Summary
משלוח נשאר האתגר המרכזי ליישום הטיפולי של RNA הקטן מפריע (siRNA). פרוטוקול זה כרוך בשימוש בפלטפורמת משלוח siRNA רב תכליתי וביולוגית, בהיקף של ארגינין וmicroparticles סיליקון הנקבובי polyethylenimine מורכב.
Introduction
RNAs התערבות הקטן (siRNAs) הם מולקולות RNA פעמיים תקועים שיכול לדכא את הביטוי של גנים. בשנים האחרונות, siRNAs פותחו כדור חדש של biodrugs שמראה פוטנציאל טיפולי לשימוש עתידי ביישומים קליניים 1-5. עם זאת, היישום המוצלח של טיפול siRNA נשאר אתגר משמעותי, עקב הידרדרות בnucleases, ספיגה לקויה תאית, יעילות transfection נמוך ושחרור יעיל מאנדוזום / הליזוזום 5. רבים ממכשולים אלה ניתן להתגבר על ידי הפיתוח של פלטפורמות אספקה, אשר בבטחה וביעילות יכול לספק siRNA לרקמה חולה. בהשוואה לנישאים נגיפיים, פלטפורמות שאינן נגיפיות לספק מספר יתרונות, כגון בטיחות, עלות נמוכה וקלות לחייטות. בננו-חלקיקים מסוימים, קטיוני, כגון פולימרים וליפידים, הוכיח שימושי עבור siRNA משלוח 3.
בעבר, פיתחנו ד"ר דמוי דיסקוסUG מערכת מסירה, המכונה וקטור multistage (MSV). פלטפורמה זו מבוססת על שלבים רציפים, שבו רכב אחד משתחרר מאחרת. רכב השלב הראשון הוא microparticle עשוי מתכלה סיליקון הנקבובי (PSI), ואילו כלי רכב השלב השני הם חלקיקים טעונים עם תרופות או חומרי ניגוד 6,7. חלקיקים, שמוטמעים בחומר PSI, משתחררים בהדרגה כSi מדרדרת 8. יתרון של שימוש בחלקיקי Si הוא שיכול בקלות להיות מותאמים למאפייני המורפולוגיה ופני שטח כדי להשיג biodistribution אופטימלי ושחרור תרופה. לאחרונה, השימוש המוצלח של פלטפורמת MSV למסירה ליפוזומים siRNA לרקמת גידול הוצג במודל השחלות וסרטן שד עכבר 9, 10.
בעבודה זו, יש לנו מפוברק מערכת מסירה אוניברסלית לsiRNA המבוסס על העקרונות של פלטפורמת MSV. היעילות של מערכת מסירה זה בעבר הפגינהing siRNA שונה מולקולות 11. המערכת היא סיליקון הנקבובי ספק פונקציונליות polycation (PCPs), בהיקף של PSI מורכב עם polyethylenimine (PEI) וארגינין (ARG). PEI יכול לסייע ביצירת אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם siRNA, ואילו Arg וPSI יכולים לשמש כדי להפחית את הרעילות של PEI, כdemonstarted 11 בעבר. בנוסף, הנוכחות של PEI יכולה לסייע בספיגה תאית ובריחת endosomal, בעוד microparticles PSI לאפשר הגנת siRNA ושחרור מושהה. חלקיקי PSI לבזות בהדרגה בתנאים פיסיולוגיים, ובכך וכתוצאה מכך ההיווצרות של חלקיקי Arg-PEI / siRNA (איור 1), שבו יש מורפולוגיה שונה והתפלגות גודל צרה 11. לפרטים בדבר יציבותה של מערכת PCPs / siRNA, עיינו במחקר על ידי et al שן. 11. פלטפורמת PCPs זו שונה מMSV הקונבנציונלי, מאז חלקיקי השלב השני אינם בתחילה preseNT במנשא, אבל נוצרים לאורך הזמן כנישא השלב הראשון מדרדרת 11, 12. יעילות טעינת siRNA יעילות, cytotoxicity וגן ההשתקה של מערכת PCPs הוערכה במבחנה. יעילות transfection נמדדה באמצעות siRNA נגד תסמונת אטקסיה טלנגיאקטזיה מוטציה אונקוגן (ATM), העוסקת בתיקון DNA 10. בעבר, דיכוי הכספומט הוכח להקטין את צמיחת גידול במודל סרטן שד 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPs חלקיקים הכנה
- חמצן חלקיקי סיליקון הנקבובי שאינם פונקציונליות בפתרון 30% של מי חמצן על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. Aminate חלקיקי חמצון ב 2% (3 aminopropyl) פתרון triethoxysilane באלכוהול איזופרופיל עבור 2 ימים על 65 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין.
