Introduction
Blod-cerebrospinalvæske barriere (BCSFB) er en af de tre barriere sites mellem blodet og hjernen 1. Dens morfologiske korrelat er de epitelceller i choroid plexus (CP) 2,3, en endotel-epitel sammenfoldede, som er stærkt vaskulariseret og placeret i ventriklerne i hjernen. CP tjener til frembringelse cerebrospinalvæsken (CSF) samt at adskille dem fra blodet. For at opnå barrierefunktion, CP epitelceller viser en lav pinocytotic aktivitet, udtrykke specifikke transportører, og er tæt forbundet med en kontinuerligt netværk af tight junctions (TJs) 2,3.
Human choroid plexus papillom (HIBCPP) celler, der er afledt af en malign choroid plexus papilloma af en japansk kvinde 4, blev anvendt til at konstruere en funktionel in vitro model af BCSFB. HIBCPP celler viser et par karakteristika for en funktionel BCSFB dannelsen af TJtråde, udvikling af en høj transepithelial membran potentiale, der kan bestemmes som transepithelial elektriske modstand (TEER), og mindre permeabiliteter til makromolekyler. Desuden HIBCPP celler udtrykker karakteristiske transportører, der kan tjene til at regulere den ioniske mikromiljø, og viser apikale / basolaterale polaritet 5,6,7.
Den BCSFB har vist sig at fungere som en indgang site for patogener (bakterier, virus og svampe) i centralnervesystemet (CNS) 8. Invasionen af patogener, herunder Neisseria meningitidis (N. meningitidis), en Gram-negativ bakterie, kan forårsage alvorlige sygdomme som meningitis. Bevis for, at den overvinder den beskyttende epitel barriere af CP er støttet af histopatologiske observationer i patienter med meningokoksygdom udviser forøgede mængder af meningokokker i skibene og CP epitelceller 9,10. For at få adgang i værtsceller bacteria ofte kapre endocytotiske mekanismer, som medieres eller udløses af specifikke overfladereceptorer placeret på værtscellerne. Da interaktioner af patogener med disse receptorer kan være artsspecifikke 11, dyremodeller kan kun høres i begrænset omfang. Den HIBCPP cellelinien giver mulighed for at studere invasionen proces samt de underliggende molekylære mekanismer i et humant modelsystem. Anvender cellekultur indsætter kan vi analysere interaktioner af patogener med værtsceller fra to forskellige celle sider. Mange bakterier, herunder N. meningitidis, er stærkt underlagt virkningen af tyngdekraften under infektion analyser. For optimal interaktion af patogener med HIBCPP celler under assayene bakterierne oprindeligt tilsat til det øvre kammer i cellekultur filterindsatsen system. At muliggøre infektion fra det apikale eller den basolaterale celle side, henholdsvis har to variationer af in vitro system været established: I standardsystem HIBCPP celler podes ind i det øvre kammer af filterindsatsen, efterligne situationen, når mikroorganismer er placeret på CSF-side og komme i kontakt med den apikale side af cellerne (figur 1A, C). I modsætning hertil ved hjælp af de HIBCPP celler i et omvendt cellekultur filterindsats systemet afspejler vilkårene når bakterier har indtastet blodbanen. Mikroorganismer formidler i blodet og støder CP epitelceller fra den basolaterale side (figur 1B, D). Bemærkelsesværdigt, i dette modelsystem er det blevet vist, at bakterier invaderer HIBCPP celler i et polært mode specifikt fra den basolaterale celleside 5,7.
