Introduction
La barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB) es uno de los tres sitios de barrera entre la sangre y el cerebro 1. Su correlato morfológico son las células epiteliales del plexo coroideo (CP) 2,3, un convoluta endotelial-epitelial, que es fuertemente vascularizada y situado en los ventrículos del cerebro. El CP sirve para producir el líquido cefalorraquídeo (CSF), así como para separar esta última de la sangre. Con el fin de lograr la función de barrera, las células epiteliales CP muestran una actividad pinocíticas baja, expresan transportadores específicos, y están densamente conectadas por una red continua de las uniones estrechas (TJs) 2,3.
Las células humanas del papiloma del plexo coroideo (HIBCPP), derivado de un papiloma del plexo coroideo maligna de una mujer japonesa 4, se utilizaron para construir un modelo funcional en vitro de la BCSFB. HIBCPP células muestran un par de características de un BCSFB funcional como la formación de TJhebras, el desarrollo de un potencial de membrana de alta transepitelial que puede ser determinado como la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), y permeabilidades menores de macromoléculas. Por otra parte, las células expresan transportadores HIBCPP característicos, que pueden servir para regular el microambiente iónica, y mostrar apical / basolateral 5,6,7 polaridad.
El BCSFB se ha demostrado que funcionan como un sitio de entrada para los patógenos (bacterias, virus y hongos) en el sistema nervioso central (CNS) 8. La invasión de patógenos, incluyendo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), una bacteria Gram-negativas, puede causar enfermedades graves como la meningitis. La evidencia de que supera la barrera del epitelio de protección de la CP es apoyado por observaciones histopatológicas en pacientes con enfermedad meningocócica que exhibe una mayor cantidad de meningococos en los vasos y células epiteliales CP 9,10. Para poder entrar en las células huésped bacteria menudo secuestrar mecanismos endocytotic, que están mediadas o provocados por los receptores de superficie específicos localizados en las células huésped. Dado que las interacciones de patógenos con estos receptores pueden ser especies modelos 11, específicas de animales sólo pueden ser consultados en un grado limitado. La línea celular HIBCPP ofrece la oportunidad de estudiar el proceso de invasión, así como los mecanismos moleculares subyacentes en un sistema modelo humano. El empleo de insertos de cultivo celular nos permite analizar las interacciones de los agentes patógenos con células huésped desde dos lados distintos. Muchas bacterias, incluyendo N. meningitidis, están firmemente sujeto a los efectos de la gravedad durante ensayos de la infección. Para la interacción óptima de patógenos con las células HIBCPP durante los ensayos, las bacterias se añaden inicialmente en el compartimento superior del sistema de inserción de filtro de cultivo celular. Para permitir la infección de la apical o el lado basolateral de células, respectivamente, dos variaciones del sistema in vitro han sido thiscidos: En el sistema estándar células HIBCPP se siembran en el compartimiento superior del inserto de filtro, imitando la situación cuando los microorganismos se encuentran en el lado del CSF y se meten en contacto con el lado apical de las células (Figura 1A, C). Por el contrario, el uso de las células HIBCPP en un sistema de filtro de inserto de cultivo celular invertida refleja las condiciones cuando las bacterias han entrado en la corriente sanguínea. Los microorganismos difunden en la sangre y las células epiteliales CP encuentro desde el lado basolateral (Figura 1 B, C). Digno de mención, en este sistema modelo se ha demostrado que las bacterias invaden las células HIBCPP de una manera polar específicamente del 5,7 lado celular basolateral.
