्सा प्रभावित करता है, इसके लिए कोई प्रभावी उपचार अभी तक नहीं है. वर्तमान में इस्तेमाल पशु मॉडल की सीमाएं विकृति तंत्र को समझने में बाधा. माइक्रोस्कोपी multiphoton अनुलंबीय शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत बरकरार पशु दिमाग के भीतर कोशिकाओं और ऊतकों का अध्ययन कर देता है. यहाँ, हम posttraumatic परिस्थितियों में मस्तिष्क कोशिका व्यवहार की दो photon इमेजिंग के माध्यम से अध्ययन तीव्र मस्तिष्क की चोट के दो मॉडल का वर्णन. एक चयनित क्षेत्र मस्तिष्क मस्तिष्क पैरेन्काइमा में एक नियंत्रित चौड़ाई और गहराई का एक आघात के उत्पादन के लिए एक तेज सुई के साथ घायल है. हमारे विधि एक साथ दवा आवेदन के साथ जोड़ा जा सकता है जो एक सिरिंज सुई, साथ stereotaxic चुभन का उपयोग करता है. हम इस विधि स्तनधारी मस्तिष्क में तीव्र आघात के pathophysiological परिणामों के सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उन्नत उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्ताव
Introduction
तीव्र मस्तिष्क की चोट, मोटर वाहन दुर्घटनाओं में चोट के उच्च घटना के साथ एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है गिर जाता है या हमले, और बाद में स्थायी विकलांगता की उच्च व्यापकता. मस्तिष्क की चोट के इलाज के लिए चिकित्सकीय दृष्टिकोण इस प्रकार, prehospital शल्य चिकित्सा और क्रिटिकल केयर के प्रभाव को सीमित करने, पूरी तरह से प्रतीक बने हुए हैं. यह मस्तिष्क की चोट के सामाजिक और आर्थिक प्रभाव विशेष रूप से गंभीर बना देता है. कारणों की एक किस्म के लिए, नैदानिक परीक्षणों के अधिकांश उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण का उपयोग कर मस्तिष्क की चोट के बाद वसूली में सुधार प्रदर्शित करने में विफल रहा.
पशु मॉडलों दवा प्रभावकारिता मस्तिष्क की चोटों के साथ रोगियों में भविष्यवाणी की जा सकती है जहां एक मंच की ओर से नयी चिकित्सकीय रणनीति के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं. वर्तमान में, सिर आघात के कई अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल नियंत्रित cortical प्रभाव 1, द्रव टक्कर चोट 2, गतिशील cortical विरूपण 3, वजन ड्रॉप सहित मौजूद4, और फोटो चोट 5. प्रयोगात्मक मॉडल की एक संख्या सिर आघात जुड़े विकृति के कुछ, रूपात्मक आणविक और व्यवहार सभी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, कोई भी पशु मॉडल नई चिकित्सकीय रणनीति मान्य करने में पूरी तरह सफल है. मस्तिष्क की चोट की वजह से, विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत नियंत्रित पशु मॉडल का विकास जटिल रोग प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए आवश्यक है.
नवीनतम सूक्ष्म इमेजिंग प्रौद्योगिकी और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपन्यास संयोजन प्राथमिक चोट, माध्यमिक चोट, और उत्थान के प्रसार, प्राथमिक चोट शामिल हैं जो मस्तिष्क की चोट के सभी चरणों, जांच करने के लिए एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है. विशेष रूप से, vivo में दो photon माइक्रोस्कोपी कृंतक मस्तिष्क के गहरे cortical परतों में सेलुलर और भी subcellular संरचनाओं के वास्तविक समय दृश्य की अनुमति देता है कि एक अद्वितीय nonlinear ऑप्टिकल तकनीक है. कोशिकाओं और संगठनों के कई प्रकारnelles विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्करों के संयोजन के द्वारा एक साथ imaged किया जा सकता है. इस शक्तिशाली उपकरण का उपयोग करना, हम posttraumatic परिस्थितियों में मस्तिष्क में रहने वाले गतिशील रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन कल्पना कर सकते हैं. मस्तिष्क की चोट का अध्ययन करने में vivo में दो photon माइक्रोस्कोपी के फायदे हाल ही में किरोव और उनके सहयोगियों ने 6 के द्वारा प्रदर्शन किया गया. एक हल्के फोकल cortical कुचलन मॉडल का उपयोग करना, इन लेखकों pericontusional प्रांतस्था में तीव्र वृक्ष के समान चोट स्थानीय रक्त के प्रवाह में गिरावट से gated है कि दिखाया. इसके अलावा, वे नील स्थल के आसपास मुमकिन है समझौता प्रांतस्था आगे प्रसार विध्रुवण से क्षतिग्रस्त है कि प्रदर्शन किया. यह माध्यमिक क्षति घाव मस्तिष्क की चोट के परिणामों और अधिक गंभीर बना रही है, synaptic circuitry को प्रभावित करता है.
