Introduction
حاجز السوائل الدم النخاعي (BCSFB) هي واحدة من المواقع حاجز الثلاثة بين الدم والدماغ 1. في المضاهاة الصرفي هي الخلايا الظهارية في الضفيرة المشيمية (CP) 2،3، وهو ملفوف-البطانية الظهارية، وهي أوعية دموية بشدة وتقع في بطينات الدماغ. يقدم CP لإنتاج السائل النخاعي (CSF)، وكذلك لفصل الأخير من الدم. من أجل تحقيق وظيفة الحاجز، تظهر الخلايا الظهارية CP نشاط احتسائية منخفضة، وتعبر عن النقل محددة، وترتبط كثيفة من قبل شبكة مستمرة من منعطفات ضيقة (TJS) 2،3.
البشري الورم الحليمي المشيمية الضفيرة (HIBCPP) الخلايا، مستمدة من خبيث الورم الحليمي المشيمية الضفيرة من امرأة يابانية 4 استخدمت لبناء وظيفي في نموذج المختبر من BCSFB. تظهر خلايا HIBCPP بضع خصائص BCSFB ظيفية وتشكيل TJجدائل، وتطوير إمكانات غشاء بطريق الظهارة العالية التي يمكن تحديدها على النحو المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنفاذية طفيفة عن الجزيئات. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا HIBCPP تعبر عن النقل المميزة، والتي قد تساعد على تنظيم المكروية الأيونية، وتبين قمي / basolateral 5،6،7 القطبية.
وقد تبين أن BCSFB للعمل كموقع لدخول مسببات الأمراض (البكتيريا والفيروسات والفطريات) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 8. غزو الجراثيم، بما في ذلك النيسرية السحائية (السحائية ن)، وهي بكتيريا سالبة الجرام، يمكن أن يسبب الأمراض الحادة مثل الالتهاب السحائي. دليل على أنه يتغلب على حاجز الظهارية واقية من CP معتمد من قبل الملاحظات التشريحية المرضية في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب السحايا اظهار زيادة كميات المكورات السحائية في الأوعية والخلايا الظهارية CP 9،10. للدخول إلى الخلايا المضيفة باcteria في كثير من الأحيان اختطاف آليات endocytotic، التي تتوسط أو الناجمة عن مستقبلات سطح محددة تقع على الخلايا المضيفة. منذ التفاعلات مسببات الأمراض مع هذه المستقبلات يمكن أن يكون نوعا نماذج محددة 11، الحيوان لا يمكن إلا أن يتم التشاور إلى حد المقيد. يوفر خط الخلية HIBCPP الفرصة لدراسة عملية الغزو، فضلا عن الآليات الجزيئية الكامنة في نظام نموذجي البشري. توظيف إدراج خلية ثقافة تمكننا من تحليل التفاعلات من مسببات الأمراض مع الخلايا المضيفة من الجانبين خلية متميزة. العديد من أنواع البكتيريا، بما في ذلك N. السحائية، تخضع بقوة لتأثير الجاذبية خلال فحوصات العدوى. للتفاعل الأمثل من مسببات الأمراض مع الخلايا HIBCPP خلال فحوصات، تضاف البكتيريا في البداية في المقصورة العليا من نظام إدراج مرشح زراعة الخلايا. لتمكين العدوى من قمية أو الجانب خلية basolateral، على التوالي، وكان شكلان للنظام في المختبر تهتblished: في نظام موحد هي المصنفة خلايا HIBCPP في المقصورة العليا من إدراج مرشح، ومحاكاة الوضع عندما تقع الكائنات الحية الدقيقة على الجانب CSF والحصول على اتصال مع الجانب قمية من الخلايا (الشكل 1A، C). في المقابل، وذلك باستخدام خلايا HIBCPP في ثقافة خلية نظام إدراج مرشح مقلوب يعكس الظروف عندما البكتيريا دخلت مجرى الدم. الكائنات الحية الدقيقة تنشر في الدم وCP قاء الخلايا الظهارية من الجانب basolateral (الشكل 1B، D). الجدير بالذكر، في هذا النظام النموذجي فقد تبين أن البكتيريا تغزو خلايا HIBCPP بطريقة القطبي تحديدا من 5،7 الجانب خلية basolateral.
