Introduction
Blod-cerebrospinalvätska barriär (BCSFB) är en av de tre spärrställen mellan blodet och hjärnan 1. Dess morfologiska korrelat är de epiteliala cellerna i koroidea plexus (CP) 2,3, en endotel-epitelial inklädning som är starkt vaskulariserad och ligger i hjärnans ventriklar. CP tjänar till att producera i cerebrospinalvätskan (CSF) samt för att separera den senare från blodet. För att uppnå barriärfunktion, de CP epitelceller visar en låg pinocytotic aktivitet, uttrycka specifika transportörer, och är tätt förbundna med ett kontinuerligt nätverk av tight junctions (TJs) 2,3.
Human choroid plexus papillom (HIBCPP) celler, härledda från en malign åderhinna plexus papillom av en japansk kvinna 4, användes för att konstruera en funktionell i modell av BCSFB vitro. HIBCPP celler visar ett par av egenskaper hos en funktionell BCSFB som bildandet av TJsträngar, utveckling av en hög transepitelial membranpotential som kan bestämmas som transepitelialt elektrisk resistans (TEER), och mindre permeabilitet för makromolekyler. Dessutom HIBCPP celler uttrycker karakteristiska transportörer, som kan användas för att reglera den joniska mikro och visa apikala / basolateral polaritet 5,6,7.
Den BCSFB har visat sig fungera som ett ingångsställe för patogener (bakterier, virus och svampar) i det centrala nervsystemet (CNS) 8. Invasionen av patogener, inklusive Neisseria meningitidis (N. meningitidis), en gramnegativ bakterie, kan orsaka allvarliga sjukdomar som hjärnhinneinflammation. Bevis för att det övervinner den skyddande epitelbarriär av CP stöds av histopatologiska observationer hos patienter med meningokocksjukdom uppvisar ökade mängder av meningokocker i kärlen och CP epitelceller 9,10. För att få inträde i värdceller bacteria kapa ofta endocytotisk mekanismer, vilka förmedlas eller utlöses av specifika ytreceptorer belägna på värdcellerna. Eftersom interaktioner av patogener med dessa receptorer kan vara artspecifika 11, djurmodeller endast kan konsulteras för att en begränsad utsträckning. Den HIBCPP cellinje ger möjlighet att studera invasionen processen samt de underliggande molekylära mekanismer i människans modellsystem. Utnyttjar cellodlingsinsatser ger oss möjlighet att analysera interaktioner mellan patogener med värdceller från två olika cell sidor. Många bakterier, inklusive N. meningitidis, är starkt omfattas av effekterna av tyngdkraften under infektionsanalyser. Optimal samverkan av patogener med de HIBCPP celler under analyserna, är bakterierna initialt läggs in i den övre avdelningen av cellodlingsfilterinsatsen system. För att möjliggöra infektion från den apikala eller basolaterala cellsidan, respektive, har två varianter av systemet in vitro varit established: I standardsystemet HIBCPP celler ympas in i den övre avdelningen av filterinsatsen, som imiterar den situation då mikroorganismer är belägna på CSF-sidan och komma i kontakt med den apikala sidan av cellerna (figur 1A, C). I motsats, med hjälp av HIBCPP celler i en inverterad cellodlingsfilterinsatsen system återspeglar de villkor när bakterier har kommit in i blodet. Mikroorganismer sprida i blodet och möter CP epitelceller från den basolaterala sidan (Figur 1B, D). Anmärkningsvärd, i detta modellsystem har det visat sig att bakterier invadera HIBCPP celler i ett polärt mode specifikt från den basolaterala cellsidan 5,7.