- צנטריפוגה הפתרון למשך 30 דקות ב 18,800 XG ולשטוף את החלקיקים פעמיים באלכוהול איזופרופיל ושלוש פעמים באתנול, באמצעות sonication הקצר להשעות את גלולה. השאר את החלקיקים בתמיסת אתנול בעת ביצוע צעד 1.3 ו -1.4.
- הוספת נפח ידוע של השעיה חלקיק (למשל, 10 μl) לdiluent 10 מיליליטר isotone ולספור את החלקיקים עם מנתח ספירת חלקיקים כדי לקבוע את הריכוז של חלקיקים בפתרון המניות.
- הפעל את הקבוצה של חומצת L-ארגינין (0.1 nmol) עם N - (3-dimethylaminopropyl) - hydrochloride -ethylcarbodiimide 'N (EDC, 0.1 nmol) / N
- בקצרה sonicate פתרון מניות חלקיקים ולהוסיף 1 מליארד חלקיקים לפתרון L-ארגינין ולהשאיר התגובה במשך 18 שעות בRT עם ערבוב עדין.
- הפעל את הקבוצה הראשונה אספרטית החומצה של N - (טרט-Butoxycarbonyl)-ס-אספרטית חומצה (בוק-Asp-OH, nmol 1) עם EDC (0.1 nmol) / NHS (0.1 nmol) ב 20 מיליליטר של אתנול במשך 4 שעות ב 4 ° C עם ערבוב עדין.
- לפזר 50 polyethylenimine מ"ג 10 מיליליטר אתנול ולהוסיף את הפתרון לתערובת הבוק-Asp-OH. בואו התגובה להמשיך למשך 24 שעות בRT עם ערבוב עדין.
- הפעל את קבוצת החומצה אספרטית השנייה של פתרון הבוק-Asp-OH / PEI עם EDC (0.1 nmol) / NHS (0.1 nmol) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 6 עם ערבוב עדין.
- כדי לקבל חלקיקי PCPs, להוסיף את פתרון חלקיקים מצעד 1.5 לפתרון הבוק-Asp-OH / PEI מצעד 1.8. אפשר התגובה להמשיך במשך 18 שעות בRT עם רח 'העדין irring.
- צנטריפוגה הפתרון למשך 30 דקות ב 18,800 XG ולשטוף את פתרון החלקיקים שלוש פעמים עם אתנול, באמצעות sonication הקצר להשעות את גלולה.
2. PCPs חלקיקים אפיון
- למדוד את גודל החלקיקים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
- מניחים ירידה של השעיה חלקיק (10,000 חלקיקים / μl באתנול) על בדל מדגם סיליקה נקייה SEM ולתת להתייבש בRT תחת ואקום.
- מדוד תמונות SEM בkV 8 עם מרחק עבודה 3-5 מ"מ באמצעות גלאים בעדשה.
- מדוד את פוטנציאל זטה של החלקיקים באמצעות מערכת מנתח חלקיקים.
- מערבבים 10 μl של השעיה חלקיק (10,000 חלקיקים / μl באתנול) עם חיץ 1 מיליליטר של 10 מ"מ פוספט (pH 7.4).
- טען את המדגם לתאי נימים מקופלים ולמדוד את פוטנציאל זטה-פי הוראות היצרן.