Efterfølgende til infektion af CP, kan de invaderede patogener genkendes af det medfødte immunsystem gennem ligation til mønster-genkendelse receptorer (PRRS). Velbeskrevne medlemmer af PRRS tilhører Toll-lignende receptor (TLR) -familien. TLRs kan bind til karakteristiske strukturer af infektiøse mikroorganismer, der betegnes patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs). Ligering af receptorerne resulterer i aktivering af værtscelle signaleringskaskader, der udløser ekspressionen af cytokiner og chemokiner 12, som igen stimulerer transmigration af immunceller over BCSFB 13,14. Det er blevet vist, at HIBCPP celler udtrykker adskillige TLR'er på mRNA-niveau og at infektion med N. meningitidis resulterer i sekretion af adskillige cytokiner og chemokiner, herunder CXCL1-3, IL6, IL8 og TNFa 15,16.
Her beskriver vi dyrkning og infektion af den humane cellelinie HIBCPP i en omvendt celledyrkningsinsert system, der efterligner BCSFB. Denne model system muliggør at studere interaktioner af patogener med in vivo relevante basolaterale celle side samt den efterfølgende cellulære respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Cell Culture Filter Indsatser til Seeding HIBCPP Celler i en omvendt Model System
- Pre-varm DMEM / F12 (Ham) suppleret med 5 pg / ml insulin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% føtalt kalveserum (FCS).
- Brug steril pincet til at placere 0,33 cm² vækstområde cellekultur filterindsatse med en porestørrelse på 3 um på hovedet ind i en 12-brønds plade (figur 1E).
- Fyld medium ind i det nedre rum i cellekultur filterindsatsen (ca. 3 ml) og 100 pi oven på filterindsatsen. Oversvømme pladen samt det nedre rum med medium. Aspirer overdreven medium på en sådan måde, at det nedre kammer af filterindsatsen forbliver fyldt (figur 1E).
Bemærk: Det anbefales at bruge en serologisk pipette til dette trin. - Dække 12-brønds plade med låget og overføre forberedt cellekultur filterindsatse til inkubatoren, 37 ° C,5% CO2, indtil tilsætning af celler.
2. Dyrkning og Passage af HIBCPP Cells
- Forbered DMEM / F12 (Ham) suppleret med 5 pg / ml, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% FCS.
- Pre-varm medium og PBS i et 37 ° C vandbad. Aspirer medium fra kolben. Tilsæt 10 ml PBS til kolben og hvirvel. Gentag dette trin én gang.
- Tilsæt 3 ml 0,25% trypsin-EDTA til kolben og hvirvel. Placer i rugemaskine 37 ° C, 5% CO2.
- Efter ca 20 min fjerne kolben fra inkubatoren. Sikre, at cellerne er frigjort fra bunden af kolben og vise en rund form, når undersøgt med mikroskop.
Bemærk: De celler ikke løsnes fuldstændigt fra hinanden og findes ofte i agglomerater. Det anbefales at anvende cellerne op til passagen 38. - For at stoppe trypsinisering tilføje 17 ml medium. Resuspender cellerne ved pipettering op og ned og overfør suspensionenI et 50 ml rør. Centrifuger ved 50 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne i et passende volumen af medium og tælle cellerne ved anvendelse af et hæmocytometer.
Bemærk: Koncentrationen af resuspenderede HIBCPP celler bør være 1 x 10 6 celler / ml. Til vedligeholdelse af HIBCPP celler foreslås det at overføre et beløb på 1-6 x 10 6 celler i 10 ml medium til en T75-kolbe. Skift medium hver anden dag.
3. Seeding Omvendt Cell Culture Filter Indstik med HIBCPP Cells
- Oven på hver inverteret filterindsats (dvs. undersiden af filteret) tilsæt 80 pi cellesuspension (dvs.. 8 x 10 4 celler) (figur 1E).
Bemærk: Sørg for, at cellerne er jævnt fordelt i suspensionen ved at vende røret før såning. - Dæk podede-cellekultur filterindsatse med låget på 12-brønds plade og overførsel til inkubatoren, 37 ° C, 5% CO 2.
- På den første dag, fylde 1 ml medium i brøndene på en 24-brønds plade. Løft cellekultur filterindsatse ved hjælp af pincet ud af de 12 brønde, kasseres mediet inde, drej filteret indsætter og placere dem i standard orientering i den forberedte 24 brønde (figur 1E).