Därefter till infektion av CP kan invaderade patogener erkännas av det medfödda immunförsvaret genom ligering till mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs). Väl beskrivna medlemmar av PRRS tillhör Toll-like receptor (TLR) familj. TLRs kan bind karakteristiska strukturer av smittsamma mikroorganismer, som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs). Ligering av receptorema leder till aktivering av värdcell signaleringskaskader som utlöser expression av cytokiner och kemokiner 12, vilka i sin tur stimulerar transmigration av immunceller tvärs över BCSFB 13,14. Det har visat sig att HIBCPP celler uttrycker flera TLRs på mRNA-nivå och att infektion med N. meningitidis resulterar i sekretion av flera cytokiner och kemokiner, inklusive CXCL1-3, IL6, IL8 och TNFa 15,16.
Här beskriver vi odling och infektion av den humana cellinjen HIBCPP i en inverterad cellodlingsinsats system som återspeglar BCSFB. Detta modellsystem gör det möjligt att studera interaktioner av patogener med in vivo-relevanta basolaterala cellsidan såväl som den efterföljande cellulära svaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered Cell Culture filterinsatser för sådd HIBCPP celler i en inverterad modellsystem
- Pre-warm DMEM / F12 (Ham) kompletterat med 5 | ig / ml insulin, 100 U / ml penicillin, 100 | ag / ml streptomycin och 10% fetalt kalvserum (FCS).
- Använda steril pincett för att placera 0,33 cm ^ tillväxtområde cellodlingsfilterinsatser med en porstorlek av 3 ^ m upp och ner i en 12-brunnsplatta (figur 1E).
- Fyll-medium in i den undre avdelningen av cellodlingsfilterinsatsen (ca 3 ml) och 100 pl ovanpå filterinsatsen. Svämma plåtar samt den undre avdelningen med medium. Aspirera den överdrivna mediet på ett sådant sätt att den undre avdelningen av filterinsatsen förblir fyllt (figur 1E).
Obs: Det rekommenderas att använda en serologisk pipett för detta steg. - Täcka 12-brunnar med locket och överför de beredda cellodlingsfilterinsatser till inkubatorn, 37 ° C,5% CO2 till dess att tillsatsen av celler.
2. Odling och Aging av HIBCPP celler
- Förbereda DMEM / F12 (Ham) kompletterat med 5 | ig / ml, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 10% FCS.
- Pre-varmt medium och PBS i en 37 ° C vattenbad. Aspirera medium från kolven. Tillsätt 10 ml PBS till kolven och virvel. Upprepa detta steg en gång.
- Tillsätts 3 ml 0,25% trypsin-EDTA till kolven och virvel. Placera i inkubatorn, 37 ° C, 5% CO2.
- Efter ca 20 minuter bort kolven från inkubatorn. Se till att cellerna lossas från botten av kolven och visar en rund form när tillfrågade med mikroskopet.
Obs: Cellerna inte loss helt från varandra och finns ofta i agglomerat. Det rekommenderas att använda celler upp till passagen 38. - För att stoppa trypsinisering lägga 17 ml medium. Resuspendera cellerna genom pipettering upp och ned och överföra suspensionenin i ett 50 ml rör. Centrifugera vid 50 xg under 10 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna i en lämplig volym av medium och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
Obs: Koncentrationen av resuspenderade HIBCPP celler bör vara 1 x 10 6 celler / ml. För underhåll av HIBCPP celler föreslås att överföra ett belopp på 1-6 x 10 6 celler i 10 ml medium till en T75-kolv. Ändra mediet varannan dag.
3. Seedning Inverterad Cell Culture filterinsatser med HIBCPP Cells
- På toppen av varje inverterad filterinsatsen (dvs. bottensidan av filtret) tillsätt 80 | il av cellsuspension (dvs.. 8 x 10 4 celler) (Figur 1e).
Obs: Se till att cellerna är jämnt fördelade i suspensionen genom att vända röret före sådd. - Täcka de ympade-cellodlingsfilterinsatser med locket på 12-brunnars platta och överföring till inkubatorn, 37 ° C, 5% CO 2.
