Summary
Острая травма мозга является тяжелая травма, которая не имеет адекватного лечения на сегодняшний день. Многофотонная микроскопия позволяет изучать продольно процесс острого развития мозга при травмах и зондирования терапевтические стратегии у грызунов. Две модели острой травмы мозга учился с в естественных условиях двухфотонного визуализации мозга показали в этом протоколе.
Abstract
Хотя острая травма мозга часто является результатом повреждения головы в различных аварий и затрагивает значительную часть населения, не существует эффективного лечения для нее еще. Ограничения используемых в настоящее время моделях животных препятствуют пониманию механизма патологии. Многофотонная микроскопия позволяет изучать клетки и ткани в пределах неповрежденных мозгах животных продольно в физиологических и патологических состояниях. Здесь мы описываем две модели острой черепно-мозговой травмой, изучаемая с помощью двухфотонного визуализации поведения клеток мозга под посттравматических условиях. Выбран регион мозг травмирован с острой иглой для получения травму контролируемой шириной и глубиной в паренхимы мозга. Наш метод использует стереотаксической укол иглой шприца, который может быть в сочетании с одновременным применением наркотиков. Мы полагаем, что этот метод может быть использован как усовершенствованный инструмент для исследования клеточные механизмы патофизиологических последствий острой травмы в мозге млекопитающих
Introduction
Острая черепно-мозговая травма является серьезной проблемой общественного здравоохранения с высоким уровнем травмы в дорожно-транспортных происшествий, падений или нападения, и высокая распространенность последующей хронической инвалидности. Терапевтические подходы к лечению черепно-мозговой травмы остаются полностью симптоматическое, что ограничивает эффективность догоспитальном, хирургического и реанимационного. Это делает социальные и экономические последствия черепно-мозговой травмы, особенно тяжелой. По разным причинам, большинство клинических испытаний не смогли продемонстрировать улучшение восстановления после травмы головного мозга с использованием новых терапевтических подходов.
Животные модели имеют решающее значение для разработки новых терапевтических стратегий к той стадии, когда эффективность препарата может быть предсказано у больных с черепно-мозговыми травмами. В настоящее время несколько хорошо организованной животные модели травмы головы существуют, в том числе управляемой корковой воздействия 1, жидкости ударных травмы 2, динамической корковой деформации 3, вес-капли4 и 5 фото травмы. Ряд экспериментальных моделях были использованы для изучения некоторых морфологических, молекулярные и поведенческие аспекты травмы головы связанных патологии. Тем не менее, ни одна модель животное не удалось в полной оценки новых терапевтических стратегий. Разработка надежных, воспроизводимых и контролируемых животных моделях черепно-мозговой травмой необходимо оценить сложные патологические процессы.
Роман сочетание новейших микроскопических технологии визуализации и генетически закодированных люминесцентных журналистами предлагает беспрецедентную возможность изучить все этапы мозговой травмы, которые включают основную травмы, распространение первичной травмы, вторичного повреждения и регенерации. В частности, в естественных условиях двухфотонного микроскопия является уникальным нелинейный оптический технология, которая позволяет в режиме реального времени визуализации клеточных и субклеточных структур даже в глубоких слоях коры мозга грызунов. Несколько типов клеток и оргаNelles могут быть отображены одновременно, комбинируя различные флуоресцентные маркеры. С помощью этого мощного инструмента, мы можем представить себе динамические морфологические и функциональные изменения в живой мозг под посттравматических условиях. Преимущества в естественных условиях двухфотонного микроскопии в изучении травму головного мозга были недавно продемонстрировано Кирова и коллег 6. Использование мягкий фокусное корковой модель ушиб, эти авторы показали, что острая дендритных травмы в pericontusional коры закрытого в связи с сокращением местного кровотока. Кроме того, они показали, что метаболически нарушена кора вокруг ушиба сайта дополнительно повреждены в результате распространения деполяризации. Это вторичное повреждение влияет синаптическую схемы, что делает последствия черепно-мозговой травмы более серьезными.