- Placer cellerne i frisk medium hver anden dag. Forbered 24-brønde med frisk medium og overføre filterindsatse til det. Fyld skær med 0,5 ml frisk medium. Tjek TEER hver dag som beskrevet i afsnit 4.
- Når TEER værdier af HIBCPP podet-celler på cellekultur-indsatse overstiger 70 Ω x cm (ca. 4 dage efter podning), derefter fortsættes cellekultur i medium indeholdende 1% FCS og 5 ug / ml insulin. Forbered 24-brønds plader med 1 ml medium i hver brønd. Overfør filterindsatse til de forberedte brønde og udveksling medium i det øvre rum.
Bemærk: Denne serum tilbagetrækning efter sammenflydning fører til dannelsen afen højere membranpotentiale. - Aspirer medium fra filterrummet, overføre til forberedt godt og fyldes med 500 pi medium. Gentag dette trin én gang. Sætte cellerne natten over i inkubatoren, 37 ° C, 5% CO2.
4. Måling af transepitelialt elektrisk modstand (TEER)
- Fordyb elektroden tips af epitelvæv voltohmmeter i 15 minutter i 80% ethanol. Overfør voltohmmeter under kølerhjelmen og lad elektrode tørre et øjeblik. Placer elektrode ind i respektive dyrkningsmedium anvendes til cellerne i yderligere 15 minutter til ækvilibrering.
- Udføre målinger ved at positionere længere arm af elektroden, så det rører bunden af det nedre kammer hver gang placeres kortere arm ind filterindsatsen rum.
Bemærk: Resistance værdier af cellekultur filterindsatse uden celler i medium bør anvendes som blanke værdier ((målt værdi (Ω) - blank værdi (Ω)) x filteroverflade (dvs. 0,33 cm)). - Efter måling sted elektroden tilbage i 80% ethanol i 15 minutter. Opbevares tørt rør.
5. Bestemmelse af paracellulær permeabilitet
- Opløs 1 g FITC-Inulin i 200 ml dyrkningsmedium suppleret med 5 pg / ml insulin 1% FCS. Påfør 50 ug / ml af opløsningen i den øvre filterrummet før infektion af cellerne.
- Efter infektion indsamle mediumprøver fra den nedre brønd for at bestemme, hvor meget Inulin øjeblikkeligt fra filterrummet gennem cellelaget.
- Forbered en FITC-Inulin standardløsning og udfører 1: 2 fortyndinger, 10 gange (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% og 0%) . Bestem fluorescens ved måling af alle prøver i mikropladelæser.
6. Udarbejdelse af Bakterier til infektion af HIBCPP Cells på Cell Culture Filter Indsætter
- En dag før forsøget, skrabe than frosne N. meningitidis stammer fra en glycerol-lager og streak ud på Chocolate Agar med Vitox. Vokse natten i inkubatoren ved 37 ° C, med 5% CO2.
- Uddrag 20-30 kolonier fra overnatskulturen og overføres til et rør indeholdende 8 ml proteosepepton Medium suppleret med 0,042% NaHCO3, 0,01 M MgCl2 og 1% Polyvitex.
- Ryst bakterierne i 1,25 time ved 220 rpm, 37 ° C. Pelletere bakterierne ved centrifugering ved 2.684 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres og resuspender bakterielle pellet med 8 ml serum-frit medium. Vortex for at sikre en jævn suspension.
- Til bestemmelse kultur densitet, måle en fortynding på 1:10 ved en optisk densitet (OD) på 600 nm. Juster bakteriesuspensionen til en OD 600 på 0,1.
Bemærk: Denne suspension indeholder ca.. 1 x 10 8 CFU / ml. - For at bekræfte den bakterielle cellekoncentration, fortyndes suspensionen trinvis (1:10) op til enfortynding af 10 -5 og pladen oven på chokoladeagar plader.