यहाँ, हम स्थानीय मस्तिष्क के लिए एक उन्नत मॉडल के रूप में, एक साथ सामयिक दवा आवेदन के साथ जोड़ा जा सकता है जो एक सिरिंज सुई, साथ stereotaxic चुभन की विधि का प्रस्तावचोट और vivo में स्तनधारी मस्तिष्क में तीव्र आघात के pathophysiological परिणामों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में.
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Protocol
यहाँ प्रस्तुत सभी प्रक्रियाओं जानवरों की देखभाल (पशु प्रयोग 62/2006 पर फिनिश अधिनियम) के लिए स्थानीय मार्गदर्शन के अनुसार प्रदर्शन किया गया. पशु लाइसेंस (ESAVI/2857/04.10.03/2012) स्थानीय प्राधिकरण (ELÄINKOELAUTAKUNTA-एला) से प्राप्त हुई थी. 1-3 महीने की उम्र के वयस्क चूहों, वजन 24-38 ग्राम, प्रमाणित विश्वविद्यालय के पशु सुविधा में व्यक्तिगत पिंजरों में रखा जाता है और भोजन और पानी यथेच्छ के साथ प्रदान किया गया.
1. एक कपाल खिड़की के माध्यम से मस्तिष्क चोट इमेजिंग
- जानवरों anesthetizing और संचालन क्षेत्र तैयारी
- फिल्टर निष्फल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), 7.4 पीएच में भंग ketamine (Ketalar, 80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (Rompun, 10 मिलीग्राम / किग्रा) के एक मिश्रण की पेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize. संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करने के लिए माउस की सजगता नियमित रूप से (पूंछ और पैर के अंगूठे चुटकी जांच) की जाँच करें. जब उचित उचित संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, खुराक में वृद्धि लेकिन overd बचनेOSE.
- संज्ञाहरण से वसूली के बाद शल्यक्रिया, इमेजिंग सत्र और पहले घंटे के दौरान एक हीटिंग पैड का उपयोग कर 37.0 डिग्री सेल्सियस पर पशु बनाए रखें.
- बाहर सुखाने से माउस की आंखों की रक्षा, नेत्र स्नेहक लागू होते हैं.
- सूजन और मस्तिष्क edema कम करने के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा dexamethasone (Rapidexon पशु चिकित्सक, 2 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन.
- पहले या तुरंत सर्जरी के बाद 30 मिनट के लिए ऊपर (Ketoprophene intraperitoneally उदाहरण के लिए,) एक एनाल्जेसिक प्रशासन. पशु ऐसी चाल है, खाने या पीने, या वजन घटाने के लिए अनिच्छा के रूप में किसी भी दर्द के लक्षण, दर्शाती है, लार, piloerection, या असामान्य सांस की सर्जरी के बाद, एनाल्जेसिक इंजेक्शन दोहराने लगता है.
- एक शेविंग मशीन (सामग्री और उपकरण देखें) के साथ माउस 'सिर दाढ़ी. मूंछ हानिकारक से बचने.
- मुंडा क्षेत्र को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल के समाधान के साथ माउस के सिर पर त्वचा का इलाज.
- शल्य कैंची का प्रयोग (सामग्री देख सकते हैं औरउपकरण) और संदंश (सामग्री और उपकरण देखें), माथे के लिए कान के बीच मध्य लाइन से त्वचा में कटौती.
- धीरे से एक कुंद microsurgical ब्लेड के साथ खोपड़ी से जुड़ी संयोजी ऊतक दूर परिमार्जन.
- बग़ल में त्वचा सीमाओं स्लाइड और थोड़ा सिर और त्वचा निर्धारण के लिए खोपड़ी के कर्ण orifices में कान सलाखों खींच.
- बाँझ पीबीएस के साथ खोपड़ी को साफ और 0.5% chlorhexidine digluconate साथ माउस के सिर पर सर्जरी साइट का इलाज है, तो बाँझ कपास swabs और संपीड़ित हवा का एक संयोजन का उपयोग कर खोपड़ी की सतह सूखी.
- चुभन चोट की सज़ा
- एक पशु धारक के साथ एक छोटे जानवर stereotaxic साधन (सामग्री और उपकरण देखते हैं) की स्थिति.
- जानवर खोपड़ी की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अगले stereotaxic साधन के लिए द्विनेत्री माइक्रोस्कोप की स्थिति समायोजित करें.
- एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, खोपड़ी पर पर्वबिन्दु बात का पता लगाने.
- Regio पहचानेंstereotaxic निर्देशांक का उपयोग ब्याज के एन.
नोट: सीधे सतही cortical जहाजों पर स्थित हैं कि ब्याज के उन क्षेत्रों से बचें. इनमें से विनाश जोरदार आघात प्रगति को प्रभावित कर सकते हैं. - चुने हुए क्षेत्र के ऊपर 30 ग्राम सुई की स्थिति और खोपड़ी की सतह scratching द्वारा लक्ष्य साइट निशान.
- प्रभावित हड्डी की सतह क्षेत्र के अनावश्यक चौड़ा करने से बचने के लिए सभी संभव सावधानियों के साथ खोपड़ी ड्रिल. खुर्दबीन के नीचे एक उच्च गति शल्य चिकित्सा ड्रिल (सामग्री और उपकरण देखें) का प्रयोग करें. तरल drilled क्षेत्र में दिखाई देता है अगर ड्रिलिंग बंद करो.
