Introduction
Blod-cerebrospinalvæske barriere (BCSFB) er en av de tre barriereseter mellom blod og hjerne 1. Dens morfologiske korrelat er de epitelceller i choroid plexus (CP) 2,3, en endotelial-epitelial sammenrullet, som er sterkt vaskularisert og som er plassert i ventriklene i hjernen. CP tjener til å frembringe i cerebrospinalvæsken (CSF), så vel som å skille sistnevnte fra blodet. For å oppnå barrierefunksjon, CP epitelceller viser en lav pinocytotic aktivitet, uttrykt spesifikke transportører, og er tett forbundet ved hjelp av et kontinuerlig nettverk av tett veikryss (TJs) 2,3.
Humant choroid plexus papilloma (HIBCPP) celler, avledet fra en ondartet choroid plexus papilloma fra et japansk kvinne 4, ble brukt til å konstruere et funksjonelt in vitro modell av BCSFB. HIBCPP celler viser et par av egenskapene til en funksjonell BCSFB som dannelsen av TJtråder, utvikling av en høy transepitelial membranpotensialet som kan bestemmes som transepitelial elektrisk motstand (teer), og mindre permeabiliteter for makromolekyler. Videre HIBCPP celler uttrykker karakteristiske transportører, som kan tjene til å regulere den ioniske mikromiljøet, og viser apikale / basolateral polaritet 5,6,7.
Den BCSFB har vist seg å fungere som en innføringsstedet for patogener (bakterier, virus og sopp) inn i sentralnervesystemet (CNS) 8. Invasjonen av patogener, inkludert Neisseria meningitidis (N. meningitidis), en Gram-negative bakterien, kan føre til alvorlige sykdommer som hjernehinnebetennelse. Bevis for at det overvinner den beskyttende epithelial barriere av CP er støttet av histopatologiske observasjoner hos pasienter med meningokokksykdom stiller økte mengder meningokokker i fartøyene og CP epitelceller 9,10. For å få innpass i vertsceller bacteria ofte kapre endocytotic mekanismer, som er mediert eller utløses av spesifikke overflatereseptorer plassert på vertsceller. Siden interaksjoner av patogener med disse reseptorene kan være artsspesifikt 11, dyremodeller kan bare bli konsultert i et begrenset omfang. Den HIBCPP cellelinje gir anledning til å studere invasjonsprosessen, så vel som de underliggende molekylære mekanismer i et menneske modellsystem. Ansette cellekultur inserts gjør oss i stand til å analysere interaksjoner av patogener med vertsceller fra to forskjellige celle sider. Mange bakterier, inkludert N. meningitidis, er sterkt utsatt for virkningen av tyngdekraften under infeksjon analyser. For optimal interaksjon av patogener med HIBCPP celler under assayene, blir bakteriene innledningsvis lagt inn i det øvre kammer i cellekulturen filterinnsatsen system. For å muliggjøre smitte fra den apikale eller den basolateral celleside, henholdsvis, har to varianter av in vitro-system vært established: I standardsystemet HIBCPP Cellene blir sådd ut i det øvre rom av filterinnsatsen, etterligne den situasjon når mikroorganismene er plassert på CSF-side og komme i kontakt med den apikale side av cellene (figur 1A, C). I motsetning til ved hjelp av HIBCPP celler i en omvendt cellekultur filterinnsats system gjenspeiler forholdene når bakterier har kommet inn i blodstrømmen. Mikroorganismer spre i blodet og støter CP epitelceller fra den basolateral side (figur 1 B, D). Verdt å merke seg, i dette modellsystemet er det blitt vist at bakterier invadere HIBCPP celler i et polart måte spesielt fra basolateral celleside 5,7.