Posteriormente a la infección de la CP, los patógenos invadido pueden ser reconocidos por el sistema inmune innato a través de la ligadura a receptores de reconocimiento de patrones (PRR). los miembros descritos bien de los derechos y responsabilidades parentales pertenecen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR). TLRs puede cubod para estructuras características de los microorganismos infecciosos, que son patrones moleculares asociados a patógenos (denominado PAMPS). La ligación de los receptores conduce a la activación de la célula huésped cascadas de señalización que activan la expresión de citocinas y quimiocinas 12, que a su vez estimulan la transmigración de las células inmunes a través de la BCSFB 13,14. Se ha demostrado que las células HIBCPP expresan varios TLRs a nivel de mRNA y que la infección con N. meningitidis resulta en la secreción de varias citocinas y quimiocinas, incluyendo CXCL1-3, IL6, IL8 y TNF 15,16.
A continuación, describimos el cultivo y la infección de la línea celular humana HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida que imita la BCSFB. Este sistema modelo permite estudiar las interacciones de patógenos con el lado in vivo relevante celular basolateral, así como la respuesta celular posterior.
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Protocol
1. Preparar los elementos filtrantes de cultivo celular para células Siembra HIBCPP en un sistema invertido Modelo
- Pre-caliente DMEM / F12 (HAM) suplementado con 5 mg / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 10% de suero de ternera fetal (FCS).
- El uso de fórceps estériles para colocar en la zona de crecimiento de los cartuchos de filtro cultivo de células de 0,33 cm² con un tamaño de poro de 3 micras boca abajo en una placa de 12 pocillos (Figura 1E).
- Llenar medio en el compartimento inferior del filtro de inserción de cultivo de células (alrededor de 3 ml) y 100 l en la parte superior del inserto de filtro. Inundar la placa, así como el compartimiento inferior con el medio. Aspirar el medio excesiva de tal manera que el compartimiento inferior del inserto de filtro permanece lleno (Figura 1E).
Nota: Se recomienda utilizar una pipeta serológica para este paso. - Cubrir la placa de 12 pocillos con la tapa y transferir los insertos de filtro de cultivo celular preparado a la incubadora, 37 ° C,5% de CO 2 hasta la adición de las células.
2. Cultivo y pases de células HIBCPP
- Preparar DMEM / F12 (HAM) suplementado con 5 g / ml, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 10% FCS.
- Pre-caliente medio y PBS en un baño de agua a 37 °. Aspirar medio del frasco. Añadir 10 ml de PBS al matraz y remolino. Repita este paso una vez.
- Añadir 3 ml 0,25% de tripsina-EDTA al matraz y remolino. Colocar en la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2.
- Después de aproximadamente 20 minutos sacar el matraz de la incubadora. Asegúrese de que las células se separan del fondo del matraz y muestran una forma redonda cuando encuestados con el microscopio.
Nota: Las células no se separan completamente una de otra y se encuentran a menudo en los aglomerados. Se recomienda el uso de las células hasta el paso 38. - Para detener la tripsinización añadir 17 ml de medio. Resuspender las células pipeteando arriba y abajo y transferir la suspensiónen un tubo de 50 ml. Centrifugar a 50 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
- Resuspender las células en un volumen apropiado de medio y contar las células usando un hemocitómetro.
Nota: La concentración de las células resuspendidas HIBCPP debe ser de 1 x 10 6 células / ml. Para el mantenimiento de las células HIBCPP se sugiere para transferir una cantidad de 1-6 x 10 6 células en 10 ml de medio a un T75-matraz. Cambio de medio cada segundo día.
3. Siembra de insertos de cultivo celular invertida de filtro con células HIBCPP
- En la parte superior de cada elemento filtrante invertida (es decir, el lado inferior del filtro) añadir 80 l de suspensión de células (es decir. 8 x 10 4 células) (Figura 1E).
Nota: Asegúrese de que las células se distribuyen de manera uniforme en la suspensión invirtiendo el tubo antes de la siembra. - Cubrir los insertos de filtro de cultivo sembrado de células con la tapa de la placa de 12 pocillos y la transferencia a la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2.
- En el primer día, llenar 1 ml de medio en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Levantar los elementos filtrantes de cultivo de células mediante el uso de fórceps fuera de la placa de 12 pocillos, se elimina el medio en el interior, a su vez los elementos filtrantes y colocarlos en la orientación estándar en la placa de 24 pocillos preparada (Figura 1E).