في وقت لاحق للإصابة من حزب المحافظين، ومسببات الأمراض غزت يمكن التعرف عليه بواسطة النظام الفطري المناعي من خلال ربط لمستقبلات التعرف على نمط (PRRs). أعضاء موصوفة وصفا جيدا للPRRs تنتمي إلى عائلة تول مثل مستقبلات (TLR). يمكن TLRs بند الهياكل مميزة من الكائنات الحية الدقيقة المعدية، التي توصف بأنها أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs). ربط من المستقبلات يؤدي إلى تنشيط الخلية المضيفة مما يشير إلى الشلالات التي تؤدي تعبير عن السيتوكينات و chemokines 12، والتي بدورها تحفز هجرة الخلايا المناعية عبر BCSFB 13،14. ولقد ثبت أن الخلايا HIBCPP تعبر عن عدة TLRs على مستوى مرنا وأن الإصابة بفيروس N. ينتج التهاب السحايا في إفراز السيتوكينات عدة و chemokines، بما في ذلك CXCL1-3، IL6، IL8 وTNFα 15،16.
هنا، نحن تصف زراعة وإصابة خط الخلية البشرية HIBCPP في نظام إدراج الثقافة خلية المقلوب الذي يحاكي BCSFB. ويتيح هذا النظام النموذجي لدراسة التفاعلات من مسببات الأمراض مع الجانب خلية في الجسم الحي basolateral ذات الصلة فضلا عن الاستجابة الخلوية لاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد خلية ثقافة تصفية إدراجات للخلايا البذر HIBCPP في نظام معكوس نموذج
- قبل الدافئة DMEM / F12 (هام) تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الانسولين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 10٪ مصل العجل الجنين (FCS).
- استخدام ملقط معقم لوضع 0.33 سم ² منطقة النمو تصفية خلية ثقافة إدراج مع حجم المسام من 3 ميكرون رأسا على عقب في لوحة ال 12 أيضا (الشكل 1E).
- ملء المتوسطة في حجرة الأدنى من الثقافة خلية مرشح إدراج (حوالي 3 مل) و 100 ميكرولتر على رأس إدراج مرشح. إغراق لوحة وكذلك انخفاض مقصورة مع المتوسط. نضح المتوسطة المفرط في مثل هذه الطريقة التي حجرة أقل من إدراج مرشح يبقى شغل (الشكل 1E).
ملاحظة: من المستحسن استخدام ماصة المصلية لهذه الخطوة. - تغطية لوحة 12-جيدا مع غطاء ونقل إدراج استعداد مرشح زراعة الخلايا إلى الحاضنة، 37 درجة مئوية،5٪ CO 2 حتى إضافة الخلايا.
2. زراعة والركض من خلايا HIBCPP
- إعداد DMEM / F12 (هام) تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل، 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 10٪ FCS.
- المتوسطة قبل الدافئة وبرنامج تلفزيوني في 37 ° C حمام الماء. نضح المتوسطة من القارورة. إضافة 10 مل PBS إلى قارورة ودوامة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- إضافة 3 مل 0.25٪ التربسين-EDTA إلى القارورة ودوامة. وضع في الحاضنة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- بعد ما يقرب من 20 دقيقة إزالة قارورة من الحاضنة. تأكد من أن الخلايا يتم فصل من الجزء السفلي من القارورة وعرض شكل دائري عند شملهم الاستطلاع مع المجهر.
ملاحظة: الخلايا لا تنفصل تماما عن بعضها البعض، وغالبا ما توجد في تكتلات. فمن المستحسن أن استخدام الخلايا حتى مرور 38. - لوقف trypsinization بإضافة 17 مل المتوسطة. resuspend الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا، ونقل تعليقفي أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- resuspend الخلايا في حجم مناسب من المتوسط وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
ملاحظة: إن تركيز خلايا HIBCPP معلق يجب أن تكون 1 × 10 6 خلية / مل. للحفاظ على خلايا HIBCPP يقترح تحويل مبلغ من 1-6 × 10 6 خلايا في 10 مل المتوسطة إلى T75-قارورة. تغيير المتوسط كل يوم الثاني على التوالي.
3. البذر خلية الثقافة مقلوب تصفية إدراجات مع خلايا HIBCPP
- على رأس كل إدراج مرشح المقلوب (أي الجانب السفلي من فلتر) إضافة 80 ميكرولتر من تعليق خلية (أي 8 × 10 4 خلايا) (الشكل 1E).
ملاحظة: تأكد من أن الخلايا توزع بالتساوي في التعليق من قلب الأنبوب قبل البذر. - تغطية إدراج مرشح الثقافة خلايا المصنف مع غطاء لوحة 12-جيدا ونقل إلى الحاضنة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- في اليوم الأول، وملء 1 مل المتوسطة في الآبار من 24 لوحة جيدا. رفع مرشح إدراج ثقافة الخلية باستخدام ملقط للخروج من لوحة ال 12 أيضا، تجاهل المتوسطة داخل، وتحويل إدراج مرشح ووضعها في التوجه الى معيار مستعدة لوحة 24-جيدا (الشكل 1E).