Bemærk: Lignende seriefortyndinger skal udføres for at beregne bakterielle vækstkurver.
7. Infektion af HIBCPP Cells på Cell Culture Filter Inserts og Bestemmelse af bakteriel invasion Dobbelt Immunofluorescens
- Efter fortsatte cellekultur i medium indeholdende 1% FCS og 5 ug / ml insulin, måle celler hver dag under anvendelse af et epitelvæv voltohmmeter. Hvis cellerne har nået en TEER på omkring 500 Ω x cm, udføre infektionen.
- Inficere cellerne med den fremstillede bakteriesuspension ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10. Opbevar de inficerede celler i inkubatoren ved 37 ° C, med 5% CO2 i den angivne tidsperiode.
Bemærk: Den MOI kan beregnes under hensyntagen til antallet af celler pr cellekultur filterindsats ved konfluens (1,21 x 10 6 celler / cm2). - Stop inficereion ved at vaske tre gange med 500 pi serum-frit medium (SFM) indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) anvendes til filterrummet, 1 ml til det nedre rum.
- Bloker med 500 pi SFM indeholdende 1% BSA buffer i filterrummet og 1 ml i det nedre rum i 20 min ved stuetemperatur for at forhindre vedhæftning af antistoffer mod uspecifikke bindingssteder.
- Inkuber med 100 pi primære antistof anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) i filterrummet og 500 pi i det nedre rum i 20 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal titreres koncentration antistoffet. - Vask cellerne ved aspiration mediet fra filterrummet, overføres filterindsatsen til en forberedt godt med 1 ml SFM indeholdende 1% BSA og fylde tømte filter rum med 500 pi SFM indeholdende 1% BSA. Gentag dette trin to gange.
- Fix celler med 500 pi 4% formaldehyd i filteret virksomrtment, 1 ml i det nedre rum i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne ved aspiration mediet fra filterrummet, overføres filterindsatsen til en forberedt godt med 1 ml PBS og fylde tømte filter rum med 500 pi PBS. Gentag dette trin én gang.
Bemærk: Prøver kan opbevares natten over i PBS ved 4 ° C. - Cut fast cellekultur filtrerer af indsatserne og vask med 250 pi PBS indeholdende 1% BSA. Cellerne inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur med 250 pi fluorescensmærket (excitationsbølgelængde 594 nm) sekundært antistof kylling anti-kanin (1: 500) til at farve ekstracellulære bakterier.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal titreres koncentration antistoffet. - Permeabilisere cellerne med 250 pi PBS indeholdende 1% BSA og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved stuetemperatur. Vask cellerne tre gange med 250 pi PBS indeholdende 1% BSA.
- Inkuber med 250 pi primære antistof anti N. meningitidis
- Påfør 250 ul fluorescerende mærket (excitation bølgelængde 488 nm) sekundært antistof (1: 500), fluorescerende mærket (excitation bølgelængde 660 nm) Phalloidin (1: 250) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI) ( 1: 50.000) i 1 time ved stuetemperatur for at farve ekstra- og intracellulære bakterier, actin cytoskeleton og kerner.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal titreres koncentration antistoffet. - Vask cellerne tre gange med 250 pi PBS indeholdende 1% BSA. Integrer cellerne i montering medium og opbevares ved 4 ° C indtil undersøgelse via mikroskop.
- Bestem antal invaderede bakterier pr foruddefineret område. Gør dette ved at tælle 20 felter pr filter membran. Beregn procentdelen af invaderede bakterier.
Bemærk: Multiplicer den gennemsnitlige bakterietal de 20 mikroskopiske felter med et areal coefficient. Resultatet udtrykker mængden af totale bakterier i en 0,33 cm cellekultur filterindsats. Divider denne værdi med mængden af bakterier dyrket i medier under varigheden af infektionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi dyrkning og infektion af HIBCPP celler i et omvendt celledyrkningsinsert system. Denne model tillader os at studere invasion mekanismer og de underliggende molekylære signalveje fra den basolaterale celle side, frembringes et fysiologisk forhold af bakterier udbreder og ind epitelceller via blodbanen (figur 1).