- Colocar las células en medio fresco cada dos días. Preparar 24 pocillos con medio fresco y transferir los insertos de filtro a la misma. Llenar inserciones con 0,5 ml de medio fresco. Compruebe TEER todos los días como se describe en la sección 4.
- Cuando los valores de TEER de HIBCPP células sembradas en insertos de cultivo celular supera el 70 Ω x cm² (aproximadamente 4 días después de la siembra), y luego continuar el cultivo de células en un medio que contiene 1% de FCS y 5 mg / ml de insulina. Preparar placas de 24 pocillos con 1 ml de medio de cada pocillo. Transferencia de elementos filtrantes a los pocillos preparados y medio de intercambio en el compartimiento superior.
Nota: Esta retirada del suero después de la confluencia conduce a la formación deun potencial de membrana superior. - Aspirar medio del compartimiento del filtro, traslado al bien preparado y rellenar con 500 l de medio. Repita este paso una vez. Poner las células durante la noche en la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2.
4. La medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)
- Sumergir las puntas de los electrodos de voltohmmeter tejido epitelial durante 15 min en 80% de etanol. Transferir voltohmmeter bajo el capó y dejar que seque el electrodo por un momento. Coloque electrodo en medio de cultivo respectivo utilizado para las células durante otros 15 min para equilibrar.
- Realizar mediciones colocando el brazo más largo del electrodo de modo que toque la parte inferior del compartimiento inferior cada vez, coloque el brazo más corto en el compartimento de inserción del filtro.
Nota: Los valores de resistencia de los cartuchos de filtro de cultivo celular sin células en el medio se debe utilizar como valores en blanco ((valor medido (Ω) - valor en blanco (Ω)) x Filtrosuperficie (es decir, 0,33 cm $ ² $)). - Después de medir lugar el electrodo de nuevo en 80% de etanol durante 15 min. Almacenar en un tubo seco.
5. Determinación de la permeabilidad paracelular
- Disolver 1 g FITC-inulina en 200 ml de medio de cultivo suplementado con 5 mg / ml de insulina 1% de FCS. Aplicar 50 mg / ml de la solución en el compartimento superior del filtro antes de la infección de las células.
- Después de la infección recoger muestras de medio desde el pozo inferior para determinar la cantidad de inulina pasa desde el compartimiento del filtro a través de la capa de células.
- Preparar una solución estándar FITC-inulina y llevar a cabo diluciones 1: 2, 10 veces (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% y 0%) . Detectar la fluorescencia mediante la medición de todas las muestras en un lector de microplacas.
6. Preparación de bacterias para la infección de células en cultivo celular HIBCPP Filtrar insertos
- Un día antes del experimento, rascado tél N. congelada meningitidis cepas de una glicerol-social y consecutivas a cabo en agar chocolate con Vitox. Crecer durante la noche en la incubadora, a 37 ° C, con 5% de CO 2.
- Extraer 20-30 colonias del cultivo durante la noche y transferir a un tubo que contiene 8 ml Proteosa Peptona medio suplementado con 0,042% de NaHCO3, 0,01 M MgCl 2 y 1% Polyvitex.
- Agitar las bacterias durante 1,25 horas a 220 rpm, 37 ° C. Sedimentar las bacterias por centrifugación a 2684 g durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano con medio libre de suero 8 ml. Vórtice para asegurar una suspensión uniforme.
- Para determinar la densidad de cultivo, medir una dilución de 1:10 en una densidad óptica (DO) de 600 nm. Ajustar la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,1.
Nota: Esta suspensión contiene aprox. 1 x 10 8 UFC / ml. - Para confirmar la concentración de células bacterianas, se diluye la suspensión por pasos (01:10) hasta unadilución de 10 -5 y placa sobre placas de agar chocolate.