- På den första dagen, fyller en ml medium i brunnarna på en 24-brunnars platta. Lyft cellodlingsfilterinsatser med hjälp av pincett från 12-brunnar, kassera mediet inne, vrid filterinsatser och placera dem i standardorientering i den förberedda 24-brunnar (Figur 1E).
- Placera cellerna till färskt medium varannan dag. Förbered 24-brunnar med färskt medium och överföra filterinsatser till det. Fyll insatser med 0,5 ml färskt medium. Kolla TEER varje dag som beskrivs i avsnitt 4.
- När TEER värden av HIBCPP sådda-celler på cellodlings-insatser överstiger 70 Ω x cm ^ (ca 4 dagar efter ympning), sedan fortsätta cellodling i medium innehållande 1% FCS och 5 | j, g / ml insulin. Förbered 24-brunnars plattor med 1 ml medium för varje brunn. Överför filterinsatser till de preparerade brunnarna och växlingsmedium i den övre avdelningen.
Obs: Detta serum tillbakadragande efter konfluens leder till bildandet aven högre membranpotential. - Aspirera medium från filterutrymmet, överföra till väl förberedda och fylla med 500 l medium. Upprepa detta steg en gång. Sätta cellerna över natt i inkubatorn, 37 ° C, 5% CO2.
4. Mätning av transepitelialt elektrisk resistens (TEER)
- Doppa elektrodspetsarna epitelvävnad voltohmmeter under 15 min i 80% etanol. Överför voltohmmeter under huven och låt elektrod torka ett ögonblick. Placera elektroden i respektive odlingsmedium som används för cellerna under ytterligare 15 min för att jämvikta.
- Utföra mätningar genom att positionera den längre armen av elektroden så att den vidrör botten på den undre avdelningen varje gång, placera den kortare armen in i filterinsatsen utrymmet.
Obs: resistansvärdena hos cellodlingsfilterinsatser utan celler i medium bör användas som blankvärden ((uppmätt värde (Ω) - tomt värde (Ω)) x filteryta (dvs. 0,33 cm ^)). - Efter mätning plats elektroden tillbaka in 80% etanol under 15 min. Förvaras torrt rör.
5. Prövning av para permeabilitet
- Lös upp 1 g FITC-inulin i 200 ml odlingsmedium kompletterat med 5 | ig / ml insulin 1% FCS. Applicera 50 | ig / ml av lösningen in i den övre filterfacket före infektion av cellerna.
- Efter infektion samla mediumprover från den nedre väl för att avgöra hur mycket Inulin gått från filterutrymmet genom cellskiktet.
- Förbered en FITC-inulin standardlösning och utföra 1: 2 späd, 10 gånger (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% och 0%) . Bestämma fluorescens genom mätning av alla prover i mikroplattläsare.
6. Beredning av bakterier för infektion av HIBCPP celler i cellkultur filterinsatser
- En dag före försöket, skrapa than fryst N. meningitidis stammar av en glycerol lager och strimma på chokladagar med Vitox. Växa över natt i inkubatorn vid 37 ° C, med 5% CO2.
- Extrahera 20-30 kolonier från övernattskultur och överför till ett rör innehållande 8 ml proteospepton Medium kompletterat med 0,042% NaHCOs 3, 0,01 M MgCl2 och 1% Polyvitex.
- Skaka bakterierna för 1,25 h vid 220 rpm, 37 ° C. Pelletera bakterierna genom centrifugering vid 2684 g under 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och resuspendera bakteriepelleten med 8 ml serumfritt medium. Virvel för att säkerställa en jämn suspension.
- För att bestämma kulturdensitet, mäta en utspädning av 1:10 vid en optisk densitet (OD) på 600 nm. Justera den bakteriella suspensionen till en OD 600 av 0,1.
Obs: Denna suspension innehåller ca. 1 x 10 8 CFU / ml. - För att bekräfta den bakteriella cellkoncentrationen, späd suspensionen stegvis (01:10) upp till enutspädning av 10 -5 och plattan på chokladagar plattor.