- सुई के साथ drilled अच्छी तरह से नीचे स्पर्श करें.
- चुभन आवेदन साइट के समन्वय के अनुसार 0.5-2.0 मिमी की गहराई तक, मस्तिष्क (सम्मिलन दर 5-10 मिमी / मिनट) में सुचारू रूप से सुई डुबकी.
- तुरंत वांछित गहराई (त्याग दर 5-10 मिमी / मिनट) तक पहुंचने के बाद सुई निकालें और एक छोटे तंपन साथ चुभन के बाद प्रदर्शित होने के खून पोंछने (एसईई सामग्री और उपकरण).
- एक microsyringe पंप (डब्ल्यूपीआई) और 10 μl हैमिल्टन सिरिंज कांच विंदुक के साथ इकट्ठा का उपयोग घाव साइट में 100 माइक्रोन Sulforhodamine 101 के microinjection या ब्याज की एक अन्य मिश्रित प्रदर्शन करना.
नोट: borosilicate ग्लास केशिका से कांच विंदुक की तैयारी के दौरान, 10-20 माइक्रोन की एक व्यास को टिप पैनापन. - 2-5 NL / सेकंड की दर पर इंजेक्शन समाधान के 250-1,500 NL दिखे.
नोट: मस्तिष्क पैरेन्काइमा में कम से कम 5 मिनट के लिए निषेचन के अंत के बाद पिपेट छोड़ दो, तो समाधान बहिर्वाह को रोकने के लिए और धीरे धीरे इसे हटा दें.
- पुरानी कपाल खिड़की के लिए कपाल - उच्छेदन
- चोट स्थल के चारों ओर एक चक्र खिड़की बनाने के लिए धीरे और सावधानी से खोपड़ी ड्रिल. 3-3.5 मिमी की खिड़की व्यास का प्रयोग करें.
- वाई कवर करने के लिए प्रांतस्था बफर की एक बूंद (125 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी ग्लूकोज 10 मिमी HEPES, आसुत एच 2 हे में 2 मिमी 2 CaCl और 2 मिमी MgSO 4) लागू करेंndow.
- कपाल खिड़की पर एक दौर गिलास coverslip (# 1.5 मोटाई) की स्थिति.
- Coverslip के आसपास प्रांतस्था बफर के अतिरिक्त हटा दें.
- Polyacrylic गोंद के साथ coverslip के किनारों को सील (सामग्री और उपकरण देखें).
नोट: गोंद coverslip के ऊपरी सतह पर लागू नहीं है यह सुनिश्चित. कवर कांच गोंद के साथ दूषित है, तो ध्यान से एक microblade साथ contaminating गोंद हटाने, कांच stably खोपड़ी से चिपके होने तक प्रतीक्षा करें और कांच की सतह पर गोंद शुष्क हो जाता है. - 5 मिनट गोंद सूख जाने की प्रतीक्षा करें.
- धातु धारक रखा जा सकता है ताकि कान बार ऊंचाई शिकंजा प्रयोग, सिर स्थिति को समायोजित.
- इस्पात धारक की अंगूठी (सामग्री और उपकरण देखें) पर polyacrylic गोंद की एक छोटी राशि लागू करें.
- पीछे की ओर निर्देशित धातु धारक संभाल के साथ कांच coverslip के लिए स्टील धारक की अंगूठी गोंद.
- 5 मिनट गोंद सूख जाने की प्रतीक्षा करें.
- एमचिपचिपा स्थितियों को प्राप्त करने के लिए एक 3.5 सेमी पेट्री डिश (या एनालॉग) में polyacrylic गोंद के साथ नौवीं दंत सीमेंट (सामग्री और उपकरणों को देखें).
- सीमेंट + गोंद के मिश्रण के साथ कपाल खिड़की की सीमाओं को सील करने और त्वचा सीमा तक एक ही मिश्रण के साथ खोपड़ी के उजागर सतह को कवर किया.
- 15 मिनट सीमेंट + गोंद मिश्रण सूख जाने और फिर कान सलाखों को दूर करने के लिए प्रतीक्षा करें.
- यह प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में ब्याज के क्षेत्र और एक नियंत्रण क्षेत्र के लिए दो photon उत्तेजना सूक्ष्म (TPEM) इमेजिंग प्रदर्शन.
- इमेजिंग के बाद, पशु एक हीटिंग पैड पर संज्ञाहरण से उबरने और पूरी वसूली तक निगरानी में एक व्यक्ति के पिंजरे में रखने के लिए अनुमति देते हैं. गीला भोजन चबाने और जलयोजन की सुविधा के लिए दिया जा सकता है.
2. दिमागी चोट इमेजिंग पतला खोपड़ी के माध्यम से
- जानवरों Anaesthetizing और संचालन क्षेत्र तैयारी
- माउस anesthetize और आघात शामिल होने के लिए तैयार1.1 चरण में वर्णित है.
- खोपड़ी thinning और चुभन चोट की सज़ा
- पशु धारक के साथ एक छोटे जानवर stereotaxic साधन (सामग्री और उपकरणों को देखने) की स्थिति.