- ייבש את חלקיקי PCPs (משלב חלקיקי PCPs הכנה 1.9) תחת O ואקום / N.
- להוסיף siRNA (4 מיקרוגרם) במי nuclease חינם (20 μl) לחלקיקי PCPs המיובשים ובקצרה sonicate. השתמש בחלקיקים הבאים ליחסי siRNA: 2 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA, 4 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA, 6 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA, 8 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA, 10 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA ו -12 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA.
- דגירה של 3 שעות ב 4 ° C על שייקר (1,000 סל"ד), כדי לאפשר siRNA מחייב את החלקיקים.
4. אופטימיזציה של יחס החלקיקים siRNA / PCPs
- להוסיף צבע טעינת DNA עד 20 μl של חלקיקי siRNA PCPs / שליטה עם חלקיקים שונים ליחסי siRNA (ראה טעינה של siRNA לחלקיקי PCPs).
- טען את סםPles ל-2% agarose ג'ל המכיל כתם ג'ל DNA.
- לבצע אלקטרופורזה במתח קבוע של 120 V עבור 20 דקות בהפעלת מאגר.
- לנתח את הג'ל עם רכישת תמונה ותוכנת ניתוח.
5. שחרור siRNA מPCPs חלקיקים
- מערבבים 20 μl של חלקיקי siRNA PCPs / שליטה עם חלקיקים שונים ליחסי siRNA (ראה שלב 3) בסולפט dodecyl נתרן (SDS, 2%) ולתת לעמוד במשך השעה 1 בRT.
- להוסיף צבע טעינת DNA לדגימות.
- דגימות טען ל-2% agarose ג'ל המכיל כתם ג'ל DNA.
- לבצע אלקטרופורזה במתח קבוע של 120 V עבור 20 דקות בריצה חיץ באמצעות ציוד אלקטרופורזה DNA ואספקת חשמל.
- לנתח את הג'ל עם רכישת תמונה ותוכנת ניתוח.
6. Confocal מיקרוסקופית של חלקיקי PCPs
- הוסף 5 μl של חלקיקי PCPs / ניאון שליטת siRNA (10 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם siRNA / 20 μl) ללהחליק את מכסה זכוכית.
- דמיינו שכבות חלקיקים על ידי מיקרוסקופ confocal.
7. אפיון של Arg-PEI / שליטת siRNA חלקיקים
- להשפיל את חומר סיליקון ויוצר חלקיקים / siRNA שליטת Arg-PEI, להוסיף חלקיקי PCPs / siRNA (10 × 10 6 חלקיקי PCPs / 2 מיקרוגרם siRNA) לשל בופר פוספט 100 μl ולנער (1,000 סל"ד) על 37 מעלות צלזיוס ל 2 ימים.
- צנטריפוגה המדגם למשך 30 דקות ב 18,800 XG ולאסוף את supernatant.
- למדוד את גודל חלקיקי Arg-PEI / siRNA נוצרו עם פיזור אור דינמי (DLS).
- מערבבים 10 μl של supernatant עם חיץ 1 מיליליטר 10 מ"מ פוספט (pH 7.4) ומקום לקובט פלסטיק.
- למדוד את גודל החלקיקים באמצעות מערכת מנתח חלקיקים על פי הוראות היצרן.
- לקבוע את הגודל ומורפולוגיה של Arg / PEI-siRNA נוצרחלקיקים עם מיקרוסקופ כוח אטומי.
- קח 10 μl של supernatant ומניחים על פרוסות סיליקון.
- דמיינו את החלקיקים עם מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM).
תרבות 8. סלולארי
- מד"א MB-231 תאי סרטן השד אנושי תרבות בתקשורת תרבות תא בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין, סטרפטומיצין 1% ב 5% CO 2, לחות 95% ו- 37 ° C.
9. Confocal מיקרוסקופית של תאי חיים עם PCPs חלקיקים
- תאי פלייט בתרבות 2 היטב מחליק בצפיפות זריעה של 3 x 10 5 תאים / טובה למשך 24 שעות.