- وضع الخلايا في متوسطة جديدة كل يوم الثاني على التوالي. إعداد 24 بئرا مع متوسطة جديدة ونقل إدراج مرشح لذلك. ملء إدراج مع 0.5 مل متوسطة جديدة. تحقق طير كل يوم كما هو موضح في قسم 4.
- عندما القيم طير من HIBCPP المصنف الخلايا على إدراج ثقافة خلية تتجاوز 70 Ω س سم مربع (حوالي 4 أيام بعد البذر)، ثم يستمر زراعة الخلايا في المتوسط تحتوي على 1٪ FCS و 5 ميكروغرام / مل الانسولين. إعداد 24 لوحات جيدا مع 1 مل المتوسطة لكل بئر. نقل إدراج مرشح لالآبار المعدة وتبادل المتوسطة في المقصورة العليا.
ملاحظة: انسحاب هذا المصل بعد confluency يؤدي إلى تشكيل لإمكانات غشاء أعلى. - نضح المتوسطة من المقصورة مرشح، ونقل إلى معدة إعدادا جيدا وملء مع 500 ميكرولتر المتوسطة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. وضع الخلايا بين عشية وضحاها في الحاضنة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
4. قياس بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير)
- تزج نصائح الكهربائي من voltohmmeter الأنسجة الظهارية لمدة 15 دقيقة في 80٪ من الإيثانول. نقل voltohmmeter تحت غطاء محرك السيارة والسماح القطب الجافة لحظة. وضع القطب في مستنبت منها تستخدم للحصول على الخلايا لمدة 15 دقيقة أخرى للتوازن.
- إجراء قياسات عن طريق وضع ذراع أطول من القطب بحيث يلامس الجزء السفلي من المقصورة أقل في كل مرة، وضع الذراع أقصر في حجرة إدراج مرشح.
ملاحظة: قيم المقاومة مرشح إدراج ثقافة الخلية دون الخلايا في المتوسط يجب أن تستخدم القيم كما فارغة ((القيمة المقاسة (Ω) - قيمة فارغة (Ω)) س فلترالسطح (أي 0.33 سم مربع)). - بعد قياس مكان القطب مرة أخرى إلى 80٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. تخزين في أنبوب الجافة.
5. تحديد Paracellular النفاذية
- حل 1 غرام FITC-سكري في 200 مل المتوسطة ثقافة تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الانسولين 1٪ FCS. تطبيق 50 ميكروغرام / مل من محلول داخل المقصورة مرشح العليا قبل إصابة الخلايا.
- بعد الإصابة جمع عينات المتوسطة من أسفل جيدا لتحديد كيفية تمرير الكثير سكري من المقصورة مرشح من خلال طبقة الخلايا.
- إعداد محلول قياسي FITC-سكري وأداء 1: 2 التخفيفات، 10 مرات (100٪، 50٪، 25٪، 12.5٪، 6.25٪، 3.13٪، 1.56٪، 0.78٪، 0.39٪، 0.2٪ و 0٪) . تحديد مضان بواسطة قياس جميع العينات في قارئ صفيحة.
6. إعداد البكتيريا لإصابة خلايا HIBCPP على زراعة الخلايا تصفية إدراجات
- يوم واحد قبل التجربة، كشط رانه N. المجمدة السحائية سلالات قبالة الجلسرين الأسهم ومسحة من على الشوكولاته آجار مع Vitox. تنمو بين عشية وضحاها في الحاضنة، عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2.
- استخراج 20-30 المستعمرات من الثقافة بين عشية وضحاها، ونقل إلى أنبوب يحتوي على 8 مل البروتيوز ببتون المتوسطة تستكمل مع 0.042٪ NaHCO 3، 0.01 M MgCl 2 و 1٪ Polyvitex.
- يهز البكتيريا مقابل 1.25 ساعة على 220 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 2684 ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف و resuspend بيليه البكتيرية مع 8 مل المصل خالية المتوسطة. دوامة لضمان حتى تعليق.
- لتحديد الكثافة والثقافة، وقياس التخفيف من 1:10 في كثافة بصرية (OD) من 600 نانومتر. ضبط تعليق البكتيرية إلى OD 600 من 0.1.
ملاحظة: هذا تعليق يحتوي تقريبا. 1 × 10 8 كفو / مل. - لتأكيد تركيز الخلية البكتيرية، تمييع تدريجي تعليق (01:10) تصل إلىتخفيف من 10 -5 ولوحة على لوحات الشوكولاته آغار.
ملاحظة: التخفيفات المسلسل مماثلة تحتاج إلى القيام بها لحساب منحنيات النمو البكتيرية.