Deretter til infeksjon av CP, kan de invaderte patogener bli gjenkjent av det medfødte immunsystemet gjennom ligation til mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS). Godt beskrevet medlemmer av PRRS tilhører Toll-like receptor (TLR) familie. kan TLRs bind for å karakteristiske strukturer av smittsomme mikroorganismer, som er betegnet patogen-assosiert molekyl mønstre (PAMPs). Ligering av reseptorene fører til aktivering av vertscellesignalisering kaskader som utløser ekspresjon av cytokiner og kjemokiner 12, som i sin tur stimulerer transmigrasjon av immunceller på tvers av BCSFB 13,14. Det har vist seg at HIBCPP celler uttrykker flere TLRs på mRNA-nivå og at infeksjon med N. meningitidis fører til utskillelse av flere cytokiner og chemokiner, inkludert CXCL1-3, IL6, IL8 og TNFa 15,16.
Her beskriver vi dyrking og infeksjon av human cellelinje HIBCPP i en omvendt cellekultur innsatsen system som gjenspeiler BCSFB. Dette modellsystem gjør det mulig å studere interaksjoner av patogener med in vivo aktuelle basolateral celle side så vel som den etterfølgende cellulære respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered cellekultur Filter Innsetting for Seeding HIBCPP celler i en invertert Model System
- Pre-varme DMEM / F12 (Ham) supplert med 5 ug / ml insulin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% føtalt kalveserum (FCS).
- Bruk steril tang til å plassere 0,33 cm² vekst i området cellekultur filterinnsatser med en porestørrelse på 3 um opp-ned i en 12-brønns plate (figur 1E).
- Fyll medium inn i det nedre kammeret av cellekulturen filterinnsatsen (ca. 3 ml) og 100 ul på toppen av filterinnsatsen. Oversvømme plate, så vel som det nedre kammeret med medium. Aspirer dreven medium på en slik måte at det nedre rom av filterinnsatsen forblir fylt (figur 1E).
Merk: Det anbefales å bruke en serologisk pipette for dette trinnet. - Dekk 12-brønns plate med lokket og overfører de fremstilte cellekultur filterinnsatser til inkubatoren, 37 ° C,5% CO2 inntil tilsetningen av cellene.
2. Dyrking og aging av HIBCPP Cells
- Forbered DMEM / F12 (Ham) supplert med 5 ug / ml, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% FCS.
- Pre-varme medium og PBS i et 37 ° C vannbad. Aspirer medium fra kolbe. Tilsett 10 ml PBS til kolben og virvel. Gjenta dette trinnet en gang.
- Tilsett 3 ml 0,25% trypsin-EDTA til kolben og virvel. Plasser inn i inkubatoren, 37 ° C, 5% CO2.
- Etter ca 20 min fjernes kolben fra inkubatoren. Sikre at cellene er løsrevet fra bunnen av kolben og viser en rund form når undersøkt med mikroskop.
Merk: Cellene ikke løsner helt fra hverandre og er ofte funnet i agglomerater. Det anbefales å bruke cellene opp til passering 38. - For å stoppe trypsinering legge 17 ml medium. Resuspender cellene ved å pipettere opp og ned og overfører suspensjoneni et 50 ml rør. Sentrifuger ved 50 xg i 10 min ved romtemperatur.
- Resuspender cellene i et passende volum av medium og telle cellene ved å benytte et hemocytometer.
Merk: Konsentrasjonen av resuspendert HIBCPP cellene skal være 1 x 10 6 celler / ml. For vedlikehold av HIBCPP celler er det foreslått å overføre en mengde på 1-6 x 10 6-celler i 10 ml medium til en T75-kolbe. Endre medium annenhver dag.
3. Seeding Inverted Cell Culture filterinnsatser med HIBCPP Cells
- På toppen av hver invertert filterinnsats (dvs. den nedre side av filteret) tilsett 80 pl cellesuspensjon (dvs.. 8 x 10 4 celler) (figur 1E).
Merk: Kontroller at cellene er jevnt fordelt i suspensjon ved å snu røret før seeding. - Dekk seeded-cellekultur filterinnsatser med lokket på 12-brønns plate og overføring til inkubatoren, 37 ° C, 5% CO 2.
- På den første dagen, fyll 1 ml medium inn i brønnene til en 24-brønns plate. Løft cellekulturfilterinnsatser ved hjelp av tang ut av 12-brønns plate, kast medium inne, slår filterinnsatser og plassere dem i standard orientering i forberedt 24-brønns plate (figur 1E).