Здесь мы предлагаем метод стереотаксической укола иглой шприца, который может быть в сочетании с одновременным местного применения наркотиков, как передовые модели для местного мозгатравмы и в качестве инструмента для изучения патофизиологических последствий острой травмы в мозге млекопитающих в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, представленные здесь, были выполнены в соответствии с местным руководством для ухода за животными (Финский закон о экспериментов на животных 62/2006). Лицензия животных (ESAVI/2857/04.10.03/2012) получали из местной власти (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Взрослый мышей 1-3 месяцев возраста, веса 24-38 г, держали в отдельных клетках в сертифицированной вивария университета и обеспечены питанием и воде.
1. Травмы головного мозга изображения через черепной Window
- Обезболивающий животных и подготовки поля операции
- Обезболить мышей путем перитонеального инъекции смеси кетамина (Ketalar, 80 мг / кг) и ксилазина (Rompun, 10 мг / кг), растворенного в стерилизованным фильтрацией фосфатного буфера солевым раствором (PBS), рН 7,4. Проверьте рефлексы мыши регулярно (хвост и носок щепотку зонда) для проверки глубины анестезии. Увеличение дозы при необходимости, для поддержания нормальной анестезии, но избежать overdOSE.
- Поддерживать животное в 37,0 ° С с использованием грелку во время хирургического вмешательства, изображений сессии и первого часа после выхода из наркоза.
- Чтобы защитить глаза мыши от высыхания, нанесите глаз смазку.
- Администрирование дексаметазон (Rapidexon ветеринар, 2 мг / кг) подкожной инъекцией для уменьшения воспаления и отека мозга.
- Администрирование анальгетик (Например, Ketoprophene внутрибрюшинно) до 30 мин до или сразу же после операции. Если животное проявляет никаких симптомов боли, такие как нежелание двигаться, есть или пить, или потеря веса, слюнотечение, пилоэрекция, или ненормальные дыхания звучит после операции, повторить инъекцию обезболивающего.
- Бритье мыши 'головой с бритья машины (см. материалы и оборудование). Избегайте повреждения усы.
- Treat кожу на голове мыши с 70%-ным раствором этанола, чтобы очистить выбритый участок.
- Использование хирургические ножницы (см. Материалы иОборудование) и щипцы (см. материалы и оборудование), разрезать кожу от средней линии между ушами к лбу.
- Аккуратно соскрести соединительной ткани, прикрепленный к черепу с тупым микрохирургической лезвия.
- Слайд границы кожи в сторону и потяните ушные бары немного в слуховых отверстий черепа для головы и фиксации кожи.
- Очистка череп стерильной PBS и лечения хирургии сайт на голове мыши с 0,5% диглюконат хлоргексидина, затем высушить поверхность черепа с использованием комбинации стерильным ватным тампоном и сжатого воздуха.
- Причинение травмы укола
- Установите небольшую животных стереотаксической инструмент с держателем животных (см. материалы и оборудование).
- Отрегулируйте положение бинокуляром рядом с стереотаксической инструмента, чтобы сосредоточиться на поверхности черепа животного.
- Использование бинокулярный микроскоп, найти точку брегмы на черепе.
- Определить регион интерес с помощью стереотаксической координаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте тех областях, представляющих интерес, которые непосредственно расположенных над поверхностных корковых сосудов. Уничтожение они могут сильно повлиять на прогрессирование травмы. - Расположите G иглу над выбранной области 30 и отметьте целевой сайт, царапая поверхность черепа.
- Дрель череп со всеми возможными предосторожностями, чтобы избежать ненужного расширение пораженного участка поверхности кости. Используйте высокоскоростной хирургической дрели (см. материалы и оборудование) под микроскопом. Остановите бурение, если жидкость появляется в пробуренной области.
- Прикоснитесь к нижней части пробуренной скважины с иглой.
- Dip иглу плавно переходит в мозге (скорость введения 5-10 мм / мин), на глубину 0,5-2,0 мм в соответствии с координатами месте применения укола.
- Удалите иглу сразу после достижения требуемой глубины (скорость отвода 5-10 мм / мин) и вытирать кровь, появляющееся после укола с небольшим тампоном (SEе Материалы и оборудование).