7. العدوى من خلايا HIBCPP على زراعة الخلايا تصفية إدراج وتحديد البكتيرية الغزو التي كتبها المناعي مزدوج
- بعد استمرار ثقافة خلية في المتوسط تحتوي على 1٪ FCS و 5 ميكروغرام / مل الانسولين، وقياس خلايا كل يوم باستخدام voltohmmeter الأنسجة الظهارية. إذا كانت الخلايا قد وصلت إلى طير نحو 500 Ω س سم ²، تنفيذ العدوى.
- تصيب الخلايا مع تعليق البكتيرية مستعد في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 10. تخزين الخلايا المصابة في الحاضنة، عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 للفترة المشار إليها من الزمن.
ملاحظة: يمكن حساب وزارة الداخلية من خلال مراعاة عدد من الخلايا في خلية ثقافة مرشح إدراج في ملتقى (1.21 × 10 6 خلية / سم 2). - وقف تصيبأيون عن طريق غسل ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر المصل خالية المتوسطة (SFM) يحتوي على الزلال 1٪ المصل البقري (BSA) يطبق على المقصورة فلتر، 1 مل إلى المقصورة أقل.
- منع مع 500 ميكرولتر الإدارة المستدامة للغابات التي تحتوي على العازلة BSA 1٪ في المقصورة مرشح و1 مل في المقصورة أقل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع التصاق الأجسام المضادة لمواقع الربط غير محددة.
- احتضان مع 100 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية لمكافحة N. meningtidis α-المرصد المغربي للسجون (1: 200) في المقصورة فلتر و 500 ميكرولتر في المقصورة أقل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى أن معاير. - غسل الخلايا عن طريق الشفط المتوسطة من المقصورة مرشح، ونقل إدراج مرشح لإعداد SFM جيدا مع 1 مل تحتوي على 1٪ BSA وملء المقصورة مرشح أفرغت مع الإدارة المستدامة للغابات 500 ميكرولتر تحتوي على 1٪ BSA. كرر هذه الخطوة مرتين.
- إصلاح الخلايا مع 500 ميكرولتر 4٪ الفورمالديهايد في المقارنة فلترrtment، 1 مل في المقصورة أقل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا عن طريق الشفط المتوسطة من المقصورة مرشح، ونقل إدراج مرشح لمعدة إعدادا جيدا مع 1 مل برنامج تلفزيوني وملء المقصورة مرشح أفرغت مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
ملاحظة: عينات يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. - خفض زراعة الخلايا الثابتة مرشحات من إدراج وأغسلها مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 250 الفلورسنت ميكرولتر المسمى (الطول الموجي الإثارة 594 نانومتر) الثانوية الضد الدجاج مكافحة الأرانب (1: 500) وصمة عار البكتيريا خارج الخلية.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى أن معاير. - Permeabilize الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل خلايا ثلاث مرات مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA.
- احتضان مع 250 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية لمكافحة N. السحائية
- تطبيق 250 ميكرولتر من الفلورسنت المسمى (الطول الموجي الإثارة 488 نانومتر) الضد الثانوية (1: 500)، فلوري المسمى (الطول الموجي الإثارة 660 نانومتر) Phalloidin (1: 250) و4'، هيدروكلوريد 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) ( 1: 50،000) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لصبغ البكتيريا من خارج وداخل الخلايا، الهيكل الخلوي أكتين ونوى.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى أن معاير. - غسل خلايا ثلاث مرات مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA. تضمين الخلايا في تصاعد المتوسطة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الفحص عن طريق المجهر.
- تحديد عدد من البكتيريا غزت لكل حقل محدد مسبقا. القيام بذلك عن طريق عد 20 حقلا في غشاء الترشيح. حساب النسبة المئوية للبكتيريا بغزو.
ملاحظة: اضرب عدد البكتريا متوسط من 20 حقلا المجهرية مع كوفيك منطقةient. نتيجة تعبر عن كمية من مجموع البكتيريا الموجودة في 0.33 سم ² زراعة الخلايا مرشح إدراج. تقسيم هذه القيمة بمقدار البكتيريا نما في وسائل الإعلام خلال مدة الإصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا وصف زراعة وإصابة خلايا HIBCPP في نظام إدراج الثقافة خلية مقلوب. هذا النموذج يسمح لنا لدراسة آليات الغزو والكامنة مسارات الإشارات الجزيئية من الجانب خلية basolateral، استنساخ الوضع الفسيولوجي للبكتيريا نشر ودخول الخلايا الظهارية عبر مجرى الدم (الشكل 1).