Notera: Liknande serieutspädningar måste utföras för att beräkna bakterietillväxtkurvor.
7. Infektion av HIBCPP celler i cellkultur filterinsatser och bestämning av bakteriell invasion av dubbla immunofluorescens
- Efter fortsatt cellodling i medium innehållande 1% FCS och 5 | j, g / ml insulin, mät-celler varje dag med användning av en epitelvävnad voltohmmeter. Om cellerna har nått en TEER på cirka 500 Ω x cm utföra infektionen.
- Infektera cellerna med den framställda bakteriesuspensionen vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 10. Store de infekterade cellerna i inkubator, vid 37 ° C, med 5% CO2 under den angivna tidsperioden.
Obs! MOI kan beräknas med hänsyn till antalet celler per cellodlingsfilterinsatsen vid sammanflödet (1,21 x 10 6 celler / cm 2). - Stoppa infekterajon genom tvättning tre gånger med 500 | il serumfritt medium (SFM) innehållande 1% bovint serumalbumin (BSA) som appliceras på filterutrymmet, 1 ml till den undre avdelningen.
- Blockera med 500 | il SFM innehållande 1% BSA-buffert i filterutrymmet och 1 ml i den undre avdelningen under 20 min vid rumstemperatur för att förhindra vidhäftning av antikroppar till ospecifika bindningsställen.
- Inkubera med 100 l primära antikroppen anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) i filterutrymmet och 500 pl i det nedre utrymmet under 20 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Om det behövs, måste antikroppskoncentrationen titreras. - Tvätta cellerna genom att aspirera mediet från filterutrymmet, överföra filterinsatsen till ett väl förberett med en ml SFM innehållande 1% BSA och fylla den tömda filterutrymmet med 500 l SFM innehållande 1% BSA. Upprepa detta steg två gånger.
- Fixera cellerna med 500 | il 4% formaldehyd i filter compartment, 1 ml i den undre avdelningen i 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna genom att aspirera mediet från filterutrymmet, överför filterinsatsen till en framställd väl med en ml PBS och fylla den tömda filterutrymmet med 500 | il PBS. Upprepa detta steg en gång.
Obs: Prover kan förvaras över natt i PBS vid 4 ° C. - Cut fast cellodling filtrerar bort av skären och tvätta med 250 | il PBS innehållande 1% BSA. Inkubera cellerna under 15 min vid rumstemperatur med 250 | il fluorescent märkta (excitationsvåglängd 594 nm) sekundär antikropp kyckling anti-kanin (1: 500) för att färga extracellulära bakterier.
Obs: Om det behövs, måste antikroppskoncentrationen titreras. - Permeabilize cellerna med 250 | il PBS innehållande 1% BSA och 0,5% Triton X-100 under 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta cellerna tre gånger med 250 | il PBS innehållande 1% BSA.
- Inkubera med 250 l primära antikroppen anti N. meningitidis
- Applicera 250 pl fluorescent märkt (excitationsvåglängd 488 nm) sekundär antikropp (1: 500), fluorescensmärkta (excitationsvåglängd 660 nm) Phalloidin (1: 250) och 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) ( 1: 50000) i 1 timme vid rumstemperatur för att färga extra- och intracellulära bakterier, aktincytoskelettet och kärnor.
Obs: Om det behövs, måste antikroppskoncentrationen titreras. - Tvätta cellerna tre gånger med 250 | il PBS innehållande 1% BSA. Bädda in cellerna i monteringsmedium och förvara vid 4 ° C fram till undersökning via mikroskop.
- Bestämma antalet invaderade bakterier per fördefinierade fält. Gör detta genom att räkna 20 fält per filtermembranet. Beräkna andelen invaderade bakterier.