Nota: diluciones seriadas similares necesitan ser realizados para calcular las curvas de crecimiento bacteriano.
7. Infección de células en cultivo celular HIBCPP filtro inserciones y Determinación de la invasión bacteriana por inmunofluorescencia doble
- Después de continuar el cultivo de células en medio que contiene 1% de FCS y 5 mg / ml de insulina, medir las células cada día usando un voltohmmeter tejido epitelial. Si las células han alcanzado un TEER de alrededor de 500 Ω x cm², llevar a cabo la infección.
- Infectar las células con la suspensión bacteriana preparada a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Tienda de las células infectadas en la incubadora, a 37 ° C, con 5% de CO 2 durante el período de tiempo indicado.
Nota: La MOI se puede calcular teniendo en cuenta el número de células por filtro de inserto de cultivo celular a confluencia (1,21 x 10 6 células / cm 2). - Detener el Infection lavando tres veces con 500 l de medio libre de suero (SFM) que contiene albúmina de suero bovino 1% (BSA) aplicada al compartimiento del filtro, 1 ml para el compartimiento inferior.
- Bloquear con 500 l SFM que contenía tampón de BSA 1% en el compartimiento del filtro y 1 ml en el compartimiento inferior para 20 min a temperatura ambiente para evitar la adherencia de los anticuerpos a los sitios de unión no específica.
- Incubar con 100 l de anticuerpo primario contra N. meningitidis α-OMP (1: 200) en el compartimiento del filtro y 500 l en el compartimiento inferior para 20 min a temperatura ambiente.
Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada. - Se lavan las células aspirando el medio desde el compartimiento del filtro, transferir el elemento filtrante a una SFM bien con 1 ml de preparado que contiene 1% de BSA y llenar el compartimiento del filtro de vaciado con SFM 500 l que contiene 1% de BSA. Repita este paso dos veces.
- Fijar las células con 500 l 4% de formaldehído en el filtro de compartamento, 1 ml en el compartimiento inferior durante 10 min a temperatura ambiente.
- Se lavan las células aspirando el medio desde el compartimiento del filtro, transferir el elemento filtrante a un bien preparado con 1 ml de PBS y llenar el compartimiento del filtro de vaciado con 500 l de PBS. Repita este paso una vez.
Nota: Las muestras pueden ser almacenadas durante la noche en PBS a 4 ° C. - Cut cultivo celular fijo filtra de los insertos y se lava con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. Se incuban las células durante 15 min a temperatura ambiente con 250 l fluorescente marcada (longitud de onda de excitación 594 nm) de pollo anticuerpo secundario anti conejo (1: 500) para teñir las bacterias extracelulares.
Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada. - Permeabilizar las células con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA y 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA.
- Incubar con 250 l de anticuerpo primario contra N. meningitidis
- Aplicar 250 l de marcado fluorescente (excitación de longitud de onda 488 nm) anticuerpo secundario (1: 500), marcado fluorescente (excitación de longitud de onda 660 nm) faloidina (1: 250) y 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ( 1: 50000) durante 1 hora a temperatura ambiente para teñir bacterias extra e intracelulares, citoesqueleto de actina y núcleos.
Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada. - Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. Incrustar las células en el medio y se almacena a 4 ° C hasta que el examen de montaje a través del microscopio.
- Determinar el número de bacterias invadidas por campo predefinido. Para ello, contando 20 campos por filtro de membrana. Calcular el porcentaje de bacterias invadidas.
Nota: Multiplicar el número de bacterias media de los 20 campos microscópicos con un área de Coefficient. El resultado se expresa la cantidad de bacterias totales presentes en un filtro de cultivo de células de inserción 0,33 cm². Divida este valor por la cantidad de bacterias cultivadas en medios durante la duración de la infección.
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Representative Results
Aquí se describe el cultivo y la infección de las células HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida. Este modelo nos permite estudiar los mecanismos de invasión y las vías de señalización molecular subyacente desde el lado basolateral de células, que reproduce una situación fisiológica de las bacterias que entran y difusión de las células epiteliales a través del torrente sanguíneo (Figura 1).