De HIBCPP celler vise bestemte barriere funktioner, som gør dem i stand til at begrænse molekylær udveksling til et minimalt niveau. Dette opnås ved ekspression af adherens junction (AJ) og tight junction (TJ) proteiner. Immunofluorescensanalyse af TJ-associerede proteiner Occludin, claudin og ZO-1 afslørede en uafbrudt signal på stederne for celle-celle-kontakt, hvilket viser, at cellerne er indbyrdes forbundet ved hjælp af kontinuerlige strenge af TJs (figur 2A, B, C). En detaljeret indtryk af than TJ morfologi er blevet opnået ved transmission (figur 2D) og fryse fraktur elektronmikroskopi (figur 2E), hvilket viser, at TJs er placeret mellem cellerne og danner brede, maskenet kabel-lignende strukturer.
TJs af epitelceller også fungere som et hegn for at adskille apikale og basolaterale membran domæner og dermed bidrage til cellulære polaritet. Blandt de proteiner, som udelukkende udtrykkes på den basolaterale celle side af HIBCPP celler, er de AJ protein E-cadherin (ECAD) og hepatocytvækstfaktor receptor (HGF / Met) som vist ved immunofluorescens-analyse i figur 3, der peger på en vis grad af polaritet.
Når den dyrkes under passende betingelser HIBCPP celler udviser også typiske barriere funktioner BCSFB ligesom dannelsen af et membranpotentiale samt en lav gennemtrængelighed for macromolecules. Bestemmelse af membranpotentialet kan opnås ved måling af TEER med brug af en voltohmmeter. Permeabiliteten af cellelaget kvantificeres ved anvendelse af FITC-mærket Inulin, en sukker, som passerer de lag i en paracellulær mode. Her viser vi resultaterne af et repræsentativt eksperiment, der viser, at disse barrierefunktioner forblive stabil og viser ingen ømhed ved standard koncentrationer af dimethylsulfoxid (DMSO), et fælles opløsningsmiddel for cellestimulerende kemikalier. Som det kan ses i figur 4A, blev TEER-værdier registreres før og efter eksponering af HIBCPP celler til DMSO.
Cellerne viste en høj membranpotentiale, der nåede op til ca. 500 Ω x cm ved begyndelsen af forsøget for alle betingelserne. Den målte TEER ændredes ikke efter 2 timer for celler behandlet med op til 0,2 vol% DMSO. I modsætning hertil TEER værdier faldt i et dosisafhængig måde whda større mængder blev anvendt (figur 4A). Denne reduktion i membran potentialet var samtidig med en øget permeabilitet for makromolekyler. Betragtninger tilsætning af DMSO til HIBCPP celler op til 0,5 vol% ikke resultere i en permeabilitet stigning for Inulin, en vol% og 2 vol% viste en effekt, om end i begrænset omfang (figur 4B). Endvidere kontrolleres vi indflydelsen af Cytochalasin D, en potent inhibitor af actinpolymerisation, på membranpotentiale og permeabilitet HIBCPP celler. Behandling af cellerne med 1 ug / ml Cytochalasin D bevirker en betydelig dråbe TEER-værdier samt en stigning i FITC-Inulin flux (Figur 4A, B). Denne effekt kan forklares ved åbningen af TJs forårsaget af Cytochalasin D.