Obs: Multiplicera det genomsnittliga antalet bakterier i 20 mikroskopiska fält med en Coeffic områdeient. Resultatet uttrycker mängden av totala bakterier som finns i en 0,33 cm ^ cellodlingsfilterinsats. Dividera detta värde med mängden bakterier som odlas i media under varaktigheten av infektionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi odling och infektion av HIBCPP celler i en inverterad cellodlingsinsats system. Denna modell gör det möjligt för oss att studera invasion mekanismer och de underliggande molekylära signalvägar från den basolaterala cellsidan, reproducera en fysiologisk situation av bakterier sprider och in epitelceller via blodomloppet (Figur 1).
De HIBCPP celler uppvisar vissa barriärfunktioner, som gör det möjligt för dem att begränsa molekyl utbyte till en minimal nivå. Detta uppnås genom expression av adherens (AJ) och tät föreningspunkt (TJ) proteiner. Immunofluorescensanalys av de TJ-associerade proteiner Occludin, Claudin och ZO-1 avslöjade en oavbruten signal vid ställena för cell-cellkontakt, vilket demonstrerar att cellerna är sammankopplade genom kontinuerliga strängar av TJs (Figur 2A, B, C). En detaljerad bild av than TJ morfologi har erhållits genom transmission (fig 2D) och frysfrakturelektronmikroskop (figur 2E), vilket visar att TJs är belägna mellan cellerna och bilda breda, i ingrepp vajerliknande strukturer.
TJs av epitelceller också fungera som ett staket för att segregera apikala och basolaterala membran domäner, och därigenom bidra till cellulär polaritet. Bland de proteiner, som uttrycks uteslutande på den basolaterala cell sidan av HIBCPP celler, är de AJ proteinet E-cadherin (ECAD) och hepatocyt-tillväxtfaktorreceptor (HGF / Met) såsom visas genom immunofluorescensanalys i figur 3, som pekar på en viss nivå av polaritet.
När odlas under lämpliga betingelser HIBCPP celler uppvisar också typiska barriärfunktioner hos BCSFB liknande bildandet av en membranpotential samt en låg permeabilitet för macromolemolekyler. Bestämning av membranpotential kan uppnås genom mätning av TEER med användning av en voltohmmeter. Permeabiliteten hos cellskiktet kvantifieras genom tillämpning av FITC-märkt inulin, ett socker som passerar skiktet i en paracellulär mode. Här visar vi resultaten av ett representativt experiment, som visar att dessa barriärfunktioner förblir stabila och visar ingen ömhet av standardkoncentrationer av dimetylsulfoxid (DMSO), ett vanligt lösningsmedel för cellstimulerande kemikalier. Såsom kan ses i figur 4A, var Teer värdena registreras före och efter exponering av HIBCPP celler för DMSO.
Cellerna uppvisade en hög membranpotential som nådde upp till ca 500 Ω x cm ^ i början av experimentet för alla villkor. Den uppmätta TEER förändrades inte efter 2 timmar för celler behandlade med upp till 0,2 vol% DMSO. Däremot minskade Teer värden i en dosberoende sätt WHen högre volymer applicerades (Figur 4A). Denna minskning av membranpotentialen var samtidigt med en ökad permeabilitet för makromolekyler. Tillägget av DMSO till HIBCPP celler upp till 0,5 vol% resulterade inte i en permeabilitet ökar för Inulin, en vol% och 2 vol% visade en effekt, men i begränsad utsträckning (Figur 4B). Vidare kontrolleras vi påverkan av Cytochalasin D, en potent hämmare av aktin polymerisation, på membranpotentialen och permeabiliteten hos HIBCPP celler. Behandling av cellerna med 1 mikrogram / ml Cytochalasin D orsakar en betydande minskning av Teer värden samt en ökning av FITC-inulin flödet (Figur 4A, B). Denna effekt kan förklaras genom öppnandet av TJs orsakas av Cytochalasin D.