Las células HIBCPP mostrar ciertas funciones de barrera, que les permiten restringir el intercambio molecular a un nivel mínimo. Esto se consigue por la expresión de unión adherente (AJ) y las proteínas de unión estrecha (TJ). El análisis de inmunofluorescencia de las proteínas asociadas a TJ ocludina, Claudin y ZO-1 reveló una señal de interrupción en los sitios de contacto célula-célula, lo que demuestra que las células están interconectados por hebras continuas de TJs (Figura 2A, B, C). Una impresión detallada de tque la morfología TJ se ha obtenido por la transmisión (Figura 2D) y la congelación de microscopía electrónica de fractura (Figura 2E), lo que demuestra que TJs se encuentran entre las células y la forma, estructuras similares a cables anchos de malla.
TJs de las células epiteliales también actúan como una cerca para separar dominios de la membrana apical y basolateral, por lo tanto, contribuir a la polaridad celular. Entre las proteínas, que se expresan exclusivamente en el lado celular basolateral de las células HIBCPP, son la proteína AJ E-cadherina (Ecad) y el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF / Met) como se muestra por análisis de inmunofluorescencia en la Figura 3, que apunta a una cierto nivel de polaridad.
Cuando se cultivan en condiciones apropiadas células HIBCPP también exhiben funciones de barrera típicos de la BCSFB como la formación de un potencial de membrana, así como una baja permeabilidad para macromolecules. Determinación del potencial de membrana se puede lograr mediante la medición de la TEER con el uso de un voltohmmeter. La permeabilidad de la capa de células se cuantifica por aplicación de marcado con FITC inulina, un azúcar que pasa a la capa de una manera paracelular. Aquí, se muestra los resultados de un experimento representativo, lo que demuestra que estas funciones de barrera se mantienen estables y no muestran afecto por las concentraciones estándar de dimetil sulfóxido (DMSO), un disolvente común para los productos químicos celulares estimulante. Como puede verse en la figura 4A, los valores de TEER se registraron antes y después de la exposición de las células a HIBCPP DMSO.
Las células muestran un alto potencial de membrana que alcanza hasta aproximadamente 500 Ω x cm² al comienzo del experimento para todas las condiciones. La TEER medido no cambió después de 2 horas para las células tratadas con hasta un 0,2% en volumen de DMSO. Por el contrario, los valores de TEER se redujeron en un dependiente de la dosis WH mannerse aplicaron en volúmenes más altos (Figura 4A). Esta reducción en el potencial de membrana era concomitante con un aumento de la permeabilidad para macromoléculas. Mientras que la adición de DMSO a las células HIBCPP hasta 0,5% en volumen no dio lugar a un aumento de la permeabilidad de la inulina, 1 vol% y 2% en volumen muestran un efecto, aunque en un grado restringido (Figura 4B). Además, se comprobó la influencia de la citocalasina D, un potente inhibidor de la polimerización de actina, en el potencial de membrana y la permeabilidad de las células HIBCPP. El tratamiento de las células con el 1 mg / ml citocalasina D provoca una caída significativa de los valores de TEER, así como un aumento en el flujo de FITC-inulina (Figura 4A, B). Este efecto puede ser explicado por la apertura de TJs causada por citocalasina D.