- הוספת חלקיקי PCPs עמוס siRNA שליטת ניאון (10 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם של חלקיקי יחס siRNA, 50 ננומטר siRNA) לתאים.
- להקליט סרט של התאים במיקרוסקופ confocal (מסופק עם תא, 5% CO 2, לחות 95% ו- 37 מעלות צלזיוס) במשך 12 שעות הבאות אקספו החלקיקיםבטוח.
10. Confocal מיקרוסקופית של תאים קבועים עם PCPs חלקיקים
- תאי פלייט בתרבות 2 היטב מחליק בצפיפות זריעה של 3 x 10 5 תאים / טובה למשך 24 שעות.
- הוספת חלקיקי PCPs עמוס siRNA שליטת ניאון (10 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם של חלקיקי יחס siRNA, 50 ננומטר siRNA) לתאי דגירה ליום 1, 7 ימים ו -10 ימים.
- שוטף את התאים פעמיים עם פוספט שנאגרו מלוח ולאחר מכן לתקן אותם עם 4% paraformaldehyde פתרון עבור 10 דקות.
- לשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח.
- Permeabilize התאים עם 0.1% ethoxylate פנול octyl למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח.
- חסום את התאים עם אלבומין מסרום שור (10 מ"ג / מיליליטר) שבנאגר מלוח פוספט 10 דקות ב RT עם ערבוב עדין.
- כדי להמחיש אקטין פילמנטיות, דגירה התאים עם phalloidin שכותרתו fluorescently (μl 1/40 μlפתרון חסימה) במשך 20 דקות ב RT עם ערבוב עדין ולאחר מכן לשטוף בופר פוספט.
- הסר את השקופיות מהמסגרת ולהוסיף antifade מגיב עם 4, 6-diamidino-2-phenylindole '(DAPI) כדי להמחיש את הגרעין.
- הוסף זכוכית על גבי עטיפה ולקחת תמונות של התאים עם מיקרוסקופיה confocal.
11. cytometry הזרימה של תאים עם PCPs / ניאון חלקיקי siRNA בקרה
- פלייט תאים בצלחת 6-גם בצפיפות זריעה של 3 x 10 5 תאים / טובה למשך 24 שעות.
- הוספת חלקיקי PCPs עמוס siRNA שליטת ניאון (10 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם של חלקיקי יחס siRNA, 50 ננומטר siRNA) לתאי דגירה של 24 שעות.
- לשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח ולגרד אותם עם מגרד תא.
- אחסן את התאים שבנאגרו מלוח פוספט עם 2% בסרום שור עוברי לפני הניתוח. השתמש בתאים שלא טופלו כביקורת שלילית.
- בצע זרימת CYtometry.
12. כדאיויות תא של תאים עם PCPs חלקיקים וPCPs / שליטת חלקיקי siRNA
- פלייט תאים בצלחת 96-היטב בצפיפות תאים של 3 × 3 תאים 10 / טובה למשך 24 שעות.
- פנק את התאים עם חלקיקי PCPs (1.5 × 10 5 / טוב ו6 × 10 5 / טוב) או חלקיקי siRNA PCPs / שליטה (10 × 10 5 חלקיקים / 0.2 מיקרוגרם של חלקיקי יחס siRNA, 10 ננומטר ו100 ננומטר siRNA) במשך 48 שעות ו -72 שעות. השתמש בתאים שלא טופלו ותאים שטופלו בופר פוספט (נפח זהה החלקיקים הוסיפו) כפקדים. Assay כל דגימה בשלושת עותקים.
- בצע assay התפשטות תאים על פי הוראות היצרן.
- מייצג נתונים כממוצע ± סטיית תקן.
13. מערבי כתם של תאים עם PCPs / כספומט חלקיקי siRNA מוטציה
- פלייט תאים בצלחת 6-גם בצפיפות תאים 2 × 10 5 תאים / well למשך 24 שעות.