Den HIBCPP cellinjen som en modell av den BCSFB kan användas för att studera interaktioner mellan patogener och barriärbildande epitelceller. Det finns bevis föratt bakterien N. meningitidis vinner inträde i CNS genom att korsa BCSFB. Det har visat sig att Neisseria invadera HIBCPP celler specifikt från den basolaterala cellsidan, som är relevant in vivo. Under denna process bakterie kapseln spelar en viktig roll: kapsel saknar mutanter visar ökad invasion i HIBCPP celler 5. I följande jämförde vi basolaterala invasion av MC58-stammen 17, dess isogena mutant MC58siaD - deficient för kapselproduktion 17 och oinkapslat bäraren isolera α14 19,20. HIBCPP celler infekterades med de stammar som nämnts ovan över ett tidsförlopp för 4 h vid ett MOI på 10. Immunofluorescensanalys avslöjade signifikant invasion för de två patogena stammar MC58 och MC58siaD -, medan endast smärre invasionshastigheter observerades för den apatogena α14 stam ( Figur 5A). En representativ bild av den dubbla immunofluorescence mikroskopi av HIBCPP celler infekterade med respektive stammen visas i Figur 5A, B och C.
Figur 1:. Standard och Inverted Cell Culture System I standardcellodlingssystem (A, C) interaktion av bakterier med CP epitelceller kan undersökas på den apikala cellsidan, vilket indikeras av mikrovilli. Den inverterade cellodlingssystem (B, D) ger oss möjlighet att studera bakteriell interaktion med det basolaterala cellmembranet, som är involverat vid bakteriell invasion via blodomloppet i CNS. För den inverterade cellkultur (E) HIBCPP celler ympas på bottensidan av filterinsatserna. Den undre brunnen inklusive det inre rummet av filterinsatsen är översvämmade med medium. Subsequlunda, är det alltför stora mediet aspire på ett sådant sätt att det inre utrymmet av filterinsatsen förblir fylld. På den första dagen efter sådd, är cellodlingsfilterinsatser vänt och fylld med medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. HIBCPP Cells Display kontinuerliga strängar av TJs De TJ-proteinerna ZO-1 (A), var Occludin (B) och Claudin-1 (C) som detekteras i HIBCPP celler. Paneler AC visar Apotome bilder. Mitten av varje panel: xy en vy framifrån av cellerna; ovansidan och högersidan: tvärsnitt av flera optiska skivor genom z -planet. Skalstrecken anger 10 um. TJ struktur HIBCPP celler analyserades med transmissionselektronmikroskop. Cellerna är sammankopplade av TJs, som indikeras av pilarna (D). Skalstrecket indikerar en pm. Frysa fraktur elektronmikroskopi studier visualisera nära maskor TJ strängar (E). Skala bar = 0,5 pm. Bilderna i denna siffra var ursprungligen publicerades i Schwerk et al, PLoS ONE 7: e30069, doi:. 10,1371 / journal.pone.0030069 (2012); re-print med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Expression av receptorproteiner involverade under Invasion av bakterier i HIBCPP Cells immunofluorescensanalys visar uttryck av ECAD (A) och Met (B) på den basolaterala cellsidan.. den pictures visar Apotome bilder. Mitten av varje panel: xy en vy framifrån av cellerna; ovansidan och högersidan: tvärsnitt av flera optiska skivor genom z -planet. Det apikala membranet hos HIBCPP celler (anges med pilar) är placerat mot toppen av den övre delen samt mot höger av den högra sidan, respektive, av varje ram. Skalstrecken = 10 | im. Uppgifterna i denna siffra var också tidigare publicerats i Gründler et al, Mikrober Infect 15: 291-301, doi:.. 10,1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); re-print med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Inverkan av DMSO och Cytochalasin D på barriärfunktion HIBCPP celler Effekter på barriär funk.tion bestäms genom mätning av Teer värden och FITC-Inulin-Flux. Resultat visas för ett representativt experiment, som genomfördes i tre exemplar. HIBCPP celler behandlades med DMSO liksom Cytochlalasin D i de angivna mängderna för två timmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När de appliceras i koncentrationer upp till 0,2 volym-%, betyder DMSO inte påverka membranpotential (Figur 4A). Koncentrationer som sträcker sig från 0,1 vol% upp till 0,5 vol% DMSO inte heller påverka paracellulära permeabilitet av cellerna (Figur 4B). I motsats härtill orsakar ett ig / ml Cytochalasin D en minskning i TEER samtidigt med en ökning av FITC-Inulin-Flux genom cellskiktet (Figur 4A, B).