- पशु खोपड़ी की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अगले stereotaxic साधन के लिए एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप की स्थिति को समायोजित करें.
- द्विनेत्री माइक्रोस्कोप का उपयोग खोपड़ी पर पर्वबिन्दु बात का पता लगाने, stereotactic निर्देशांक पर आधारित imaged किया जा मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान करने और scratching द्वारा चिह्नित.
नोट: खोपड़ी स्थिरता उन क्षेत्रों में समझौता किया है के रूप में खोपड़ी thinning स्थिति, कपाल टांके के ऊपर या पास में स्थित नहीं किया जाना चाहिए. इसके अलावा, बड़ी cortical या तानिका संबंधी जहाजों और खोपड़ी टांके नीचे स्थित तानिका इमेजिंग कलाकृतियों के कारण होने की संभावना है. - जानवर की खोपड़ी पर ब्याज का क्षेत्र पर गोंद के साथ लेपित धातु धारक, जगह प्रकाश दबाव लागू और धातु धारक मजबूती से खोपड़ी से चिपके होने तक 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. चिपचिपा स्थितियों को प्राप्त करने के लिए एक 3.5 सेमी पेट्री डिश (या एनालॉग) में polyacrylic गोंद के साथ दंत सीमेंट (सामग्री और उपकरणों को देखें) मिलाएं.
- सीमेंट + गोंद के मिश्रण के साथ धातु धारक की सीमाओं को सील करने और त्वचा सीमा तक एक ही मिश्रण के साथ खोपड़ी के उजागर सतह को कवर किया.
- 15 मिनट सीमेंट और गोंद मिश्रण सूख जाने की प्रतीक्षा करें.
- Nonpolymerized गोंद के अवशेष धुल रहे हैं, ताकि पतला खोपड़ी क्षेत्र और पीबीएस के साथ धातु धारक के आसपास के कुछ हिस्सों में कई बार कुल्ला.
नोट: यह धारक को खोपड़ी के स्थिर लगाव सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह इमेजिंग के दौरान तैयारी स्थिरता सक्षम बनाता है. - द्विनेत्री माइक्रोस्कोप की उच्च वृद्धि मोड का उपयोग करना, व्यास में ~ 0.5-1.5 मिमी की एक पतला खोपड़ी क्षेत्र बनाने के लिए एक उच्च गति सूक्ष्म ड्रिल के साथ खोपड़ी की हड्डी के ऊपरी परतों को हटा दें. हड्डी मलबा हटाने के लिए ड्रिलिंग के दौरान संपीड़ित हवा का उपयोग करें. ड्रिलिंग intermittentl प्रदर्शन करनाघर्षण प्रेरित overheating से बचने के क्रम में thinning प्रक्रिया के दौरान वाई. कमरे के तापमान समाधान का उपयोग ड्रिल बिट कूल और समय - समय गर्मी अवशोषित करने के लिए पतला क्षेत्र को बफर लागू होते हैं.
नोट: प्रांतस्था को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, एक पतली परत (<50 माइक्रोन) के लिए नीचे बड़े क्षेत्रों (> 1.5 मिमी) से अधिक ड्रिल नहीं है.
नोट: कृंतक खोपड़ी की हड्डी संरचना स्पंजी हड्डी की एक मोटी परत से अलग कॉम्पैक्ट हड्डी की दो पतली परत के होते हैं. रक्त वाहिकाओं के होते हैं जो चिमड़ा हड्डी फार्म गाढ़ा हलकों और canaliculi, की टिनी cavities. बाहरी कॉम्पैक्ट हड्डी परत और स्पंजी परत की सबसे दोनों दूर करने के लिए microdrill का प्रयोग करें. चिमड़ा हड्डी के भीतर रक्त वाहिकाओं के विघटन खून बह रहा हो सकता है. इस रक्तस्राव को रोकने के लिए रक्तस्तम्भन कोलेजन स्पंज का प्रयोग करें. - चिमड़ा हड्डी के बहुमत निकाल दिया गया है कि क्या जांच करने के लिए दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग का प्रयोग करें. शेष हड्डी वीं है, सुनिश्चित करें कि अत्यधिक thinning से बचने के लिए सावधान रहेंतैयारी के इस स्तर पर 50 माइक्रोन से icker.
- पतला क्षेत्र के शीर्ष पर गर्म बफर की एक बूंद (35-37 डिग्री सेल्सियस) रखो. आगे हड्डी परतों को हटाने और ~ 20 माइक्रोन से हड्डी मोटाई के साथ व्यास में ~ 700 माइक्रोन के एक चिकनी क्षेत्र के लिए फार्म बर फिनिशिंग एक microsurgical ब्लेड या माइक्रो प्रयोग करें. इस चरण के दौरान, यह दोहराव एसएचजी इमेजिंग प्रदर्शन और नियमित रूप से हड्डी मोटाई मापने के लिए उपयोगी है.
- ब्याज के क्षेत्र और एक नियंत्रण क्षेत्र के लिए TPEM इमेजिंग प्रदर्शन.