- Plassere cellene i friskt medium hver annen dag. Forbered 24 brønner med friskt medium og overføre filterinnsatser til det. Fyll innsatser med 0,5 ml friskt medium. Sjekk Teer hver dag som beskrevet i kapittel 4.
- Når Teer verdier av HIBCPP seeded-celler i cellekulturinnsatser overstiger 70 Ω x cm² (ca. 4 dager etter såing), deretter fortsettes cellekultur i medium inneholdende 1% FCS og 5 ug / ml insulin. Fremstille 24-brønners plater med 1 ml medium til hver brønn. Overfør filterinnsatser til de preparerte brønner og vekslingsmedium i det øvre kammeret.
Merk: Denne serum tilbaketrekking etter confluency fører til dannelsen aven høyere membranpotensialet. - Aspirer medium fra filterrommet, overføring til godt forberedt og fyll med 500 mL medium. Gjenta dette trinnet en gang. Sette cellene over natten i inkubatoren, 37 ° C, 5% CO2.
4. Måling av transepitelial elektrisk motstand (Teer)
- Fordyp elektrode tips av epitelvev voltohmmeter i 15 minutter i 80% etanol. Overfør voltohmmeter under panseret og la elektrode tørke i et øyeblikk. Plassere elektroden i respektive benyttede kulturmediet for cellene i ytterligere 15 min for å likevekts.
- Utføre målinger ved å plassere den lengre arm av elektroden, slik at den berører undersiden av det nedre kammeret hver gang, setter den kortere arm inn i filterinnsatsen rommet.
Merk: Motstandsverdiene av cellekulturfilterinnsatser uten celler i mediet skal brukes som tomme verdier ((målt verdi (Ω) - tom verdi (Ω)) x filteroverflate (dvs. 0,33 cm²)). - Etter måling sted elektroden tilbake i 80% etanol i 15 min. Oppbevar på et tørt rør.
5. Fastsettelse av paracellulære Permeabilitet
- Oppløs 1 g FITC-Inulin i 200 ml dyrkingsmedium supplert med 5 pg / ml insulin 1% FCS. Anvende 50 ug / ml av oppløsningen inn i det øvre filterrommet før infeksjon av cellene.
- Etter infeksjon samle mellomprøver fra den nedre godt for å bestemme hvor mye Inulin føres fra filterrommet gjennom cellelaget.
- Fremstille et FITC-Inulin standardløsning og utføre 1: 2 fortynninger, 10 ganger (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% og 0%) . Bestemme fluorescens ved måling av alle prøver i mikroplateleser.
6. Utarbeidelse av bakterier for smitte av HIBCPP Cells på cellekultur filterinnsatser
- En dag før forsøket, skrape than frosset N. meningitidis påkjenningen av en glyserol lager og strek ut på Chocolate Agar med Vitox. Vokse over natten i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Utdrag 20-30 kolonier fra de natten kultur og overfør til et rør inneholdende 8 ml proteose pepton medium supplert med 0,042% NaHCO3, 0,01 M MgCl2 og 1% Polyvitex.
- Rist bakterier i 1,25 timer ved 220 rpm, 37 ° C. Pelletere bakteriene ved sentrifugering ved 2684 g i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatant og resuspender den bakterielle pellet med 8 ml serumfritt medium. Vortex for å sikre en jevn suspensjon.
- For å bestemme kultur densitet, måler en fortynning på 1:10 ved en optisk tetthet (OD) på 600 nm. Juster bakteriesuspensjonen til en OD 600 på 0,1.
Merk: Denne suspensjon inneholder ca.. 1 x 10 8 CFU / ml. - For å bekrefte den bakteriecellekonsentrasjonen, fortynne suspensjonen trinnvis (01:10) opp til enfortynning av 10 -5 og plate på Chocolate Agar plater.
Merk: Liknende serielle fortynninger må utføres for å beregne bakterievekstkurver.