- דגירה התאים עם siRNA PCPs / שליטה (50 ננומטר) חלקיקים או PCPs / הכספומט siRNA (50 ננומטר) חלקיקים במשך 72 שעות. השתמש בתאים שלא טופלו כביקורת.
- Lyse התאים באמצעות מגיב מיצוי חלבון בתוספת מעכבי פרוטאז קוקטייל.
- צנטריפוגה lysates התא במשך 10 דקות ב 14,000 XG ולשחזר את supernatant.
- קבע את ריכוז החלבון עם assay כימות חלבון על פי הוראות היצרן.
- הוסף חוצץ טעינת מדגם (עם 5 μl 2-mercaptoethanol / חיץ מיליליטר) לדגימות ולחמם אותם במשך 6 דקות ב -99 מעלות צלזיוס.
- טען את דגימות החלבון (20 מיקרוגרם / μl) בכ -12% ג'ל SDS-polyacrylamide בהפעלת מאגר ולבצע ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (1 שעה, 120 V) תוך שימוש בציוד אלקטרופורזה ואספקת חשמל.
- העבר את הג'ל במאגר העברה (עם 20% מתנול) לקרום nitrocellulose (1 שעה, 100 V) תוך שימוש בציוד אלקטרופורזה ואספקת חשמל.
- חסום את הממברנה עם 5% חלב יבש לשעה 1.
- דגירה הממברנה עם נוגדן הכספומט היסודי (מארנב) בחסימת פתרון (משלב 13.9) בשעה 1: O דילול 1000 / N.
- לשטוף את הממברנה עם מי מלח שנאגרו פוספט המכיל 0.1% monolaurate sorbitan פוליאתילן גליקול ולאחר מכן דגירה אותו עם נוגדנים משני (נגד הארנב) בחסימת פתרון (משלב 13.9) בשעה דילול 1: 2500 עבור שעה 1.
- לשטוף את הממברנה עם מי מלח שנאגרו פוספט המכיל 0.1% monolaurate sorbitan פוליאתילן גליקול ולזהות את להקות חלבון עם מגיב איתור כתם המערבי באמצעות רכישת תמונה ותוכנת ניתוח.
- על בקרת הטעינה, לשטוף את הקרום וחזור על צעדים 13.9-13.12 באמצעות נוגדן ראשוני β-אקטין (מעכבר, 1: 10,000 דילול) ונוגדנים משני (אנטי עכבר 1: 4,000 דילול).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של מערכת מסירה שאינה נגיפית לtransfection siRNA הבטוח והיעיל. תוצאות SEM עולות כי חלקיקי PCPs הם גליליים בצורה ולהיות בקוטר של 2.6 מיקרומטר (איור 2 א). החלקיקים טעונים חיובי עם פוטנציאל זטה של כ 8.21 (איור 2), ובכך מאפשרים אלקטרוסטטי מחייבים עם נוקלאוטידים טעונים שלילי. תמונות Confocal של שכבות שונות של חלקיקי PCPs להוכיח כי שליטת ניאון siRNA נטען בתוך חלקיקי סיליקון הנקבובי (איור 2 ג). ההיווצרות והשחרור של חלקיקי Arg-PEI / siRNA מחלקיקי PSI אושרו עם DLS וAFM. התפלגות הגודל של החלקיקים נעה 70-120 ננומטר, עם גודל ממוצע של 94 ננומטר (איור 2 ד). תמונות AFM להמחיש שיש לי חלקיקי צורה כדורית (איור 2E).
רטיo של חלקיקים לsiRNA הייתה מותאמת על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose על מנת להבטיח זיקה גבוהה מחייבת (איור 3 א). מגוון רחב של חלקיקים ליחסי siRNA שימש (2 × 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 ו -12 × 10 5 /0.2 מיקרוגרם siRNA). תוצאות המחקר מראים כי siRNA יכול להיקשר בחוזקה לחלקיקים כאשר כמות החלקיקים היא מעל 8 × 10 5. יחס של 10 × 10 5 PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA נבחר לניסויים נוספים. יתר על כן, siRNA שוחרר בהצלחה מהנישא כאשר טופל בSDS, כפי שמודגם באיור 3.