- Выполните микроинъекции 100 мкМ сульфородамина 101 или другой интерес соединение в месте повреждения с помощью микрошприца насос (WPI) и 10 мкл Hamilton шприц собрать со стеклянной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время подготовки стеклянной пипетки из боросиликатного стекла капилляра, резкость наконечник диаметром до 10-20 мкм. - Наполните 250-1,500 NL раствора для инъекций из расчета 2-5 л / сек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте пипетку после окончания инфузии в течение не менее 5 мин в паренхимы мозга, затем удалить его медленно и осторожно, чтобы предотвратить отток решение.
- Краниотомия хронического черепной окне
- Дрель череп аккуратно и осторожно, чтобы сделать окно круг вокруг места повреждения. Используйте диаметр окна из 3-3,5 мм.
- Нанесите каплю коры буфера (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl 2 и 2 мМ MgSO 4 в дистиллированной H 2 O), чтобы покрыть Window.
- Установите круглую стеклянную покровное (# 1.5 толщина) на черепной окна.
- Удалить избыток коры буфера вокруг покровного стекла.
- Печать края покровного стекла с полиакриловой клея (см. материалы и оборудование).
Примечание: Убедитесь, что клей не применяется к верхней поверхности покровного стекла. Если крышка стекло загрязняется с клеем, подождите, пока стекло не будет стабильно приклеены к черепу и клей на стеклянной поверхности становится сухой, затем осторожно снимите загрязняющих клей с MicroBlade. - Подождите 5 мин, чтобы клей высохнет.
- Использование винтов ухо бар высоты, отрегулируйте положение головы так, чтобы держатель металла могут быть размещены.
- Нанесите небольшое количество полиакриловой клея на кольце держателя стали (см. материалы и оборудование).
- Клей кольцо держателя стали на стекло покровное с металлического держателя ручки были направлены назад.
- Подождите 5 минут, чтобы позволить клей высохнет.
- МIX стоматологического цемента (см. Материалы и оборудование) с полиакриловой клея в блюде 3,5 см Петри (или аналог) для достижения вязких условия.
- Уплотнение границы черепа окна с цемент + клеевой смеси и самого открытую поверхность черепа с той же смеси до границы кожи.
- Подождите 15 минут, чтобы цемент + клей смесь высохнет, а затем удалить уха баров.
- Выполните микроскопические возбуждения (TPEM) изображений двухфотонного для интересующей области и области управления, как это описано в Протоколе 3.
- После обработки изображений, позволяют животному оправиться от наркоза на грелку и держать его в индивидуальную клетку под наблюдением до полного выздоровления. Влажные корма можно давать для облегчения жевания и увлажнение.
2. Травмы головного мозга изображений Через разбавлять черепа
- Обезболивания животных и подготовки поля операции
- Обезболить мышь и подготовить его к индукции травмыкак описано на стадии 1.1.
- Череп истончение и причинение травмы укола
- Установите небольшую животных стереотаксической инструмент с держателя животного (см. Материалы и оборудование).
- Отрегулируйте положение бинокуляром рядом с стереотаксической инструмента, чтобы сосредоточиться на черепа поверхности животного.
- Найдите точку брегмы на черепе с помощью бинокулярного микроскопа, определить область мозга для включения в образ на основе стереотаксической координат и отметьте его, царапая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Череп истончение позиция не должна быть расположена над или поблизости черепных швов, как стабильность череп находится под угрозой в этих областях. Кроме того, крупные корковых или менингеальных сосудов и мозговых оболочек, расположенные ниже черепа швов, вероятно, привести к появлению артефактов визуализации. - Поместите держатель металла, покрытого клеем на площади процентов на черепе животного, с помощью легкого нажатия и подождите 5 минут, пока металлический держатель не будет прочно приклеены к черепу. Смешайте стоматологического цемента (см. материалов и оборудования) с полиакриловой клея в 3,5 см чашку Петри (или аналог) для достижения вязких условия.
- Уплотнение границы металлическом держателе с цемент + клеевой смеси и самого открытую поверхность черепа с той же смеси до границы кожи.
- Подождите 15 минут, чтобы цемент и клей смесь высохнет.