- क्षेत्र कड़ाई क्षैतिज तैनात है thinned है कि इस तरह से कान बार ऊंचाई शिकंजा का उपयोग कर सिर की स्थिति को समायोजित करें. पतला क्षेत्र से ऊपर सुई की स्थिति और लक्षित साइट के नीचे कोई बड़े जहाजों कि वहाँ रहे हैं सुनिश्चित करें.
- पतला खोपड़ी की सतह से 0.5-2.0 मिमी की गहराई तक, मस्तिष्क में सुई की सूई और चुभन आवेदन साइट के समन्वय के अनुसार द्वारा एक घाव बनाओ.
- सुई निकालें और टी के बाद प्रदर्शित होने नकसीर को दबानेवह hemostatic तंपन (सामग्री और उपकरणों को देखें) के साथ मस्तिष्क की चोट के तीव्र. चोट स्थल पर खून के थक्के फार्म और पोत धड़कन बंद हो जाता है जब तक प्रतीक्षा करें.
- अनुभाग 1.2.10 में ऊपर वर्णित है, 100 माइक्रोन Sulforhodamine 101 या घाव साइट में ब्याज की एक और परिसर के microinjection प्रदर्शन करना.
- प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में चोट प्रगति और वसूली पर नजर रखने के लिए TPEM इमेजिंग प्रदर्शन.
- इमेजिंग के बाद, पशु एक हीटिंग पैड पर संज्ञाहरण से होश में आने के लिए अनुमति देते हैं. नायाब जानवर छोड़ने के लिए और केवल पूर्ण शारीरिक वसूली के बाद अपने घर पिंजरे में इसे वापस नहीं करते.
3. इमेजिंग
- कस्टम बनाया फ्रेम करने के लिए धातु धारक संलग्न द्वारा खुर्दबीन के नीचे पशु रखें.
- इमेजिंग के लिए, माई ताई DeepSee लेजर और vivo में दो photon के लिए अनुकूलित XLPLN 25x 1.05 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य से लैस जैसे FV1000MPE दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोगइमेजिंग.
- व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति मोड का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे घाव साइट की पहचान. मस्तिष्क vasculature कल्पना और रक्त वाहिकाओं का मनाया पैटर्न के अनुसार नियंत्रण क्षेत्र का चयन करने के लिए लंबे पास फिल्टर का प्रयोग करें.
- छवि के लिए दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) संकेत, 800 एनएम तरंगदैर्ध्य को धुन femtosecond लेजर और 380-410 एनएम बाईपास फिल्टर का उपयोग उत्सर्जित प्रकाश इकट्ठा. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, उत्सर्जित प्रकाश इकट्ठा करने के लिए बैंड पास फिल्टर (515-560 एनएम) का उपयोग करें, और निम्न तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: GFP-860 एनएम, YFP-950 एनएम.
- छवि अधिग्रहण के लिए FluoView सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
- स्टोर बाद दोहराव इमेजिंग के लिए हर रॉय के निर्देशांक. छवि समय पर एक ही ROIs, और निर्देशांक छवि ओवरलैप को अधिकतम करने के लिए हर समय समायोजित करें.
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे. ImageJ) के साथ छवियों का विश्लेषण. यहाँ प्रस्तुत पुनर्निर्माण Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया.
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Representative Results
ट्रांसजेनिक चूहों में posttraumatic ब्रेन इमेजिंग के लिए 1) पुरानी कपाल खिड़की और 2) खोपड़ी thinning,: हम दो आपरेशन प्रक्रियाओं अनुकूलित है. प्रयोगात्मक तैयारी योजनाबद्ध चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. 0.3 मिमी आयुध डिपो (30 ग्राम) की स्टील सुई से दर्दनाक चुभन drilled अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए) के लिए आवेदन किया है. खोपड़ी thinning लगभग 300 माइक्रोन (चित्रा 1C) की एक सीमा लागू करने के लिए जाता है, जबकि एक सफल कपाल खिड़की तैयारी Thy1-YFP के 3D पुनर्निर्माण में प्रदर्शन के रूप में, pial सतह (चित्रा 1 बी) के नीचे 650 मीटर अप करने के लिए गहराई में इमेजिंग की अनुमति देता है एच माउस cortical पिरामिड न्यूरॉन्स.
मस्तिष्क प्रांतस्था का एक नियंत्रित मात्रा में डेन्ड्राइट और केशिका नेटवर्क के विनाश के उन्मूलन में चुभन आघात का परिणाम है. पहले दो दिनों के दौरान, घाव क्षेत्र में वृद्धि हुई है और आघात प्रेरित डेन्ड्राइट blebbing और वृक्ष के समान त्याग बी का गठनperilesion क्षेत्रों में शहरी स्थानीय निकायों, विवो माइक्रोस्कोपी multiphoton में (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए मनाया.
हम तुरंत चोट (चित्रा 3) के बाद छवि सक्रियण और CX3CR1-EGFP चूहों में microglia के प्रवास को thinning खोपड़ी प्रदर्शन किया. एसएचजी इमेजिंग ठीक चोट साइट (3B चित्रा) चित्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है. एसएचजी संकेत है कि उत्पादन बाह्य मैट्रिक्स अणुओं बहुत चुभन आघात पर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में समृद्ध है. सबसे पहले, ठीक microglial प्रक्रियाओं तो microglial कोशिकाओं चोट साइट (चित्रा 3) की सीमा की ओर पलायन, प्राप्त कर रहे हैं.