בשלב הבא, הפנמת המרתף של חלקיקי siRNA PCPs / ניאון שליטה הוערכה במד"א MB-231 תאים. תמונות confocal נלקחו לאחר 24 שעות של תכנית טיפול שהחלקיקים הפנימו בצורה יעילה לתאים (איור 4 איור 5 מראה כי 89% מתאים הפנימו PCPs / חלקיקי siRNA לאחר 24 שעות של דגירה. יתר על כן, תהליך ההפנמה נרשם במשך 12 שעות (וידאו 1). תוצאות אלו מצביעות על כך שחלקיקי PCPs ביעילות יכולים לספק siRNA לתוך תאים. ההצטברות ארוכת הטווח של siRNA בתוך התאים גם הוערכה על ידי מיקרוסקופ confocal. ביום 7 ויום 10 siRNA עדיין היה להבחין בתוך התאים (איור 6).
אחד הגורמים החשובים ביותר שיש לשקול בעת פיתוח מערכת מסירת siRNA הוא הבטיחות של המוביל 13. PEI ידוע כדי ליצור polyplexes עם siRNA, סיוע בקליטה סלולרית ושחרור הדק מאנדוזום / הליזוזום. עם זאת, PEI יכול להיות השפעה רעילה, בשל נוכחותם של מטען חשמלי חיובי קבוצות אמינו עיקריות בעמוד השדרה 14,15. לדוגמא, PEI מחייב glycocalyx על פני התא יכול לגרום foדע של אשכולות גדולים 16. על מנת למנוע רעילות מושרה על תשלום זה, PEI היה מצומדת קוולנטית לארגינין באמצעות מקשר גשר, כדי לצמצם את מספר קבוצות אמינו העיקריים. כדאיות התא נשארו מעל 95% לאחר 48 שעות ו -72 שעות כאשר חלקיקים וsiRNA שמשו בריכוז של עד 6 × 10 5 / ננומטר, בהתאמה (איור 7 א) גם ל- 100. בשלב הבא, את יעילות transfection של siRNA כנגד כספומט אונקוגן הוערכה במד"א MB-231 תאים. תוצאות כתם מערביות מראות כי רמות החלבון של הכספומט הם ירדו לאחר הטיפול בPCPs / הכספומט siRNA (איור 7). התוצאות מצביעות על פלטפורמת PCPs היא מערכת אספקה בטוחה ויעילה לsiRNA.
איור 1. ייצוג סכמטי של סיליקון הנקבובי חלקיקים (PCPs) פונקציונליות polycation. -polyethylenimine strong> ארגינין (ARG) (PEI) / חלקיקים קטנים RNA מפריע (siRNA) נוצרים בעקבות ההשפלה של סיליקון (Si).
איור 2. אפיון של חלקיקי PCPs. תמונה () מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של חלקיקי PCPs. פוטנציאל זיטה של חלקיקי PCPs (B). (ג) תמונות Confocal של שכבות שונות של חלקיקי siRNA שליטת PCPs / ניאון. הפצת גודל (D) של חלקיקי ארגינין Arg-PEI / שליטת siRNA שוחררו מmicroparticles סיליקון הנקבובי. תמונות (E) במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) של חלקיקי siRNA Arg-PEI / שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ג'ל Agarose לאופטימיזציה של מערכת מסירת PCPs / siRNA. () כריכת זיקה בין חלקיקי PCPs ולשלוט siRNA. הלהקות מייצגות siRNA מאוגד. שחרור (B) siRNA הבא דגירה עם 2% SDS עבור שעה 1. הלהקות מייצגות siRNA הכולל (מאוגד והקשור). דוגמא 1: siRNA; מדגם 2: 2 × 10 5 חלקיקי PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA; מדגם 3: 4 × 10 5 חלקיקי PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA; מדגם 4: 6 × 10 5 חלקיקי PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA; מדגם 5: 8 × 10 5 חלקיקי PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA; מדגם 6: 10 × 10 5 חלקיקי PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA; 12 × 10 5 חלקיקי PCPs / 0.2 מיקרוגרם siRNA: 7 מדגם.