La línea celular HIBCPP como un modelo de la BCSFB se puede emplear para estudiar las interacciones de los agentes patógenos y las células epiteliales de formación de barrera. Hay evidenciaque la bacteria N. meningitidis gana entrada en el SNC mediante el cruce de la BCSFB. Se ha demostrado que la Neisseria invadir las células HIBCPP específicamente desde el lado basolateral de células, que es relevante in vivo. Durante este proceso, la cápsula tiene un papel importante: los mutantes de cápsula que carece muestran un aumento de invasión en células HIBCPP 5. En la siguiente comparamos invasión basolateral de la cepa MC58 17, su mutante isogénica MC58siaD - deficientes para la producción de cápsulas 17 y el portador no encapsulado aislar α14 19,20. Células HIBCPP fueron infectados con las cepas mencionadas anteriormente durante un transcurso de tiempo de 4 horas a una MOI de 10. El análisis de inmunofluorescencia reveló la invasión significativa para los dos cepas patógenas MC58 y MC58siaD -, mientras que se observaron tasas de invasión de poca importancia para la cepa α14 apatógeno ( Figura 5A). Una imagen representativa de la doble immunoflumicroscopía orescence de células HIBCPP infectados con la cepa respectiva se muestra en la Figura 5A, B y C.
Figura 1:. Standard and Cell Inverted sistema de cultivo interacción en el sistema de cultivo celular estándar (A, C) de las bacterias con las células epiteliales CP puede ser investigado en el lado apical de células, que se indica por microvellosidades. El sistema de cultivo celular invertida (B, D) nos permite estudiar la interacción bacteriana con la membrana celular basolateral, que está implicado en la invasión bacteriana a través del torrente sanguíneo en el SNC. Para el cultivo de células invertida células (E) HIBCPP se siembran en el lado inferior de los insertos de filtro. El pozo inferior que incluye el compartimiento interior del elemento filtrante se inundan con el medio. Subsequtemente, el medio se aspira el exceso de tal manera que el compartimiento interior del inserto de filtro permanece lleno. En el primer día después de la siembra, cultivo celular elementos filtrantes se volcó y se rellenan con medio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Las células HIBCPP Exhibidores hebras continuas de TJs Las proteínas TJ ZO-1 (A), se detectaron ocludina (B) y Claudín-1 (C) en las células HIBCPP. Paneles AC muestran imágenes apótoma. Centro de cada panel: xy en opinión de la cara de las células; superior y lateral derecho: secciones transversales de varias rodajas óptica a través del plano xy z. Las barras de escala indican 10 micras. La estructura de las células TJ HIBCPP se analizó por transmimicroscopía electrónica sión. Las células son conectadas entre sí por TJs, que están indicadas con flechas (D). La barra de escala indica 1 micra. Congelan los estudios de microscopía electrónica de fractura visualizar estrechamente engranados hebras TJ (E). La barra de escala = 0,5 micras. Las imágenes de esta figura se publicaron originalmente en Schwerk et al, PLoS ONE 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); reimpresión con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: expresión del receptor de proteínas involucradas durante la invasión de bacterias en células HIBCPP análisis de inmunofluorescencia muestra la expresión de Ecad (A) y Met (B) en el lado basolateral de células.. el picturES muestran imágenes apótoma. Centro de cada panel: xy en opinión de la cara de las células; parte superior y derecha: sección transversal de varias rodajas ópticas a través del plano xy z. La membrana apical de las células HIBCPP (indicado por flechas) se coloca hacia la parte superior de la parte superior, así como hacia la derecha de la parte derecha, respectivamente, de cada trama. Barras de escala = 10 m. Los datos de esta figura también se publicaron previamente en Gründler et al, Infect Microbios 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); reimpresión con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Influencia de DMSO y citocalasina D en la función de las células Barrera HIBCPP Efectos sobre la barrera de func.ción se determina mediante la medición de los valores de TEER y FITC-inulina-Flux. Los resultados se muestran para un experimento representativo, que se realizó por triplicado. HIBCPP células fueron tratadas con DMSO, así como Cytochlalasin D en las cantidades indicadas durante 2 horas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Cuando se aplica en concentraciones de hasta 0,2% en volumen, DMSO no afecta el potencial de membrana (Figura 4A). Concentraciones que van del 0,1% en volumen hasta 0,5% en volumen de DMSO tampoco tienen influencia sobre la permeabilidad paracelular de las células (Figura 4B). En contraste, 1 mg / ml citocalasina D provoca una disminución de la TEER concomitante con un aumento de FITC-inulina de flujo a través de la capa de células (Figura 4A, B).