7. Infeksjon i HIBCPP Cells på cellekultur filterinnsatser og bestemmelse av bakteriell invasjon av Double immunfluorescens
- Etter vedvarende cellekultur i medium inneholdende 1% FCS og 5 ug / ml insulin, måle celler hver dag ved hjelp av en epitelvev voltohmmeter. Hvis cellene har nådd en Teer på rundt 500 Ω x cm², utføre infeksjon.
- Infisere cellene med den fremstilte bakteriesuspensjon ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10. Vogn de infiserte celler i inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i den angitte tidsperiode.
Merk: MOI kan beregnes ved å ta hensyn til antall celler pr cellekultur filterinnsats ved konfluens (1,21 x 10 6 celler / cm2). - Stopp infisereion ved vasking tre ganger med 500 ul serumfritt medium (SFM) inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) anvendt til filterrommet, 1 ml til det nedre kammer.
- Blokk med 500 ul SFM inneholdende 1% BSA-buffer i filterrommet og 1 ml i det nedre rom i 20 minutter ved romtemperatur for å hindre klebing av antistoffer mot uspesifikke bindingsseter.
- Inkuber med 100 ul primært antistoff anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) i filterrommet og 500 ul i det nedre rom i 20 minutter ved romtemperatur.
Merk: Hvis det er nødvendig, må antistoffkonsentrasjonen som skal titreres. - Vask cellene ved å aspirere mediet fra filterrommet, overføre filterinnsatsen til en forberedt godt med 1 ml SFM inneholdende 1% BSA og fylle tømt filterrommet med 500 mL SFM inneholder 1% BSA. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Feste cellene med 500 ul 4% formaldehyd i filteret selrtment, 1 ml i det nedre rom i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene ved å aspirere mediet fra filterrommet, overføre filterinnsatsen til en forberedt godt med 1 ml PBS og fylle tømt filterrommet med 500 mL PBS. Gjenta dette trinnet en gang.
Merk: Prøver kan bli lagret over natten i PBS ved 4 ° C. - Snitt faste cellekultur filtrerer ut av innsatsene og vask med 250 pl PBS inneholdende 1% BSA. Inkuber cellene i 15 minutter ved romtemperatur med 250 ul fluorescens-merkede (eksitasjon bølgelengde 594 nm) sekundært antistoff kylling anti kanin (1: 500) for å flekke ekstracellulære bakterier.
Merk: Hvis det er nødvendig, må antistoffkonsentrasjonen som skal titreres. - Permeabilisere cellene med 250 ul PBS inneholdende 1% BSA og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved romtemperatur. Vask cellene tre ganger med 250 ul PBS inneholdende 1% BSA.
- Inkuber med 250 mL primært antistoff anti N. meningitidis
- Påfør 250 mL av fluorescerende merket (eksitasjon bølgelengde 488 nm) sekundært antistoff (1: 500), fluorescerende merket (eksitasjon bølgelengde 660 nm) Phalloidin (1: 250) og 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ( 1: 50000) i 1 time ved romtemperatur for å farge ekstra- og intracellulære bakterier, aktin cytoskjelettet og kjerner.
Merk: Hvis det er nødvendig, må antistoffkonsentrasjonen som skal titreres. - Vask cellene tre ganger med 250 ul PBS inneholdende 1% BSA. Embed cellene i monteringsmedium og oppbevares ved 4 ° C inntil undersøkelse via mikroskop.
- Bestem antall invadert bakterier per forhåndsdefinerte felt. Gjør dette ved å telle 20 felt per filter membran. Beregn prosentandelen av invaderte bakterier.
Merk: Multipliser gjennomsnittet bakterietallet i de 20 mikroskopiske felt med et areal coefficient. Resultatet uttrykker mengden av totale bakterier tilstede i en 0,33 cm² cellekultur filterinnsats. Dele denne verdi ved mengden av bakterier som var dyrket i mediet i løpet av varigheten av infeksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi dyrking og infeksjon av HIBCPP celler i en omvendt cellekultur insert system. Denne modellen gjør det mulig for oss å studere invasjon mekanismer og de underliggende molekylære signalveier fra basolateral celle siden, reprodusere en fysiologisk situasjon bakterier sprer og inn epitelceller via blodet (figur 1).