75 / 52075fig4.jpg "/>
איור 4. תמונות מיקרוסקופ Confocal של PCPs / חלקיקי ניאון siRNA (אדום) במד"א MB-231 תאים (24 דגירה שעה). הגרעין ויקטין פילמנטיות היו דמיינו עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, כחול ) וphalloidin (ירוק), בהתאמה. שלוש שכבות שונות הם צילמו (למעלה, באמצע ובסיסי). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. זרימת כמותית cytometry הניתוח של מד"א MB-231 תאי ניאון לאחר דגירה עם חלקיקי siRNA ניאון PCPs / שליטה. תאים שלא טופלו שמשו כביקורת שלילית. 89% מתאים הפנימו את החלקיקים.
igure 6 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,075 / 52075fig6.jpg "/>
תאי איור 6. תמונות Confocal שליטה ניאון siRNA (אדום) בתוך מד"א MB-231 תאים. הודגרו עם PCPs / חלקיקי ניאון שליטת siRNA ליום 1, 7 ימים ו -10 ימים. תאים אז היו דמיינו עם מיקרוסקופ confocal. אקטין הגרעין ופילמנטיות היה דמיין עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, כחול) וphalloidin (ירוק), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור assay כדאיות תא של תאים הודגרו עם חלקיקי PCPs וחלקיקי siRNA PCPs / שליטה (SCR) 7. כדאיות תא והשתקת גנים במבחנה. (). ניסוי בוצע בטיולlicate והתוצאות מוצגים כממוצע סטיית תקן ±. תאים שלא טופלו (ריק) ותאים הודגרו עם PBS שמשו כקבוצת ביקורת. כתם מערבי של telangiectasia PCPs / אטקסיה מוטציה חלקיקי siRNA (ATM) (B). תאים נחשפו לחלקיקי siRNA (SCR) PCPs / שליטה וחלקיקי PCPs / כספומט siRNA. תאים שלא טופלו (מדומה) שמשו כביקורת. β-אקטין שימש כביקורת טעינה.
וידאו 1. ספיגת זמן תלוי של PCPs / חלקיקי siRNA שליטת ניאון במד"א MB-231 תאי חיים. הווידאו הוקלטה עבור שעות 12 לאחר חשיפת התאים לחלקיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה למסירה המוצלחת וtransfection של siRNA לתוך תאים. בפרט, המשלוח של siRNA מושגת באמצעות פלטפורמה רב תכליתי הכוללת חלקיקי PSI-פונקציונליות polycation. השימוש בטיפול siRNA יש פוטנציאל גדול, לדוגמא, טיפול בסרטן, כפי שניתן ממוקדים אונקוגנים שונים עם סגוליות גבוהות. לכן, קיים ביקוש לפיתוח כלי רכב משלוח siRNA, שיכול למתן את האתגרים של טיפול siRNA. לסיכום, יש לנו התוויתי פרוטוקול שמראה הבטחה לאספקה בטוחה ויעילה של siRNA. עם זאת, יש כמה גורמים מרכזיים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הטכניקה המתוארת. לדוגמא, שיקול חשוב בעת הכנת חלקיקי PCPs הוא לטפל siRNA בזהירות, כדי למנוע השפלה ידי nucleases. בכפפות מיוחדות, נקיות וRNAse יש להשתמש צינורות ומים חינם בכל העת בעבודה עםsiRNA. אם את יעילות transfection siRNA היא נמוכה, תרסיס שמסיר זיהום RNase יכול לשמש כדי לרסס כפפות ואזורי עבודה. בנוסף, אם transfection הוא לא מוצלח, siRNA צריך להיבדק עם מגיב transfection מסחרי, כדי לקבוע אם הבעיה נגרמת על ידי siRNA או החלקיקים. שיקול מרכזי נוסף ליישום מוצלח של מערכת מסירת PCPs / siRNA הוא לטפל בעת ביצוע צעדי צנטריפוגה וכביסה. כלומר, supernatant צריך להיות מושלך באופן מלא כדי להסיר חומרים כימיים עודפים הנדרשים בכל שלבי ההכנה של חלקיקים.