الخلايا HIBCPP عرض وظائف معينة حاجز، التي تمكنها من تقييد صرف الجزيئي إلى مستوى الحد الأدنى. ويتحقق ذلك عن طريق التعبير عن الملتصقة تقاطع (AJ) والبروتينات مفرق ضيق (TJ). وكشف التحليل المناعي من البروتينات المرتبطة TJ-Occludin، Claudin وZO-1 إشارة متواصلة في مواقع خلية خلية الاتصال، مما يدل على أن خلايا مترابطة بواسطة خيوط مستمرة من TJS (الشكل 2A، B، C). والانطباع مفصل روقال انه تم الحصول عليها TJ مورفولوجيا عن طريق الإرسال (الشكل 2D) وتجميد المجهر كسر الإلكترون (الشكل 2E)، مما يدل على ان تقع TJS بين الخلايا وتشكيل مزجها الهياكل واسعة، مثل كابل.
TJS من الخلايا الظهارية أيضا بمثابة سياج لفصل المجالات غشاء قمي وbasolateral، وبالتالي المساهمة في قطبية الخلوية. بين البروتينات والتي يتم التعبير عنها بشكل حصري على الجانب خلية basolateral من الخلايا HIBCPP، هي بروتين AJ E-كادهيرين (ECAD)، وعامل النمو الكبدية مستقبلات (HGF / الحد) كما يتضح من التحليل المناعي في الشكل (3)، لافتا إلى مستوى معين من الاستقطاب.
عندما مثقف تحت الظروف المناسبة خلايا HIBCPP أيضا يحمل وظائف حاجز نموذجية من BCSFB مثل تشكيل غشاء المحتملة وكذلك نفاذية منخفضة لmacromoleجزيئات. تقرير إمكانات غشاء يمكن أن يتحقق عن طريق قياس طير مع استخدام voltohmmeter. وكميا نفاذية طبقة الخلايا عن طريق تطبيق FITC المسمى سكري، السكر الذي يمر على طبقة بطريقة paracellular. هنا، وتبين لنا نتائج التجربة التمثيلية، مما يدل على أن هذه الوظائف حاجز لا تزال مستقرة وتظهر أي مودة تركيزات القياسية من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، مذيب المشترك للمواد الكيميائية خلية محفزة. كما يمكن أن يرى في الشكل 4A، سجلت القيم طير قبل وبعد التعرض للخلايا HIBCPP إلى DMSO.
عرض في خلايا غشاء المحتملة العالية التي وصلت الى حوالي 500 Ω س سم ² في بداية التجربة لجميع الظروف. وقال إن طير قياس لا تغيير بعد 2 ساعة للخلايا تعامل مع ما يصل إلى 0.2 المجلد٪ DMSO. في المقابل، انخفضت قيم طير في تعتمد على الجرعة ذوي الخوذات البيضاء بطريقةأون طبقت كميات أكبر (الشكل 4A). وكان هذا الانخفاض في غشاء المحتملة يصاحب ذلك مع زيادة نفاذية للجزيئات. في حين أن إضافة DMSO إلى خلايا HIBCPP لم تصل إلى 0.5٪ المجلد لا يؤدي إلى زيادة نفاذية للسكري (1)، المجلد٪ و 2٪ المجلد عرض تأثير، وإن كان بدرجة المقيدة (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، نحن فحص تأثير مثبط حركة الخلايا D، المانع من امكانات بلمرة الأكتين، على غشاء المحتملة ونفاذية الخلايا HIBCPP. علاج الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل مثبط حركة الخلايا D يؤدي إلى انخفاض كبير في قيم طير وكذلك زيادة في FITC-سكري تدفق (الشكل 4A، B). بهذا المعنى يمكن تفسير افتتاح TJS الناجمة عن مثبط حركة الخلايا د.
خط الخلية HIBCPP كنموذج للBCSFB يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين الكائنات الممرضة والخلايا الظهارية تشكيل حاجز. هناك دليلأن ن البكتيريا السحائية المكاسب دخول إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق عبور BCSFB. وقد تبين أن النيسرية غزو خلايا HIBCPP تحديدا من الجانب خلية basolateral، والتي هي ذات الصلة في الجسم الحي. وخلال هذه العملية الكبسولة البكتيرية تلعب دورا هاما: المسوخ، تفتقر إلى كبسولة تظهر زيادة الغزو إلى خلايا HIBCPP 5. في ما يلي قارنا الغزو basolateral من MC58 السلالة 17، في متحولة إسوي MC58siaD - نقص في إنتاج كبسولة 17 والناقل unencapsulated عزل α14 19،20. والخلايا المصابة HIBCPP مع السلالات المذكورة أعلاه على مدار الساعة من 4 ساعات في وزارة الداخلية من 10. التحليل المناعي كشف غزو كبير لاثنين من السلالات المسببة للأمراض MC58 وMC58siaD -، في حين لوحظت معدلات الغزو طفيفة فقط لسلالة α14 apathogenic ( الشكل 5A). صورة ممثلة للimmunoflu مزدوجيظهر الفحص المجهري orescence الخلايا HIBCPP مصابة بسلالة منها في الشكل 5A، B و C.