Den HIBCPP cellelinie som en model af BCSFB kan anvendes til at studere interaktioner af patogener og barrieren-dannende epitelceller. Der er beviserat bakterien N. meningitidis får indrejse i CNS ved at krydse BCSFB. Det har vist sig, at Neisseria invadere HIBCPP celler specifikt fra den basolaterale celle side, der er relevant in vivo. Under denne proces den bakterielle kapsel spiller en vigtig rolle: Capsule-mangler mutanter viser øget invasion i HIBCPP celler 5. I det følgende sammenlignes vi basolaterale invasion af MC58 stamme 17, dets isogene mutante MC58siaD - deficient for kapselproduktion 17 og uindkapslet bærer isolere α14 19,20. HIBCPP celler blev inficeret med de ovennævnte over et tidsforløb på 4 timer ved en MOI på 10. Immunofluorescensanalyse stammer viste betydelig invasion for de to patogene stammer MC58 og MC58siaD -, mens kun mindre invasion blev observeret for apathogenic α14-stammen ( Figur 5A). Et repræsentativt billede af den dobbelte immunofluorescence mikroskopi af HIBCPP celler inficeret med den respektive stamme er vist i figur 5A, B og C.
Figur 1:. Standard og omvendt Cell Culture System I standard cellekultursystem (A, C) vekselvirkning af bakterier med CP epitelceller kan undersøges ved den apikale celle side, der er angivet med mikrovilli. Den omvendte cellekultursystem (B, D) tillader os at studere bakteriel vekselvirkning med den basolaterale cellemembran, som er involveret i bakteriel invasion via blodbanen ind i CNS. For den omvendte cellekultur (E) HIBCPP celler podes på undersiden af filterindsatse. Den nedre brønd, herunder det indre rum af filterindsatsen er oversvømmet med medium. Subsequladende, er den overdrevne medium aspireret på en sådan måde, at det indre rum af filterindsatsen forbliver fyldt. På den første dag efter såning, er cellekultur filterindsatse drejet rundt og fyldt med medium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. HIBCPP Cells Display Kontinuerlig Strands af TJs De TJ proteiner ZO-1 (A), blev Occludin (B) og Claudin-1 (C) påvist i HIBCPP celler. Paneler AC viser Apotome billeder. Midten af hvert panel: xy en face visning af cellerne; top og højre side: tværsnit af flere optiske skiver gennem z -plane. Scale søjler indikerer 10 um. Den TJ struktur HIBCPP celler blev analyseret ved transmission elektronmikroskopi. Celler er indbyrdes forbundet ved TJs, som er angivet med pile (D). Skalaen bar indikerer en um. Frys fraktur elektron mikroskopi studier visualisere tæt masket TJ tråde (E). Scale bar = 0,5 pm. Billederne i denne figur blev oprindeligt udgivet i Schwerk et al, PLoS ONE 7: e30069, doi:. 10,1371 / journal.pone.0030069 (2012); re-print med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Angivelse af Receptor proteiner involveret Under Invasion Bacteria i HIBCPP Cells Immunofluorescens analyse viser ekspressionen af ECAD (A) og Met (B) på den basolaterale celle side.. Den pictures viser Apotome billeder. Midten af hvert panel: xy en face visning af cellerne; top og højre side: tværsnit af flere optiske skiver gennem z -plane. Den apikale membran af HIBCPP celler (angivet ved pile) er placeret mod toppen af den øverste del samt mod højre af den højre side af henholdsvis hver ramme. Scale barer = 10 um. Dataene i denne figur blev også tidligere publiceret i Gründler et al, Mikrober inficere 15: 291-301, doi:.. 10,1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); re-print med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Indflydelse af DMSO og Cytochalasin D på Barrier funktion HIBCPP Cells Virkninger på barriere funk.tion bestemmes ved måling af TEER værdier og FITC-Inulin-Flux. Resultater er vist for en repræsentativt eksperiment, der blev udført i triplikater. HIBCPP celler blev behandlet med DMSO samt Cytochlalasin D i de angivne beløb for 2 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Når den anvendes i koncentrationer op til 0,2 vol%, er DMSO ikke påvirke membranpotentiale (figur 4A). Koncentrationer i området fra 0,1 vol-% op til 0,5 vol-% af DMSO heller ikke påvirke paracellulær permeabilitet af cellerne (figur 4B). I modsætning hertil 1 ug / ml Cytochalasin D forårsager et fald i TEER samtidig med en stigning i FITC-Inulin-Flux gennem cellen lag (figur 4A, B).