יתרון חשוב של מערכת PCPs / מסירת siRNA הוא בטיחות. יש סוכני transfection siRNA כמה תשלום קטיוני גבוה, אשר תורם לרעילות סלולרית 13,15. ואכן, רוב הפרוטוקולים המסחריים מצביעים על כך שהחומרים הכימיים צריכים להיות מודגרות עם התאים רק לכמה שעות, כדי למנוע מוות של תאים. להיפך, ceיכול להיות חשוף LLS לחלקיקי PCPs במשך כמה ימים ללא כל סימנים של רעילות, כפי שעולים מתוצאות כדאיות תא. חלקיקי PCPs יכולים להיקשר siRNA עם זיקה גבוהה בשל נוכחותם של PEI. עם זאת רעילות עקב תשלום של PEI נמנעת על ידי ההתקנה הייחודית של פלטפורמת המשלוח. במיוחד קוולנטיים המחייב של Arg לPEI ואנקפסולציה של PEI בתוך Si נקבוביות לתרום לרעילות מופחתת. יתרון נוסף של פלטפורמת PCPs הוא שtransfection siRNA יכול להתקיים בנוכחות הסרום. שיטות קיימות אחרות בדרך כלל דורשות השימוש בתרבית תאי תקשורת חופשי בסרום, ובכך מוסיפות צעדים נוספים לתהליך transfection ועלול להפריע למסלולי איתות סלולארי רגילים.
יתרון נוסף של המערכת הוא שPCPs היא אינה דורשת כל שינוי של מולקולות siRNA. בעוד כמה שיטות הנוכחיות דורשות צעדי נטיה מסובכים כדי לייצב את siRNA או כדי לאפשר גהפנמת ellular 13, מערכת PCPs מסתמכת על ערבוב פשוט לטעינת siRNA. מחייב PEI והנקבובי בחומר Si מספק סביבה מוגנת לsiRNA, ובכך להפחית מגע עם nucleases. חלקיקי PCPs ניתן לאחסן לתקופות ממושכות של זמן כחומר יבש או באלכוהול איזופרופיל. יתר על כן, אם חלקיקי PCPs / siRNA הם lyophilized הם יכולים להיות מאוחסנים במשך שלושה חודשים לפחות ב 4 מעלות צלזיוס. חלקיקי PCPs lyophilized צריכים להיות מושעים במים חופשיים RNase רק לפני transfection, ולא צריך להיות מאוחסנים בפתרון. לבסוף, היתרי פלטפורמת PCPs ספגו שחרורו של siRNA, כפי שדווח בעבר 11, וכתוצאה מכך להגדיל את משך הזמן בו למקד את הגנים יישארו מדוכאים. בהתאם לכך, לאחר הפנמה סלולרית, חלקיקי Si לבזות בהדרגה, וכתוצאה מכך ההיווצרות של חלקיקי Arg-PEI / siRNA. בהמשך לכך, siRNA משתחרר לאט בציטופלסמה, שבו הוא יכול להיקשר לMesseהאצבע RNA (mRNA), ובכך להפעיל פעילות ביולוגית. אמנם, חלקיקי PCPs לספק מספר יתרונות בהשוואה לשיטות קיימות למסירת siRNA, הגבלה של הטכניקה היא שmicroparticles PSI-פונקציונליות שאינו נדרש כחומר מוצא. בעוד שניתן מסונתזים החלקיקים באמצעות photolithography ותחריט אלקטרוכימיים 17, טכניקות אלה אינן זמינות בכל המוסדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