Figur 5: Invasion av N. meningitidis i HIBCPP celler. Dubbel immunofluorescensmikroskopi visar invaderade (grön) och vidhäftade (gul) bakterier. Vita lådor i bilder representerar den förstorade bilden detalj på höger sida. Basolateral invasion observerades för N. meningitidis-stammar MC58 (A) och MC58siaD -, deficient för kapselproduktion (B), medan endast en mindre invasion hastigheten bestämdes för α14 (C). Diagrammet visar att invasionen andelen MC58 och MC58siaD - har stor betydelse jämfört med α14 (** p <0,01). Extrem betydelse visas när MC58 eller MC58siaD -, respektive, jämfördes med α14 (***, p <0,001) och MC58siaD - jämfördes med MC58 (###, p <0,001). Skala barer indicate 10 | j, m. . Diagrammet i D publicerades ursprungligen i Borkowski et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10,1186 / s12974-014-0163-x (2014); re-print med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelcellerna i CP bilda BCSFB som separerar CSF från blodet 2,3. Vi etablerade nyligen HIBCPP cellinje som en funktionell mänsklig modell av BCSFB. Cellerna visa viktiga barriärfunktioner BCSFB in vitro, bland annat utveckling av en hög membranpotential, en låg permeabilitet för makromolekyler, liksom närvaron av kontinuerliga strängar av TJs 5. De TJ-proteinerna bidrar till en apikal / basolateral polaritet av cellerna. Polariteten är av stor betydelse för en riktad lokalisering av ytreceptorer samt specifika transportproteiner. Vi har visat polära lokalisering av receptorerna ECAD och uppfyllts, liksom medlemmar av den ATP-bindande kassett (ABC) transportör familj som har en mycket kontrollerad mikro inom CNS 6,7.
Det finns flera mikroorganismer som kan få tillträde till CNS genom att övervinna BCSFB, leading till svår sjukdom, inklusive meningit 8. En av de patogener som har förmåga att invadera in i CP epitelceller är den Gram-negativa bakterien N. humanspecifik meningitidis 9,10, vilket har visats för att ange HIBCPP celler i ett polärt mode specifikt från den basolaterala cellsidan 5. Detta är den fysiologiskt relevant riktning för infektion i hjärnan över BCSFB när bakterier sprida och möter CP epitelceller från blodet under loppet av meningit. Att återspegla denna situation in vitro, är HIBCPP celler odlade på den undre sidan av filtret. I motsats till den standardfilterinsatsen modell, där celler ympas in i den övre avdelningen, tillåter denna uppsättning upp av en inverterad kultursystem för att infektera epitelceller specifikt från den basolaterala cellsidan 5,21.
Basolateral invasion i HIBCPP celler har observerats för de två patogena N. meningitidis -, medan den icke-patogena bärare isolera α14 visas endast marginell invasion 15. Detta visar att cellmodell HIBCPP ger möjlighet att söka efter tillgängliga muterade bibliotek för nya virulensfaktorer inblandade under invasionen processen. Anmärkningsvärt, har det visat sig att andra patogener inklusive L. monocytogenes och Streptococcus suis (S. suis) invaderar HIBCPP celler i en polär mode 5,7.