De HIBCPP cellene vise enkelte barrierefunksjoner, noe som gjør dem i stand til å begrense molekylære utveksling til et minimalt nivå. Dette oppnås ved uttrykket av adherens krysset (AJ) og stram junction (TJ) proteiner. Immunofluorescens-analyse av de TJ-assosierte proteiner Occludin, claudin og ZO-1 viste en uavbrutt signal på områder av celle-celle kontakt, noe som viser at cellene er forbundet med hverandre ved kontinuerlige tråder av TJS (figur 2A, B, C). En detaljert inntrykk av than TJ morfologi er blitt oppnådd ved transmisjonen (figur 2D) og fryse fraktur-elektronmikroskopi (figur 2E), noe som viser at TJS ligger mellom cellene og danner brede, stormasket kabel-lignende strukturer.
TJS av epitelceller også fungere som et gjerde for å skille apikale og basolaterale membran domener, bidrar derfor til cellulær polaritet. Blant de proteiner som uttrykkes utelukkende på basolateral celle side av HIBCPP celler, er de AJ protein E-cadherin (ECAD) og hepatocytt-vekstfaktor-reseptor (HGF / Met), som vist ved immunofluorescens-analyse på figur 3, som peker til en viss grad av polaritet.
Når dyrket under egnede betingelser HIBCPP celler utviser også typiske barriere funksjoner av BCSFB som dannelsen av en membranpotensialet, så vel som en lav permeabilitet for macromolecules. Bestemmelse av membranpotensialet kan oppnås ved måling av teer med bruk av en voltohmmeter. Permeabiliteten til cellelaget blir kvantifisert ved anvendelse av FITC-merket Inulin, et sukker som passerer sjiktet i en paracellulære måte. Her viser vi Resultatene fra et representativt eksperiment som demonstrerer at disse barrierefunksjoner forblir stabil og viser ingen følelser ved standard konsentrasjoner av dimetylsulfoksid (DMSO), et felles oppløsningsmiddel for celle-stimulerende kjemikalier. Som det fremgår av figur 4A, ble teer verdier registrert før og etter eksponering av celler til HIBCPP DMSO.
Cellene viste et høyt membranpotensialet som nådde opp til 500 Ω x cm² ved begynnelsen av eksperimentet for alle forhold. Den målte Teer endret seg ikke etter 2 timer for celler behandlet med opp til 0,2 volum% DMSO. I motsetning til dette, teer verdier ble redusert på en doseavhengig måte when høyere volumer ble brukt (figur 4A). Denne reduksjonen i membranpotensialet var samtidig med en økt permeabilitet for makromolekyler. Mens tilsetning av DMSO for å HIBCPP celler opp til 0,5 vol% resulterte ikke i en økning permeabilitet for Inulin, vist 1 vol% og 2% vol en virkning, om enn i begrenset grad (figur 4B). Videre sjekkes vi påvirkning av Cytochalasin D, er en potent inhibitor av aktin polymerisering på membranpotensialet og permeabilitet av HIBCPP celler. Behandling av cellene med 1 ug / ml Cytochalasin D fører til en betydelig nedgang av teer verdier så vel som en økning av FITC-Inulin fluks (figur 4A, B). Denne effekten kan forklares ved åpningen av TJS forårsaket av Cytochalasin D.
Den HIBCPP cellelinjen som en modell av BCSFB kan anvendes for å studere interaksjoner av patogener og barrieredannende epitelceller. Det er bevisat bakterien N. meningitidis får innpass i CNS ved krysset BCSFB. Det har vist seg at Neisseria invadere HIBCPP celler spesifikt fra basolateral celle side, som er relevant in vivo. I løpet av denne prosessen spiller bakteriell kapsel en viktig rolle: Capsule-mangler mutanter viser økt invasjonen i HIBCPP celler 5. I det følgende skal vi sammen basolateral invasjon av MC58 belastning 17, dens isogene mutant MC58siaD - mangel for kapselen produksjons 17 og innkapslet bære isolere α14 19,20. HIBCPP-celler ble infisert med de stammene som er nevnt ovenfor i løpet av en tid løpet av 4 timer ved en MOI på 10. Immunofluorescens-analyse viste signifikante invasjon for de to patogene stammer MC58 og MC58siaD -, mens bare mindre invasjonsrater ble observert for apathogenic α14 stamme ( Figur 5A). En representant bilde av dobbel immunofluorescence mikroskopi av HIBCPP celler infisert med de respektive belastning er vist i figur 5A, B og C.