الشكل 1: عادي ونظام خلية الثقافة مقلوب يمكن التحقيق في خلية نظام الثقافة القياسية (A، C) تفاعل البكتيريا مع الخلايا الظهارية CP في الجانب خلية القمي، الذي دل عليه الزغيبات الصغيرة. نظام زراعة الخلايا مقلوب (B، D) يسمح لنا لدراسة تفاعل البكتيريا مع غشاء الخلية basolateral، التي تشارك خلال الغزو البكتيري عبر مجرى الدم إلى الجهاز العصبي المركزي. لزراعة الخلايا مقلوب هي المصنفة الخلايا (E) HIBCPP على الجانب السفلي من إدراج مرشح. فتفيض جيدا أقل بما في ذلك المقصورة الداخلية لإدراج مرشح مع المتوسط. Subsequمستديم، ويستنشق المتوسط المفرط في مثل هذه الطريقة التي المقصورة الداخلية لإدراج مرشح يبقى شغل. في اليوم الأول بعد الغرس، وانقلبت إدراج مرشح زراعة الخلايا على ومليئة المتوسطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خلايا HIBCPP عرض السواحل المستمر من TJS البروتينات TJ ZO-1 (A)، تم الكشف عن Occludin (ب) وClaudin-1 (C) في الخلايا HIBCPP. لوحات AC تظهر الصور Apotome. مركز كل لوحة: س ص أون عرض الوجه من الخلايا. الجانب العلوي والأيسر: المقاطع العرضية من عدة شرائح البصرية من خلال Z -plane. وتشير الحانات نطاق 10 ميكرون. تم تحليل هيكل TJ الخلايا HIBCPP التي كتبها transmisسيون المجهر الإلكتروني. الخلايا بعضها بعضا عن طريق TJS، والتي يتضح من السهام (D). ويشير الشريط على نطاق و1 ميكرون. تجميد دراسات المجهر كسر الإلكترون تصور عن كثب مزجها خيوط TJ (E). شريط مقياس = 0.5 ميكرون. الصور في هذا الرقم ونشرت أصلا في Schwerk وآخرون، بلوس احد 7: e30069، دوى: 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012)؛ إعادة طبع بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): التعبير عن البروتينات المستقبلة المعنية خلال غزو البكتيريا في HIBCPP خلايا يعرض التحليل المناعي تعبير عن ECAD (A) والأرصاد (ب) في الجانب خلية basolateral. وpicturوفاق تظهر الصور Apotome. مركز كل لوحة: س ص أون عرض الوجه من الخلايا. العلوي والجانب الأيمن: المقطع العرضي من عدة شرائح البصرية من خلال Z -plane. يتم وضع غشاء قمي من الخلايا HIBCPP (المشار إليها السهام) نحو الجزء العلوي من الجزء العلوي، وكذلك نحو اليمين من الجانب الأيمن، على التوالي، من كل إطار. الحانات النطاق = 10 ميكرون. ونشرت بيانات في هذا الرقم أيضا قبل في Gründler وآخرون، الميكروبات تصيب 15: 291-301، دوى:. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013)؛ إعادة طبع بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير DMSO ومثبط حركة الخلايا D على الحاجز وظيفة خلايا HIBCPP التأثيرات على ظائفها الحاجز.يتم تحديد نشوئها بواسطة قياس القيم طير وFITC-سكري-الجريان. وأظهرت نتائج تجربة تمثيلية واحدة، والتي أجريت في يثلث. تم علاج خلايا HIBCPP مع DMSO وكذلك Cytochlalasin D في المبالغ المشار إليها لمدة 2 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
عند تطبيقها في تركيزات تصل إلى 0.2 المجلد٪، دمس لا يؤثر على غشاء المحتملة (الشكل 4A). بتركيزات تتراوح بين 0.1 المجلد٪ لتصل إلى 0.5 المجلد٪ من DMSO أيضا لا تؤثر على نفاذية paracellular من الخلايا (الشكل 4B). في المقابل، 1 ميكروغرام / مل مثبط حركة الخلايا D يسبب انخفاضا في طير مع ما يصاحب ذلك زيادة في FITC-سكري-الجريان من خلال طبقة الخلايا (الشكل 4A، B).