- Промойте утонченную область черепа и окружающие части металлического держателя несколько раз PBS, так что остатки неполимеризованной клея смываются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно обеспечить стабильное прикрепление черепа с держателем. Это позволяет стабильность препарата в течение визуализации. - Используя высокую режим увеличения в бинокулярный микроскоп, удалить верхние слои кости черепа с высокоскоростным микро-дрель, чтобы создать более тонкую область черепа ~ 0,5-1,5 мм в диаметре. Используйте сжатый воздух в процессе бурения для удаления костной стружки. Выполните бурения intermittentlY во время процедуры прореживания во избежание трения, вызванных перегрева. Охлаждают сверло с использованием раствора комнатной температуры и периодически применять буфер для утонченной зоны для поглощения тепла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание повреждения коры головного мозга, не сверлить более крупные регионы (> 1,5 мм) до тонким слоем (<50 мкм).
ВНИМАНИЕ: структура кости черепа грызунов состоит из двух тонких слоев компактной кости, разделенных толстым слоем губчатой кости. Крошечные полости губчатого формы кости концентрических кругов и канальцев, в которых содержатся кровеносные сосуды. Используйте microdrill удалить как внешний слой компактной кости и большую часть губчатого слоя. Разрушение кровеносных сосудов внутри губчатой кости может вызвать кровотечение. Используйте гемостаза коллагеновой губки, чтобы остановить это кровотечение. - Используйте генерация второй гармоники (ГВГ) воображение для того чтобы изучить вопрос был снят большинство губчатой кости. Будьте осторожны, чтобы избежать чрезмерного истончение, убедитесь, что оставшиеся кости йicker чем 50 мкм на данном этапе подготовки.
- Поместите каплю теплого буфера (35-37 ° С) в верхней части разбавленной области. Используйте микрохирургической лезвия или Micro Отделочные Bur для дальнейшего удаления слоев кости и образуют гладкое площадь ~ 700 мкм в диаметре с толщиной костной ~ 20 мкм. На этом этапе, это полезно для выполнения повторяющихся изображений SHG и регулярно измерять толщину костей.
- Выполните визуализацию TPEM для интересующей области и области управления.
- Отрегулируйте положение головы при помощи винтов ухо бар высоты таким образом, что разбавлять область позиционируется строго горизонтально. Расположите иглу над утонченной регионе и убедитесь, что нет никаких крупных сосудов под целевой сайт.
- Сделать поражение путем погружения иглы в мозг, до глубины 0,5-2,0 мм от утонченной поверхности черепа и в соответствии с координатами в месте применения укола.
- Удалите иглу и подавить кровоизлияния появляются после тон острое повреждение мозга с гемостаза тампоном (см. Материалы и оборудование). Подождите, пока тромбы форма и судно пульсация в месте повреждения не остановится.
- Выполнение микроинъекции 100 мкМ сульфородамина 101 или другое соединение интерес в месте повреждения, как описано выше в разделе 1.2.10.
- Выполните визуализацию TPEM контролировать прогрессирование и восстановление травмы, как описано в Протоколе 3.
- После обработки изображений, позволяют животному опомниться от анестезии на грелку. Не оставляйте животное без присмотра и вернуть его в исходное клетке только после полного физического восстановления.
3. Изображений
- Место животное под микроскопом путем присоединения металлический держатель с пользовательских построен кадра.
- Для обработки изображений, использовать, например, в FV1000MPE двухфотонного микроскопа, оборудованного с Mai Tai DeepSee лазера и XLPLN 25X 1,05 Н.А. глубоководное погружение цели, оптимизированной для в естественных условиях двухфотонноготомография.
- Определить поражения сайт под микроскопом, используя режим флуоресценции широким полем. Используйте длинный пас фильтры для визуализации мозга сосудистую и выбрать область управления в соответствии с наблюдаемой картины кровеносных сосудов.
- Для изображения второй гармоники (ГВГ) сигнал, мелодия фемтосекундного лазера с длиной волны 800 нм и собирать излучаемого света, используя нм обходной фильтр 380-410. Для визуализации флуоресценции, используйте полосовой фильтр (515-560 нм), чтобы собрать излучаемого света, и следующие длины волн для возбуждения флуоресценции: GFP-860 нм, YFP-950 нм.