Figura 5: La invasión de N. meningitidis en células HIBCPP. Doble inmunofluorescencia microscopía espectáculos invadido (verde) y bacterias adheridas (amarillo). cajas blancas que aparecen en las imágenes representan el detalle de la imagen ampliada en el lado derecho. Se observó invasión basolateral para el N. meningitidis cepas MC58 (A) y MC58siaD -, deficientes para la producción de cápsulas (B), mientras que se determinó sólo una tasa de invasión menor para α14 (C). El diagrama muestra que las tasas de invasión de MC58 y MC58siaD - son altamente significativo si se compara con α14 (** p <0,01). Se muestra extrema importancia cuando MC58 o MC58siaD -, respectivamente, fueron comparados con α14 (*** p <0,001) y MC58siaD - se comparó con MC58 (###, p <0,001). Barras de escala indicate 10 micras. . El diagrama de la D fue publicado originalmente en Borkowski et al, J neuroinflamación 11: 163, doi: 10.1186 / s12974-014-0163-x (2014); reimpresión con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células epiteliales de la CP forman la BCSFB que separa el CSF desde el 2,3 sangre. Recientemente se estableció la línea celular HIBCPP como un modelo humano funcional de la BCSFB. Las células muestran importantes funciones de barrera de la BCSFB in vitro, incluyendo el desarrollo de un alto potencial de membrana, una baja permeabilidad para las macromoléculas, así como la presencia de hebras continuas de TJs 5. Las proteínas TJ contribuyen a una polaridad apical / basolateral de las células. La polaridad es de gran importancia para una localización dirigida de receptores de la superficie, así como las proteínas de transporte específicas. Hemos demostrado la localización polar de los receptores Ecad y MET, así como miembros de la ATP vinculante cassette (ABC) transportador de la familia que mantiene un microambiente altamente controlada dentro del SNC 6,7.
Existen varios microorganismos que son capaces de entrar en el SNC mediante la superación de la BCSFB, leading a una enfermedad grave como meningitis 8. Uno de los agentes patógenos que son capaces de invadir las células epiteliales en la que Cp es el N. bacteria Gram-negativa humanos específicos meningitidis 9,10, que se ha demostrado que entrar en las células HIBCPP de una manera polar específicamente desde el lado basolateral de células 5. Esta es la dirección fisiológicamente relevante para la infección del cerebro a través de la BCSFB cuando las bacterias difundir y células epiteliales encuentro CP de la sangre durante el curso de la meningitis. Para reflejar esta situación in vitro, las células se cultivan HIBCPP en el lado inferior del filtro. En contraste con el modelo de inserción de filtro estándar, donde las células se sembraron en el compartimiento superior, esta puesta en marcha de un sistema de cultivo permite invertida para infectar células epiteliales específicamente desde el lado basolateral de células 5,21.
Invasión basolateral en células HIBCPP se ha observado para los dos N. patógena meningitidis -, mientras que el portador no patógeno aislado α14 muestran sólo la invasión marginal 15. Esto ilustra que el modelo celular HIBCPP proporciona la posibilidad de explorar bibliotecas de mutantes disponibles para nuevos factores de virulencia implicados en el proceso de invasión. Digno de mención, se ha demostrado que otros patógenos incluyendo L. monocytogenes y Streptococcus suis (S. suis) invaden las células HIBCPP de una manera polar 5,7.