Figur 5: Invasion af N. meningitidis ind HIBCPP Cells. Dobbelt immunfluorescensmikroskopi shows invaderet (grøn) og overholdt (gul) bakterier. Hvide kasser inden billederne repræsenterer det forstørrede billede detalje på højre side. Basolaterale invasion blev observeret for N. meningitidis stammerne MC58 (A) og MC58siaD -, mangelfuld for kapsel produktion (B), mens kun en mindre invasion sats blev bestemt for α14 (C). Diagrammet viser, at invasion satser MC58 og MC58siaD - er meget vigtig i forhold til α14 (**, p <0,01). Ekstrem betydning vises, når MC58 eller MC58siaD - henholdsvis blev sammenlignet med α14 (***, p <0,001) og MC58siaD - blev sammenlignet med MC58 (###, p <0,001). Scale barer indicate 10 um. . Diagrammet i D blev oprindeligt udgivet i Borkowski et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10,1186 / s12974-014-0163-x (2014); re-print med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelcellerne af CP danne BCSFB der adskiller CSF fra blodet 2,3. Vi har for nylig etableret HIBCPP cellelinie som en funktionel menneskelig model af BCSFB. Cellerne vise vigtige barriere funktioner BCSFB in vitro, herunder udvikling af en høj membranpotentiale, en lav permeabilitet for makromolekyler, såvel som tilstedeværelse af kontinuerlige strenge af TJs 5. TJ proteiner bidrager til en apikal / basolaterale polaritet af cellerne. Polariteten er af stor betydning for en rettet lokalisering af overfladereceptorer samt specifikke transportproteiner. Vi har vist polære lokalisering af receptorerne ECAD og Met samt medlemmer af ATP-bindende kassette (ABC) transportør familie, der opretholder en meget kontrolleret mikromiljø i CNS 6,7.
Der er flere mikroorganismer, som er i stand til at opnå adgang til CNS ved at overvinde BCSFB, leading til svær sygdom, herunder meningitis 8. En af de patogener, som kan invadere i CP epitelceller er humanspecifikke Gram-negativ bakterie N. meningitidis 9,10, som har vist sig at komme ind HIBCPP celler i et polært mode specifikt fra den basolaterale celle side 5. Dette er den fysiologisk relevant retning for infektion af hjernen tværs af BCSFB når bakterier udbrede og støder CP epitelceller fra blodet i løbet af meningitis. For at afspejle denne situation in vitro, er HIBCPP celler dyrket på den nedre side af filteret. I modsætning til standard filterindsatsen model, hvor celler podes i det øvre rum, dette sæt op af et omvendt dyrkningssystem gør det muligt at inficere epithelceller specifikt fra den basolaterale celleside 5,21.
Basolaterale invasion i HIBCPP celler er blevet observeret for de to patogene N. meningitidis -, mens den ikke-patogene luftfartsselskab isolere α14 vises kun marginal invasion 15. Dette illustrerer, at HIBCPP celle model giver mulighed for at scanne tilgængelige mutante biblioteker for nye virulensfaktorer involveret under invasionen processen. Bemærkelsesværdigt, er det blevet vist, at andre patogener, herunder L. monocytogenes og Streptococcus suis (S. suis) invadere HIBCPP celler i et polært fashion 5,7.