- Использование программного обеспечения FluoView для получения изображения.
- Магазин координаты каждого ROI для последующего повторного изображений. Изображение тот же трансформирования с течением времени, а также настроить координаты каждый раз, чтобы максимизировать перекрытие изображения.
- Анализ изображений с соответствующим программным обеспечением (например,. ImageJ). Реконструкция, представленные здесь, были сделаны с помощью программного обеспечения Imaris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы оптимизировали две процедуры работы: 1) хронический черепно оконных и 2) череп разжижающие, для посттравматической визуализации головного мозга у трансгенных мышей. Схематическое изображение эксперимента препаратов представлена на рисунке 1. Травматическое укол на стальной иглой 0,3 мм OD (30 г) наносят на пробуренной скважины (фиг.1А). Успешный черепно подготовка окно позволяет изображений на глубинах до 650 мкм ниже пиальных поверхности (рис. 1В), в то время как череп истончение стремится наложить ограничение около 300 мкм (рис. 1С), как показано в 3D реконструкции Thy1-YFP- Н мыши корковых пирамидальные нейроны.
Укол результаты травмы в ликвидации дендритов и разрушения капиллярных сетей в управляемой объема коры головного мозга. В течение первых двух дней, площадь поражения увеличивается, а травма индуцированной дендритов блеббинг и формирование дендритов отвода бulbs в областях perilesion, как это наблюдается с использованием в естественных условиях многофотонной микроскопии (рис. 2).
Мы провели череп истончение к активации изображения и миграции микроглии у мышей CX3CR1-EGFP сразу после травмы (рис. 3А). Томография ГСП предлагает ценный инструмент, чтобы очертить точно место повреждения (рис. 3б). Внеклеточные молекулы матрикса, которые производят сигналы ГСП значительно обогащены паренхимы мозга в укола травмы. Во-первых, мелкие микроглии процессы извлекаются, то микроглии клетки мигрируют к границе в месте повреждения (рис. 3А).
Для оценки потенциальных травм, вызванных тонким стеклом вставки пипетки и доставки красителя, мы выполняем в естественных условиях двух-фотонной микроскопии эксперименты с сульфородамина 101 микроинъекции у мышей Thy1-YFP-H без травмы головного мозга. Представитель изображения, показанные на рисунке 4 показывают, миcroinjection сайт 3 часа после инъекции. След вставки пипетки можно увидеть в мозговых оболочек головного мозга, визуализированных с помощью ГВГ (Рисунок 4А). Астроциты помечены Sulphorhodamine 101 введен путем инъекции (рис. 4В). Дендриты выражающие YFP под Thy1 промоутер не демонстрируют никаких морфологических признаков травмы, как блеббинга или отвода накаливания (рис. 4 C).
Рисунок 1. Метод острой черепно-мозговой травмой в сочетании с черепно-мозговой окна или тонких препаратов черепа в сочетании с в естественных условиях двухфотонного микроскопии. . Травматический укол стальной иглой 0,3 мм OD (30 г) применяется к пробуренной скважины. Игла кратко погружают в мозг 0,5-2 глубоких со дна скважины мм. B, C (C). D. Яркий вид поля из поверхностных кровеносных сосудов через стеклянное окно сразу после острой черепно-мозговой травмой. E. Растворено череп перед нанесением травмы. Выбранный область интереса (белой рамкой) и применения сайт укол (красный круг). Другое направление (красная рамка) утонченной региона должны быть отображены для мониторинга возможных хирургии вызванной артефакты.
Рисунок 2. Пример продольного многофотонном визуализации развития мозга травмы через утонченной черепа. . Дляр вид места повреждения в окружении YFP-меченых дендритов нейронов коры 20 мин после травмы причинение, изображение получено с помощью утонченной подготовки черепа. Б. Увеличенный вид на область, изложенной в панели А. С. То же область мозга, что и в B, reimaged 5 дней после травмы. Дендрит блеббинг показан с белыми стрелками, дендритные луковиц отвода - с красными стрелками.
Рисунок 3. Примеры воспалений мониторинга и активации глии во время развития мозга травмы, используя различные маркеры, пригодные для в естественных изображений многофотонный например флуоресцентных белков, красителей и второго сигнала генерации гармоник. Эти изображения были получены 3 ч после черепно-мозговой травмы.