Fig. 1: Standard og Inverted cellekultursystem I et standard cellekultursystem (A, C) interaksjon av bakterier med CP epitelceller kan undersøkes ved den apikale celle side, som er betegnet med mikrovilli. Den omvendte cellekultursystem (B, D) gjør det mulig å studere bakteriell interaksjon med basolateral cellemembranen, som er involvert i bakteriell invasjon via blodet inn i CNS. For den inverterte cellekultur (E) HIBCPP Cellene blir sådd ut på undersiden av filterinnsatser. Den nedre vel inkludert det indre kammeret av filterinnsatsen er oversvømmet med medium. Subsequently, er den overdrevne mediet suget på en slik måte at det indre rom av filterinnsatsen forblir fylt. På den første dagen etter såing, er cellekultur filterinnsatser snudd og fylt med medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. HIBCPP Cells Vis Kontinuerlige Strands av TJs TJ proteiner ZO-1 (A), ble Occludin (B) og claudin-en (C) oppdaget i HIBCPP celler. Paneler AC vise Apotome bilder. Midten av hvert panel: xy en face visning av cellene; topp og høyre side: tverrsnitt av flere optiske skiver gjennom z -planet. Skala barer indikerer 10 mikrometer. TJ strukturen av HIBCPP-celler ble analysert ved TRANSMISsion elektronmikroskopi. Cellene er innbyrdes forbundet ved hjelp av TJS som er indikert med piler (D). Skalaen linjen viser en mikrometer. Fryse fraktur elektron mikroskopi studier visual tett masket TJ tråder (E). Den Scale bar = 0,5 mikrometer. Bildene i denne figuren ble opprinnelig publisert i Schwerk et al, Plos One 7: e30069, doi:. 10,1371 / journal.pone.0030069 (2012); re-print med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Uttrykk for Reseptor proteiner involvert Under invasjonen av bakterier i HIBCPP Cells Immunofluorescensanalyse viser uttrykk for ECAD (A) og Met (B) ved basolateral cellen side.. den pictures vise Apotome bilder. Midten av hvert panel: xy en face visning av cellene; topp og høyre side: tverrsnitt av flere optiske skiver gjennom z -planet. Den apikale membran av HIBCPP-celler (indikert ved piler) er plassert mot toppen av den øvre del, så vel som mot høyre på høyre side, henholdsvis, for hver ramme. Skala barer = 10 mikrometer. Dataene i dette tallet ble også publisert tidligere i Gründler et al, Mikrober infisere 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); re-print med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Influence of DMSO og Cytochalasin D på barrierefunksjonen HIBCPP Cells Påvirkning av barriere func.sjon blir bestemt ved måling av teer verdier og FITC-Inulin-Flux. Resultater er vist for en representativ forsøk, som ble utført i tre paralleller. HIBCPP celler ble behandlet med DMSO samt Cytochlalasin D i de angitte mengder i 2 timer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Når de anvendes i konsentrasjoner opp til 0,2 vol%, ikke DMSO ikke påvirker membranpotensialet (figur 4A). Konsentrasjoner i området fra 0,1 vol% til 0,5 vol% av DMSO heller ikke påvirke paracellulære permeabilitet av cellene (figur 4B). I motsetning til dette forårsaker en ug / ml Cytochalasin D en reduksjon i teer samtidig med en økning av FITC-Inulin-Flux gjennom cellelaget (figur 4A, B).