الرقم 5: غزو N. السحائية في خلايا HIBCPP. المناعي مزدوج يظهر الفحص المجهري للغزو (الخضراء) والالتزام البكتيريا (الصفراء). المربعات البيضاء داخل الصور تمثل التفاصيل الصورة المكبرة على الجانب الأيمن. وقد لوحظ غزو Basolateral لN. السحائية سلالات MC58 (A) وMC58siaD - نقص في إنتاج كبسولة (B)، في حين تم تحديد فقط معدل الغزو طفيفة لα14 (C). يوضح الرسم البياني إلى أن معدلات غزو MC58 وMC58siaD - عدد كبير للغاية بالمقارنة مع α14 (**، ف <0.01). يتم عرض أهمية قصوى عندما MC58 أو MC58siaD -، على التوالي، وبالمقارنة مع α14 (***، ف <0.001) وMC58siaD - تم مقارنة MC58 (###، ص <0.001). على نطاق ويمنع إنديكاالشركة المصرية للاتصالات 10 ميكرون. . الرسم البياني في D نشرت أصلا في بوركووسكا وآخرون، J Neuroinflammation 11: 163، دوى: 10.1186 / s12974-014-0163-س (2014)؛ إعادة طبع بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الظهارية للCP تشكل BCSFB الذي يفصل بين السائل النخاعي من 2،3 الدم. أنشأنا مؤخرا خط الخلية HIBCPP كنموذج البشري الوظيفي للBCSFB. الخلايا عرض وظائف حاجز مهمة من BCSFB في المختبر، بما في ذلك تطوير إمكانات غشاء عالية، ونفاذية منخفضة عن الجزيئات، وكذلك وجود خيوط مستمرة من TJS 5. وتساهم البروتينات TJ إلى قطبية قمي / basolateral من الخلايا. الاستقطاب هو من أهمية كبيرة لتوطين موجهة من المستقبلات السطحية وكذلك البروتينات نقل محددة. لقد أظهرنا توطين القطبي من المستقبلات ECAD والأرصاد الجوية، وكذلك أعضاء كاسيت ملزمة ATP (ABC) أسرة الناقل الذي يحافظ على المكروية رقابة شديدة داخل الجهاز العصبي المركزي 6،7.
وهناك العديد من الكائنات الحية الدقيقة التي تكون قادرة على الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق التغلب على BCSFB، الشجريةز لمرض شديد بما في ذلك التهاب السحايا 8. واحدة من مسببات الأمراض التي هي قادرة على غزو الخلايا الظهارية في CP هي سلبية الغرام البكتيريا N. محددة البشرية السحائية 9،10، وهو ما ثبت لدخول خلايا HIBCPP بطريقة القطبي وتحديدا من الجانب خلية basolateral 5. هذا هو الاتجاه ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للإصابة الدماغ عبر BCSFB عندما تنشر البكتيريا والخلايا الظهارية لقاء CP من الدم أثناء التهاب السحايا. لتعكس هذا الوضع في المختبر، وتزرع الخلايا HIBCPP على الجانب السفلي من مرشح. وعلى النقيض من نموذج إدراج مرشح القياسية، حيث هي المصنفة الخلايا في المقصورة العليا، وهذه المجموعة تتكون من نظام الثقافة المقلوب يسمح لتصيب الخلايا الظهارية وتحديدا من الجانب خلية basolateral 5،21.
وقد لوحظ غزو Basolateral إلى خلايا HIBCPP لN. الإمراض اثنين السحائية -، في حين أن الناقل غير المسببة للأمراض عزل α14 عرض فقط الغزو هامشية 15. وهذا يوضح أن نموذج خلية HIBCPP يوفر إمكانية لفحص المكتبات متحولة المتاحة لعوامل الفوعة رواية المعنية خلال عملية الغزو. الجدير بالذكر، فقد ثبت أن مسببات الأمراض الأخرى بما في ذلك L. اللستيريا والمكورات السبحية (س. الخنزيرية) تغزو خلايا HIBCPP بطريقة القطبي 5،7.
من أجل الاعتراف والرد على غزو الكائنات الحية الدقيقة في الجهاز العصبي المركزي، والخلايا الظهارية للCP تعبر عن PRRs 22،23. TLRs تمثل عائلة الهامة في PRRs. النوعية RT-PCR التحليلات أظهرت أن الخلايا HIBCPP تعبر عن عدة TLRs وكذلك ذات الصلة شارك في مستقبلات وجزيء محول MyD88 15. وقد لوحظ أن هذه المستقبلات TLR2 وTLR4 يشاركون في رد فعل الدفاع الخلوية إلى N. meningitidis السكريات محفظية 24. وكشفت نتائج أخرى من نهج ميكروأري أن الخلايا المصابة HIBCPP مع N. عرض السحائية لمحة تعريفية مسارات نقل الإشارة، من بين عوامل أخرى تشمل أيضا تنظيم النسخ IκBζ 15، إلزامية للتعبير عن الجينات المستهدفة معينة بما في ذلك il6 25،26، خلوى المؤيدة للالتهابات.