Рисунок 4. Экспертиза воздействия ткани сделанные инъекции раствора через стеклянную микропипетки. . След (шоWN с пунктирной линией) в ГВГ визуализации мозговых оболочек мозга 3 часа после инъекции. B. Астроциты меченные sulphorhodamine введенные путем инъекции. C. Дендриты выражающие YFP под Thy1 промоутер. D. В сочетании образ A (ГВГ - серый), B (астроциты - красный), С (нейронов дендриты - желтый).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мозг травмы является неожиданным, непредсказуемым событием. Здесь мы опишем животную модель, которая воспроизводит спектр патологических изменений, наблюдаемых у больных людей после черепно-мозговой травмы, такие как нейродегенеративные, устранение дендритов, отек головного мозга, глиальных шрам, кровоизлияний в коре головного мозга в сочетании с фокусным субарахноидального кровоизлияния и повышенной проницаемостью гематоэнцефалический барьер. Для изучения первичной и вторичной патогенеза, а также восстановление после травмы, травмы эта модель была объединена с продольной ин виво визуализации тонкой нейронных и глиальных структур. Трансгенные линии мыши были использованы, что выразить флуоресцентные белки в нейронах (Thy1-YFP-Н) 7, астроциты (GFAP-EGFP) 8 или микроглии (CX3CR1-EGFP) 9. Кроме того, мы использовали генерации второй гармоники (ГВГ) изображений и астроцитов загрузки с Sulfarhodamine 101 10.
Модель, описанная здесь повторяет Пенеtrating тип травмы головного мозга. Поэтому ограничение данной модели является то, что он не обеспечивает информации о механизмах закрытой черепно-мозговой травмой. Недавно Меч и соавторы сообщили результаты визуализации многофотонный на поведение клеток в pericontusional коры 6. Учитывая, что закрыт травм головы является более частым медицинский случай, методологический подход сообщают авторы настоятельно обещая дополняют традиционные методы исследования в области травмы влияние мозга 11.
Мы использовали и хронический черепной окно 12 и череп истончение 13 препаратов для изучения поведения клеток под посттравматических условиях в живых мозг. Оба метода имеют определенные преимущества и недостатки. Таким образом, хроническая черепной окно обеспечивает лучшее разрешение, более глубокое оптический проникновение в ткани головного мозга и удобство для нескольких сеансов визуализации. С другой стороны, череп истончение менее вероятно, чтобы вызвать воспаление в госайт томография е, и, возможно, более важно, это позволяет повторяющиеся применения лекарств и красителей. Несколько примеров фармакологических агентов, которые должны применяться в этом типе экспериментов приведены в таблице 1.
| Тип Агент | Введенный агент | Области биология / аптеки исследований |
| Противовоспалительные | Циклоспорин | Травматическое повреждение мозга, вторичный ущерб, нейродегенерация |
| Токсины | Тетродотоксин | TBI - вторичное повреждение, excytotoxicity |
| Бикукуллин | TBI - вторичное повреждение, хлорид гомеостаз | |
| Ингибиторы сигнальных путей | PD98059 (ингибитор MAPKK) | механизмы воспаления, вторичного повреждения, посттравматическая гибели клеток, нейродегенеративные и регенерации сигналов |
| SU6656 (ингибитор киназы Src семья) | ||
| Нейротрофических факторов | Мозговой нейротрофический фактор, BDNF | TBI - нейронов выживания после травмы, нейропротекции в средней посттравматического повреждения головного мозга |
| Вирусы | лентивирусов для экспрессии белка | молекулярные механизмы посттравматического нейродегенерацией и регенерации, дифференциальный маркировка типов клеток в поврежденный мозг для естественных изображений |
| аденовирусные векторы для экспрессии белка | ||
| Са 2 + люминесцентные индикаторы | Fluo-2, 4 | механизмы посттравматического воспаления сигнализации, гибель клеток, миграцию клеток, аксонов / дендритных регенерации |
Таблица 1. Фармакологические средства и красители для корковой инъекции в укола модели повреждения.