For at genkende og reagere på invaderende mikroorganismer i CNS, epitelceller CP ekspres PRRS 22,23. TLRs udgør en vigtig familie inden for PRRS. Kvalitativ RT-PCR-analyser vist, at HIBCPP celler udtrykker flere TLRs samt relaterede co-receptorer og adapter molekyle MyD88 15. Det er blevet observeret, at receptorerne TLR2 og TLR4 er involveret i det cellulære forsvar reaktion til N. meningitidis kapselpolysaccharider 24. Yderligere resultater af et mikroarray tilgang afslørede, at HIBCPP celler inficeret med N. meningitidis vise en induktion af signaltransduktionsveje blandt andre faktorer også involverer transskription regulator IκBζ 15, obligatorisk for ekspression af visse målgener herunder IL6 25,26, en pro-inflammatorisk cytokin.
For at bekræfte disse resultater, HIBCPP celler inficeret med N. meningitidis i en omvendt dyrkningssystem er blevet anvendt til at undersøge frigivelse af cytokiner og chemokiner. Det vides, at denne proces har til formål at iværksætte en inflammatorisk reaktion ved aktivering af det medfødte immunsystem 13,14. HIBCPP celler producere og udskille cytokiner og chemokiner, herunder CXCL1-3, IL6, IL8 og TNFa 15,16, som er blevet beskrevet at tiltrække neutrofiler og monocytter 27. Ved at anvende vores model system, vifundet, at polymorphnuclear neutrofiler, monocytter og også T-lymfocytter vandrer gennem HIBCPP celler 16,28, understreger, at HIBCPP celler er egnede til at dechifrere mekanismer transepitel migrering af immunceller.
Den heri præsenterede model system tilbyder også mulighed for ændringer. HIBCPP celler kan forbehandles med antistoffer eller kemiske inhibitorer at identificere receptorer og signaltransduktionsveje involveret under infektion. DMSO, et fælles opløsningsmiddel for celle-stimulerende reagenser kan anvendes i passende mængder til HIBCPP celler, som udviser stabil barriere funktioner, der ikke påvirkes af den kemiske hele den undersøgte tidsforløb. Denne egenskab er også relevant for anvendelsen af modellen i farmaceutiske undersøgelser.
Selv om vi har vist, at HIBCPP celler viser en vis grad af polaritet, vil de ikke naturligt afspejler hver enkelt detalje af en in vivo-model. <em> F.eks lokalisering af ABC transporter familiemedlemmer matcher kun delvis de forventede mønstre 6, hvorfor farmaceutiske applikationer kan sikkert kun anvendes i begrænset omfang. Også, de HIBCPP celler synes ikke at producere CSF (data ikke vist). Ikke desto mindre har vi fundet, at HIBCPP celler udtrykker proteinerne Transthyretin, insulin-lignende vækstfaktor 2 (IGF2) og forkhead box J1 (FOXJ1) på RNA-niveau 5, som er karakteristiske markørproteiner for CP epitelceller 29,30,31,32 . Denne observation understøtter, at HIBCPP celler har bevaret typiske egenskaber af CP epitelceller. Vigtigt er, skal det bemærkes, at HIBCPP celler ikke foreliggende kontaktinhibering. Det er derfor afgørende at bruge cellerne til eksperimenter, når passende TEER-værdier er nået. Endvidere bør de HIBCPP celler ikke anvendes efter passage 38, idet potentialet til at udvikle en barrierefunktion synes at falde med højere passager. Endelig, for at studere imphandling af celle-celle-interaktioner under infektioner på BCSFB en co-kultur model bestående af CP epitelial og endotel ville være af stor interesse, men en sådan model skal stadig udvikles.
Som konklusion kan det HIBCPP cellekulturmodel anvendes til at afsløre vigtige invasion veje og underliggende signaltransduktionsveje, især af humane specifikke patogener på BCSFB. Som det er kendt, at epitelceller i CP også er involveret i neurologiske degenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom samt multipel sklerose 2, og også i hjernen metastase af tumorceller 33, giver systemet i almindelighed et stort udvalg af muligheder til undersøgelse af sygdomsrelaterede mekanismer, der giver mulighed for at finde hidtil ukendte terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