पतली कांच विंदुक प्रविष्टि और डाई का वितरण द्वारा प्रेरित संभावित चोटों का अनुमान है, हम vivo में मस्तिष्क आघात के बिना Thy1-YFP-एच चूहों में Sulforhodamine 101 microinjection के साथ दो photon माइक्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन. 4 चित्र में दिखाया छवियों प्रतिनिधि मील का प्रदर्शनइंजेक्शन के बाद croinjection साइट 3 घंटा. पिपेट प्रविष्टि के निशान एसएचजी (चित्रा -4 ए) द्वारा कल्पना मस्तिष्क तानिका में देखा जा सकता है. Astrocytes इंजेक्शन (चित्रा 4 बी) द्वारा शुरू की Sulphorhodamine 101 के साथ लेबल रहे हैं. Thy1 प्रमोटर के तहत YFP व्यक्त डेन्ड्राइट blebbing या त्याग बल्ब की तरह चोट के किसी भी रूपात्मक संकेत (चित्रा 4 सी) का प्रदर्शन नहीं करते.
चित्रा 1. कपाल खिड़की या vivo में दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त पतली खोपड़ी तैयारी के साथ संयोजन में तीव्र मस्तिष्क की चोट की विधि. 0.3mm आयुध डिपो (30g) के स्टील सुई से एक. दर्दनाक चुभन अच्छी तरह से drilled के लिए आवेदन किया. सुई संक्षेप में अच्छी तरह से नीचे से गहरी मस्तिष्क 0.5-2 मिमी में डूब जाता है. बी, सी (सी). डी में दिखाया गया है. तुरंत तीव्र मस्तिष्क की चोट. ई के बाद कांच की खिड़की के माध्यम से सतही रक्त वाहिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र देखें. चोट आवेदन से पहले खोपड़ी thinned. ब्याज (सफेद फ्रेम) और चुभन आवेदन साइट (लाल वृत्त) के चुने हुए क्षेत्र. पतला क्षेत्र की एक अलग क्षेत्र (लाल फ्रेम) संभव सर्जरी प्रेरित कलाकृतियों की निगरानी के लिए imaged किया जाना चाहिए.
पतला खोपड़ी के माध्यम से मस्तिष्क आघात विकास के अनुदैर्ध्य multiphoton इमेजिंग के चित्रा 2. उदाहरण. एक. करने के लिएcortical न्यूरॉन्स 20 मिनट आघात सज़ा के बाद, पतला खोपड़ी तैयारी के माध्यम से imaged के रूप में. बी के YFP लेबल डेन्ड्राइट से घिरे चोट साइट के पी देखें. पैनल में उल्लिखित क्षेत्र के आवर्धित दृश्य. सी. बी के रूप में मस्तिष्क के एक ही क्षेत्र, 5 दिन आघात के बाद reimaged. लाल तीर के साथ - dendrite blebbing सफेद तीर, वृक्ष के समान त्याग बल्ब के साथ दिखाया गया है.
चित्रा 3. Vivo में multiphoton इमेजिंग जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, रंग, और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी संकेत के लिए उपयुक्त अलग मार्कर का उपयोग कर मस्तिष्क आघात के विकास के दौरान निगरानी सूजन और glia सक्रियण के उदाहरण हैं. छवियों मस्तिष्क की चोट के बाद 3 घंटा हासिल किया गया.
एक गिलास micropipette के माध्यम से समाधान इंजेक्शन द्वारा किए गए ऊतक प्रभाव की चित्रा 4. परीक्षा. एक. एक ट्रेस (थानेदारएसएचजी इंजेक्शन. बी के बाद मस्तिष्क तानिका 3 घंटा visualizing में धराशायी लाइन) के साथ wn. इंजेक्शन द्वारा शुरू sulphorhodamine साथ लेबल astrocytes. सी. Thy1 प्रमोटर के तहत YFP व्यक्त डेन्ड्राइट. डी. एक (एसएचजी - ग्रे) की संयुक्त छवि, बी (astrocytes - लाल), सी (neuronal डेन्ड्राइट - पीला).
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Discussion
मस्तिष्क आघात एक अचानक, अप्रत्याशित घटना है. यहां हम ऐसे neurodegeneration, डेन्ड्राइट के उन्मूलन, मस्तिष्क शोफ, glial निशान, फोकल subarachnoid ख़ून का बहाव साथ युग्मित सेरेब्रल कॉर्टेक्स में हेमोरेज और की वृद्धि की पारगम्यता के रूप में मस्तिष्क की चोट के बाद मानव रोगियों में मनाया रोग परिवर्तन की एक स्पेक्ट्रम कि reproduces पशु मॉडल वर्णन रक्त मस्तिष्क बाधा. प्राथमिक और माध्यमिक रोगजनन, साथ ही आघात के बाद वसूली का अध्ययन करने के लिए, इस चोट मॉडल ठीक neuronal और glial संरचनाओं के विवो दृश्य में अनुदैर्ध्य साथ जोड़ दिया गया था. ट्रांसजेनिक माउस लाइनों (Thy1, YFP-एच) 7, astrocytes (GFAP, EGFP) 8 न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, या microglia (CX3CR1, EGFP) 9 कि इस्तेमाल किया गया. इसके अतिरिक्त, हम Sulfarhodamine 101 10 के साथ दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग और astrocyte लोड हो रहा है इस्तेमाल किया.