Широкий спектр биохимических событий, которые очень важны в физиологических и патологических состояний может быть зондировали химических ингибиторов, флуоресцентных индикаторов и мутантного белка, введенных через вирусных конструкций. Преимущества выбора окна частности времени предоставляемые подготовке череп истончение может быть очень важен для этих исследований.
В настоящем исследовании мы использовали второй сигнал гармоники очертить место повреждения. Кроме того, границы травма сайт может быть обозначено слабо диффундирующего флуоресцентным красителем, например высокая молекулярная масса декстрана флуоресцентный конъюгата (2000000 Дальтон).
Недавно Шаффер и его коллеги 14 использовали хроническое подготовкус reopenable черепной окна для повторного поставки флуоресцентных красителей к мыши коры. Вполне вероятно, что черепная окно открытие может негативно повлиять на прозрачность ткани мозга. Кроме того, трудно предсказать временной ход возобновлении вызванной воспалением, которые могут повлиять на соединительной ткани отрастания.
Одно из главных преимуществ утонченной подготовки черепа является возможность для доставки терапевтических соединений (и другие материалы, требующие актуальные инъекции в ткани головного мозга) несколько раз во время прогрессирования травмы, не усложняя артефакты (например, без черепной окна возобновления).
Если повторяющиеся доставка соединение непосредственно в месте повреждения желательно, следует учитывать специальные средства для предотвращения черепа сухой отъезда и бактериальной инфекции. Таким образом, сохраняя управляется области головы в стерильных условиях и применение антибиотиков (например, энрофлоксацина) рекомендуется. Чтобы сохранить тhinned черепа регион от высыхания, заполнить металлический держатель с 1,5% агарозы и покрыть ее круглого покровного стекла. В большинстве случаев это позволит сохранении той же прозрачности или разведенные череп за период до 10 дней. Некоторые дополнительные должно быть принято, если несколько сеансов изображений в утонченной подготовки черепа планируется в течение длительного периода времени. Непосредственно перед каждой сессии изображений, осторожно удалите вновь образованных соединительной ткани с разреженной области с использованием микрохирургической лезвие. Используйте TPEM визуализации ГВГ проверить качество изображения и измерения толщины костей. Tissue возобновление роста может привести к нарушению глубину проникновения и вызвать размытость изображения сопровождается увеличением фоновой флуоресценции. Обновить череп истончение нежно с микрохирургической лезвия вернуть высокое качество изображения.
В тех случаях, которые не требуют прямого доступа к месту повреждения, мы настоятельно рекомендуем покрытия утонченной область черепа со стеклянной coversliр, как описано в статье на полированной и железобетонные разбавлять подготовку череп Кляйнфельд и коллег 15. Это может быть сделано с помощью следующей факультативную процедуру. Поместите небольшую каплю агарозы (1,5%) на разведенной черепа регионе, подождите, пока он не станет гель, удалите все ненужные агарозы, т.е. оставить его только на месте повреждения. Агароза должны защитить место повреждения от внешних воздействий. Высушите разбавленной черепа регион с помощью сжатого воздуха. Оставьте небольшое количество полиакриловой клея на небольшой кусок # 0 покровного стекла и поместить его на утонченной черепа регионе. Полиакриловая клей предотвращает костной и соединительной ткани отрастания, при этом сохраняя утонченную череп под окном сохранились.
Сочетание этих процедур позволяет изучать острые и хронические посттравматические процессы, доставки лекарств местно или системно и непосредственно мониторинга последствий лечения. Использование двойных или тройных трансгенных линий мышей также может быть полезным, частицциркулярно для одновременного визуализации нескольких посттравматических процессов, таких как глиальных рубцов и нейронов филиала отрастания. Мы ожидаем, что наши модели острой черепно-мозговой травмой учился с прижизненной двухфотонного микроскопии доказать плодотворным для кандидата лекарственной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы глубоко благодарны д-р Франк Кирхгофа для обеспечения GFAP-EGFP и штаммов CX3CR1-EGFP мыши. Работа выполнена при поддержке грантов от центра международной мобильности Финляндии, Tekes, финская Высшей школы неврологии (FGSN) и Академией Финляндии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