Con el fin de reconocer y responder a los microorganismos invasores en el SNC, las células epiteliales de la CP expresan PRRs 22,23. TLRs representan una importante familia dentro de las responsabilidades parentales. Los análisis de RT-PCR cualitativa demostró que las células expresan varios HIBCPP TLRs, así como co-receptores relacionados y la molécula adaptadora MyD88 15. Se ha observado que los receptores TLR2 y TLR4 están implicados en la reacción de defensa celular a N. meningitidis polisacáridos capsulares 24. Otros resultados de un enfoque de microarrays reveló que las células infectadas con N. HIBCPP meningitidis muestran una inducción de las vías de transducción de señales, entre otros factores también implican el regulador de la transcripción IκBζ 15, obligatoria para la expresión de determinados genes diana, incluyendo IL-6 25,26, una citoquina pro-inflamatoria.
Para confirmar estos hallazgos, las células infectadas con N. HIBCPP meningitidis en un sistema de cultivo invertida se han utilizado para investigar la liberación de citocinas y quimiocinas. Se sabe que este proceso tiene como objetivo para instigar una respuesta inflamatoria por la activación de la innata 13,14 sistema inmunológico. células HIBCPP producir y secretar citocinas y quimiocinas, incluyendo CXCL1-3, IL6, IL8 y TNF 15,16, que se han descrito para atraer neutrófilos y monocitos 27. Mediante el empleo de nuestro sistema de modelo nosencontraron que los neutrófilos polimorfonucleares, monocitos y linfocitos T también migran a través de las células HIBCPP 16,28, haciendo hincapié en que las células HIBCPP son adecuados para descifrar los mecanismos de la migración transepitelial de las células inmunes.
El sistema modelo presentado en este documento también ofrece la posibilidad de modificaciones. células HIBCPP pueden ser pretratados con anticuerpos o inhibidores químicos para identificar receptores y la señal vías de transducción implicados durante la infección. DMSO, un disolvente común para los reactivos de células estimulante se puede aplicar en volúmenes apropiados para las células HIBCPP, que muestran funciones de barrera estables que no se ven afectados por la sustancia química durante todo el curso de tiempo investigados. Esta propiedad también es relevante para el uso del modelo en estudios farmacéuticos.
Aunque hemos demostrado que las células HIBCPP muestran un cierto nivel de polaridad, que no reflejarán naturalmente cada uno de los detalles de un modelo in vivo. <em> Por ejemplo, la localización de los miembros de la familia de transportadores ABC coincide sólo en parte los patrones esperados 6, por qué aplicaciones farmacéuticas pueden probablemente sólo puede aplicar a una medida restringida. Además, no parece que las células HIBCPP para producir CSF (datos no mostrados). Sin embargo, hemos encontrado que las células HIBCPP expresan las proteínas de transtiretina, factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2) y caja forkhead J1 (Foxj1) en el nivel de ARN 5, que son proteínas marcadoras características para las células epiteliales CP 29,30,31,32 . Esta observación apoya que las células HIBCPP han conservado las propiedades típicas de las células epiteliales CP. Es importante destacar que, hay que señalar que las células HIBCPP hacen inhibición de contacto no está presente. Por tanto, es fundamental utilizar las células para la experimentación cuando se alcanzan los valores de TEER apropiadas. Además, las células HIBCPP no deben utilizarse más allá de paso 38, ya que el potencial para desarrollar una función de barrera parece caer con pasajes más altos. Por último, el estudio de la impacto de las interacciones célula-célula durante las infecciones en el BCSFB un modelo de co-cultivo consistentes en epiteliales y endoteliales CP sería de gran interés, pero ese modelo todavía tiene que ser desarrollado.
En conclusión, el modelo de cultivo celular HIBCPP se puede utilizar para revelar rutas principales de invasión y las vías de transducción de señales subyacentes, especialmente de patógenos específicos de humanos en el BCSFB. Como se sabe que las células epiteliales de la CP también están implicados en trastornos degenerativos neurológicos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, así como la esclerosis múltiple 2, y también en la metástasis de las células tumorales del cerebro 33, ofrece el sistema en general una gran variedad de oportunidades para la investigación de los mecanismos relacionados con la enfermedad, proporcionando el potencial para encontrar nuevas dianas terapéuticas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
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