यहाँ वर्णित मॉडल Pene स्मरण दिलाता हैमस्तिष्क की चोट के trating प्रकार. इसलिए वर्तमान मॉडल की एक सीमा है कि यह बंद सिर पर चोट के तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है. हाल ही में तलवार और coauthors pericontusional प्रांतस्था 6 में सेल व्यवहार पर multiphoton इमेजिंग परिणामों की सूचना दी. सिर पर चोट बंद खाते में ले कि एक अधिक लगातार चिकित्सा मामला है, लेखकों द्वारा रिपोर्ट methodological दृष्टिकोण अत्यधिक प्रभाव मस्तिष्क आघात 11 के क्षेत्र में पारंपरिक अनुसंधान विधियों के पूरक का वादा किया है.
हम पुरानी कपाल खिड़की 12 और मस्तिष्क में रहने वाले posttraumatic परिस्थितियों में सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए 13 तैयारियों thinning खोपड़ी दोनों का इस्तेमाल किया. दोनों तरीकों कुछ फायदे और सीमाएं हैं. इस प्रकार, पुरानी कपाल खिड़की बेहतर संकल्प, मस्तिष्क के ऊतकों और कई इमेजिंग सत्र के लिए सुविधा में गहरी ऑप्टिकल प्रवेश प्रदान करता है. इसके विपरीत, खोपड़ी thinning वीं में सूजन पैदा होने की संभावना कम हैशायद अधिक महत्वपूर्ण बात ई इमेजिंग साइट, और, यह दवाओं और रंगों का दोहराव अनुप्रयोगों की अनुमति देता है. प्रयोगों के इस प्रकार में लागू करने के लिए औषधीय एजेंटों के कुछ उदाहरण 1 टेबल में दिए गए हैं.
| एजेंट प्रकार | इंजेक्शन एजेंट | जीव विज्ञान / फार्मेसी अनुसंधान के क्षेत्रों |
| विरोधी भड़काऊ | Cyclosporin एक | घाव मस्तिष्क चोट, माध्यमिक क्षति, neurodegeneration |
| विषाक्त पदार्थों | Tetrodotoxin | TBI - माध्यमिक क्षति, excytotoxicity |
| Bicuculline | TBI - माध्यमिक क्षति, क्लोराइड होमियोस्टेसिस | |
| रास्ते संकेतन के Inhibitors | PD98059 (MAPKK अवरोध करनेवाला) | सूजन, माध्यमिक क्षति, posttraumatic कोशिका मृत्यु, neurodegeneration और उत्थान के तंत्र संकेत |
| SU6656 (एसआरसी परिवार kinase अवरोध) | ||
| Neurotrophic कारकों | मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक, BDNF | TBI - neuronal अस्तित्व माध्यमिक posttraumatic मस्तिष्क क्षति में चोट, neuroprotection के बाद |
| वायरस | प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए lentiviral वैक्टर | posttraumatic neurodegeneration और उत्थान के आणविक तंत्र, vivo इमेजिंग के लिए क्षतिग्रस्त मस्तिष्क में सेल प्रकार का अंतर लेबलिंग |
| प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए adenoviral वैक्टर | ||
| सीए 2 + फ्लोरोसेंट संकेतक | Fluo-2, 4 | posttraumatic सूजन के तंत्र संकेत, कोशिका मृत्यु, सेल प्रवास, axonal / वृक्ष के समान उत्थान |
तालिका 1. चुभन चोट मॉडल में cortical इंजेक्शन के लिए औषधीय एजेंटों और रंजक.
शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं कि जैव रासायनिक घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला वायरल निर्माणों के माध्यम से शुरू की रासायनिक inhibitors, फ्लोरोसेंट संकेतकों और उत्परिवर्ती प्रोटीन के साथ जांच की जा सकती. खोपड़ी thinning तैयारी द्वारा प्रदान की खास समय खिड़की को चुनने के लिए लाभ उन अध्ययनों के लिए अत्यधिक प्रासंगिक हो सकता.
अध्ययन में मौजूद है, हम चोट साइट चित्रित करने के लिए दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी संकेत इस्तेमाल किया. दूसरा तरीका, चोट साइट सीमाओं उदाहरण एक उच्च आणविक भार dextran फ्लोरोसेंट संयुग्म (2 मिलियन डाल्टन) के लिए, एक कमजोर diffusing फ्लोरोसेंट डाई ने संकेत दिया जा सकता.