För att känna igen och svara på invaderande mikroorganismer i CNS, epitelceller i cellprocessorn uttrycka PRRs 22,23. TLR utgör en viktig familj i PRRS. Kvalitativ RT-PCR-analyser visade att HIBCPP celler uttrycker flera TLR samt relaterade co-receptorer och adaptermolekylen MyD88 15. Det har observerats att receptorerna TLR2 och TLR4 är involverade i den cellulära försvarsreaktion till N. Meningitidis kapselpolysackarider 24. Ytterligare resultat från en microarray metod avslöjade att HIBCPP celler infekterade med N. meningitidis visar en induktion av signaltransduktionsvägar, bland andra faktorer också involverar transkriptionsregulator IκBζ 15, obligatorisk för uttryck av vissa målgener inklusive IL6 25,26, en pro-inflammatorisk cytokin.
För att bekräfta dessa fynd, HIBCPP celler infekterade med N. meningitidis i en inverterad kultursystem har använts för att undersöka frisättning av cytokiner och kemokiner. Det är känt att denna process syftar till att inleda ett inflammatoriskt svar genom aktivering av det medfödda immunförsvaret 13,14. HIBCPP celler producera och utsöndra cytokiner och kemokiner, inklusive CXCL1-3, IL6, IL8 och TNFa 15,16, som har beskrivits för att locka neutrofiler och monocyter 27. Genom att använda vårt modellsystem vifunnit att polymorphnuclear neutrofiler, monocyter och även T-lymfocyter vandrar genom HIBCPP celler 16,28, betonar att HIBCPP celler är lämpliga för att dechiffrera mekanismer för transepitelial migration av immunceller.
Den häri presenterade modellsystem ger också möjlighet för ändringar. HIBCPP celler kan förbehandlas med antikroppar eller kemiska inhibitorer för att identifiera receptorer och signaltransduktionsvägar involverade under infektion. DMSO, ett vanligt lösningsmedel för cellstimulerande reagenser kan användas i lämpliga mängder till HIBCPP celler, som uppvisar stabila barriärfunktioner som inte påverkas av den kemiska hela den undersökta tidsförloppet. Denna egenskap är också relevant för användning av modellen i läkemedelsstudier.
Även om vi har visat att HIBCPP celler visar en viss nivå av polaritet, kommer de inte naturligt återspegla varje enskild detalj i en in vivo-modell. <em> T.ex. lokaliseringen av ABC transportör familjemedlemmar matchar endast delvis de förväntade mönster 6, varför farmaceutiska applikationer kan förmodligen endast tillämpas i begränsad omfattning. Dessutom behöver HIBCPP cellerna inte tycks producera CSF (data ej visade). Trots detta har vi funnit att HIBCPP celler uttrycker proteinerna transtyretin, insulinliknande tillväxtfaktor 2 (IGF2) och forkhead box J1 (FOXJ1) på RNA-nivå 5, som är karakteristiska markörproteiner för CP epitelceller 29,30,31,32 . Denna observation stöder att HIBCPP celler har behållit typiska egenskaper hos CP epitelceller. Viktigare, bör det noteras att HIBCPP celler gör inte är närvarande kontakthämning. Det är därför viktigt att använda celler för experiment när lämpliga Teer värden uppnås. Dessutom bör HIBCPP cellerna inte användas efter passagen 38, eftersom möjligheterna att utveckla en barriärfunktion verkar falla med högre passager. Slutligen, för att studera imphandling av cell-cell-interaktioner under infektioner vid BCSFB en samodling modell som består av CP epitel- och endotel skulle vara av stort intresse, men en sådan modell behöver fortfarande utvecklas.
Sammanfattningsvis kan HIBCPP cellodlingsmodell användas för att avslöja viktiga invasion vägar och underliggande signaltransduktionsvägar, särskilt mänskliga specifika patogener på BCSFB. Eftersom det är känt att de epitelceller CP också är involverade i neurologiska degenerativa sjukdomar inklusive Alzheimers sjukdom samt multipel skleros 2, och även i hjärnan metastas av tumörceller 33, erbjuder systemet i allmänhet en stor variation av möjligheter för undersökning av sjukdomsrelaterade mekanismer, som det finns möjlighet att finna nya terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