لتأكيد هذه النتائج، والخلايا المصابة HIBCPP مع N. وقد استخدمت السحائية في نظام الثقافة مقلوب للتحقيق في إطلاق السيتوكينات و chemokines. ومن المعروف أن هذه العملية تهدف إلى إثارة استجابة التهابية من تفعيل الفطرية 13،14 الجهاز المناعي. خلايا HIBCPP إنتاج وإفراز السيتوكينات و chemokines، بما في ذلك CXCL1-3، IL6، IL8 وTNFα 15،16، التي وصفت لجذب العدلات وحيدات 27. من خلال توظيف لدينا نظام نموذجيوجدت أن العدلات polymorphnuclear، وحيدات، وكذلك الخلايا اللمفية تي تهاجر من خلال خلايا HIBCPP 16،28، مؤكدا أن الخلايا HIBCPP هي مناسبة لفك رموز آليات الهجرة بطريق الظهارة من الخلايا المناعية.
كما يقدم هنا عرض نموذج النظام الفرصة للتعديلات. خلايا HIBCPP يمكن سابقة التجهيز مع الأجسام المضادة أو مثبطات الكيميائية لتحديد مستقبلات وإشارة مسارات نقل المشاركين خلال العدوى. [دمس]، مذيب مشترك لخلية تحفيز الكواشف يمكن تطبيقها في أحجام مناسبة للخلايا HIBCPP، والتي تعرض وظائف حاجز المستقرة التي لا تتأثر الكيميائية طوال الوقت التحقيق. هذه الخاصية هي أيضا ذات الصلة لاستخدام نموذج في الدراسات الدوائية.
على الرغم من أننا قد أظهرت أن الخلايا HIBCPP تظهر على مستوى معين من الاستقطاب، وأنها لا تعكس بطبيعة الحال كل تفصيل من تفاصيل نموذج في الجسم الحي. <م> على سبيل المثال توطين ABC أفراد الأسرة نقل مباريات فقط جزئيا الأنماط المتوقعة 6، لماذا يمكن ربما فقط أن يطبق التطبيقات الصيدلانية إلى حد المقيد. أيضا، فإن الخلايا HIBCPP لا يبدو أن إنتاج السائل النخاعي (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، فقد وجدنا أن الخلايا HIBCPP تعبر عن البروتينات Transthyretin، الذي يشبه الانسولين عامل النمو 2 (IGF2) وصندوق forkhead J1 (FOXJ1) على مستوى الحمض النووي الريبي 5، التي هي بروتينات علامة مميزة للخلايا الظهارية CP 29،30،31،32 . وتدعم هذه الملاحظة أن الخلايا HIBCPP قد احتفظت الخصائص النموذجية للخلايا الظهارية CP. الأهم من ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا HIBCPP لا تقدم تثبيط للإتصال به. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن استخدام الخلايا لإجراء التجارب عندما يتم التوصل إلى قيم طير المناسبة. وعلاوة على ذلك، لا ينبغي أن تستخدم الخلايا HIBCPP وراء مرور 38 عاما منذ القدرة على تطوير وظيفة الحاجز يبدو أن تنخفض مع مقاطع أعلى. وأخيرا، لدراسة عفريتأن فعل التفاعلات خلية خلية خلال العدوى في BCSFB نموذجا ثقافة مشتركة تتألف من الظهارية CP والبطانية تكون ذات فائدة عالية، ولكن مثل هذا النموذج لا تزال بحاجة إلى تطوير.
في الختام، نموذج ثقافة الخلية HIBCPP يمكن استخدامها للكشف عن مسارات الغزو الرئيسية والأساسية مسارات نقل الإشارة، لا سيما من مسببات الأمراض محددة البشرية في BCSFB. كما أنه من المعروف أن الخلايا الظهارية للبرنامج القطري ويشارك أيضا في الاضطرابات التنكسية العصبية بما فيها أمراض الزهايمر وكذلك التصلب المتعدد 2، وأيضا في ورم خبيث في الدماغ من الخلايا السرطانية 33، يوفر النظام بشكل عام على مجموعة كبيرة ومتنوعة من الفرص للتحقيق في الآليات المتعلقة المرض، وتوفير القدرة على إيجاد أهداف علاجية جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