हाल ही में, Schaffer और उनके सहयोगियों ने 14 एक पुरानी तैयारी का इस्तेमाल किया हैमाउस प्रांतस्था फ्लोरोसेंट रंगों का दोहराव वितरण के लिए reopenable कपाल खिड़की के साथ. यह कपाल खिड़की दोबारा खोलने पर प्रतिकूल मस्तिष्क के ऊतकों पारदर्शिता को प्रभावित कर सकता है कि संभावना है. इसके अलावा, यह संयोजी ऊतक regrowth को प्रभावित कर सकता है, जो फिर से खोलने प्रेरित सूजन, के समय के पाठ्यक्रम की भविष्यवाणी करना मुश्किल है.
पतला खोपड़ी तैयारी का एक प्रमुख लाभ चिकित्सकीय यौगिकों (और मस्तिष्क के ऊतकों में सामयिक इंजेक्शन की आवश्यकता होती है अन्य सामग्री) (दोबारा खोलने कपाल खिड़की के बिना उदाहरण के लिए) कलाकृतियों उलझी बिना, आघात की प्रगति के दौरान कई बार देने के लिए संभावना है.
सीधे चोट साइट को दोहराए यौगिक वितरण वांछित है, एक खोपड़ी सूखी बाहर और बैक्टीरिया के संक्रमण को रोकने के लिए विशेष अर्थ पर विचार करना चाहिए. इस प्रकार, बाँझ शर्तों और (जैसे Enrofloxacin) के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं के आवेदन के तहत संचालित सिर क्षेत्र रखने की सिफारिश की है. टी संरक्षित करने के लिएसुखाने से खोपड़ी क्षेत्र hinned, 1.5% agarose के साथ धातु धारक को भरने और दौर गिलास coverslip के साथ कवर. ज्यादातर मामलों में यह करने के लिए 10 दिनों की अवधि में एक ही पारदर्शिता या पतला खोपड़ी को बनाए रखने की अनुमति होगी. पतला खोपड़ी तैयारी में कई इमेजिंग सत्र समय की एक लम्बी अवधि में योजना बनाई है, तो कुछ अतिरिक्त लिया जाना चाहिए. इसके तत्काल बाद प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले, धीरे से एक microsurgical ब्लेड का उपयोग कर thinned क्षेत्र से नवगठित संयोजी ऊतक को हटा दें. छवि गुणवत्ता और उपाय हड्डी मोटाई सत्यापित करने के लिए स्वयं सहायता समूह की TPEM इमेजिंग का प्रयोग करें. ऊतक regrowth पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में वृद्धि के साथ धुंधला प्रवेश गहराई और कारण छवि समझौता हो सकता है. उच्च गुणवत्ता इमेजिंग हासिल करने के लिए एक microsurgical ब्लेड के साथ धीरे thinning खोपड़ी को ताज़ा करें.
चोट साइट तक सीधी पहुंच की आवश्यकता नहीं है कि उन मामलों में, हम अत्यधिक एक गिलास coversli साथ खोपड़ी का पतला क्षेत्र को कवर करने की सिफारिशपॉलिश और प्रबलित पर कागज में वर्णित के रूप में पी Kleinfeld और उनके सहयोगियों ने 15 से खोपड़ी तैयारी thinned. यह निम्न वैकल्पिक प्रक्रिया का उपयोग करके किया जा सकता है. , पतला खोपड़ी क्षेत्र पर agarose की एक छोटी सी बूंद (1.5%) जगह यह एक जेल हो जाता है जब तक प्रतीक्षा करें, सभी अनावश्यक agarose हटाने, यानी केवल चोट साइट पर छोड़ दें. Agarose बाहरी प्रभाव से चोट साइट की रक्षा करनी चाहिए. संपीड़ित हवा का उपयोग पतला खोपड़ी क्षेत्र सूखी. # 0 coverglass के एक छोटे से टुकड़े पर polyacrylic गोंद की एक छोटी राशि ड्रॉप और पतला खोपड़ी क्षेत्र पर जगह है. polyacrylic गोंद इस प्रकार संरक्षित खिड़की के नीचे पतला खोपड़ी रखने, हड्डी और संयोजी ऊतक regrowth रोकता है.
इन प्रक्रियाओं का एक संयोजन, तीव्र और जीर्ण posttraumatic प्रक्रियाओं का अध्ययन topically या प्रणालीबद्ध दवाओं देने और सीधे उपचार के प्रभाव की निगरानी की अनुमति देता है. दोहरी या तिहरी ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का प्रयोग भी लाभकारी, गड्ड किया जा सकता हैऐसे glial निशान गठन और neuronal शाखा regrowth के रूप में कई posttraumatic प्रक्रियाओं, के साथ इमेजिंग के लिए cularly. हम तीव्र मस्तिष्क की चोट के हमारे मॉडल दवा उम्मीदवार के परीक्षण के लिए उपयोगी साबित करने के लिए intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ अध्ययन की उम्मीद है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम GFAP-EGFP और CX3CR1-EGFP माउस उपभेदों प्रदान करने के लिए डॉ. फ्रैंक Kirchhoff को गहराई से आभारी हैं. काम फिनलैंड के अंतर्राष्ट्रीय गतिशीलता का केंद्र, Tekes, तंत्रिका विज्ञान फिनिश ग्रेजुएट स्कूल (FGSN) और फिनलैंड के अकादमी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
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