Figur 5: Invasion of N. meningitidis inn HIBCPP Cells. Dobbelt immunfluorescens mikroskopi viser invadert (grønn) og levd (gule) bakterier. Hvite boksene i bilder representerer forstørret bilde detalj på høyre side. Basolateral invasjon ble observert for N. meningitidis-stammer MC58 (A) og MC58siaD -, mangelfull for kapselen produksjons (B), mens bare en mindre invasjonshastigheten ble bestemt for α14 (C). Diagrammet viser at invasjonen priser på MC58 og MC58siaD - har stor betydning i forhold til α14 (**, p <0,01). Ekstrem betydning vises når MC58 eller MC58siaD -, henholdsvis, ble sammenlignet med α14 (***, p <0,001) og MC58siaD - ble sammenlignet med MC58 (###, p <0,001). Scale barer indicate 10 mikrometer. . Diagrammet i D ble opprinnelig publisert i Borkowski et al, J nevroinflammasjon 11: 163, doi: 10,1186 / s12974-014-0163-x (2014); re-print med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelceller CP danner BCSFB som skiller CSF fra blodet 2,3. Vi har nylig etablert HIBCPP cellelinjen som en funksjonell menneskelig modell av BCSFB. Cellene vise viktige barriere funksjoner av BCSFB in vitro, inkludert utvikling av en høy membranpotensialet, en lav permeabilitet for makromolekyler, så vel som tilstedeværelse av kontinuerlige tråder av TJS 5. TJ proteiner som bidrar til en apikal / basolateral polaritet av cellene. Polariteten er av stor betydning for en rettet lokalisering av overflatereseptorer, så vel som spesifikke transportørproteiner. Vi har vist polar lokalisering av reseptorene ECAD og møtte så vel som medlemmer av ATP-bindende kassett (ABC) transporter familie som opprettholder en svært kontrollert mikromiljøet innen CNS 6,7.
Det er flere mikroorganismer som er i stand til å få innpass i CNS ved å overvinne BCSFB, leading til alvorlig sykdom, inkludert hjernehinnebetennelse 8. En av de patogener som er i stand til å invadere inn i CP epitelceller er det human-spesifikke Gram-negativ bakterie N. meningitidis 9,10, noe som har vist seg å gå inn HIBCPP celler i et polart måte spesielt fra basolateral celleside 5. Dette er det fysiologisk relevante retning for infeksjon i hjernen på tvers av BCSFB når bakterier spre og støter CP epitelceller fra blodet i løpet av hjernehinnebetennelse. For å reflektere denne situasjonen in vitro, er HIBCPP celler dyrket på undersiden av filteret. I motsetning til standard filterinnsatsen modell, hvor cellene blir sådd ut i det øvre kammeret, dette er satt opp av en invertert kultursystem gjør det mulig å infisere epitelceller spesielt fra basolateral celleside 5,21.
Basolaterale invasjonen i HIBCPP celler har blitt observert for to patogene N. meningitidis -, mens den ikke-patogene carrier isolere α14 vises kun marginal invasjonen 15. Dette illustrerer at HIBCPP cellen modellen gir mulighet for å søke etter tilgjengelige mutante biblioteker for nye virulens faktorer involvert under invasjonen prosessen. Verdt å merke seg, har det blitt demonstrert at andre patogener inkludert L. monocytogenes og Streptococcus suis (S. suis) invadere HIBCPP celler i en polar mote 5,7.
For å kunne gjenkjenne og reagere på invaderende mikroorganismer inn i CNS, epitelceller CP uttrykker PRRS 22,23. TLRs representerer en viktig familie innenfor PRRS. Kvalitativ RT-PCR-analyser viste at HIBCPP celler uttrykker flere TLRs samt tilhørende co-reseptorer og adapteren molekylet MyD88 15. Det har blitt observert at reseptorene TLR2 og TLR4 er involvert i den cellulære forsvaret reaksjonen til N. Meningitidis kapselpolysakkarider 24. Ytterligere resultater fra en microarray tilnærming avdekket at HIBCPP celler infisert med N. meningitidis vise en induksjon av signaltransduksjonsveier, blant andre faktorer også involverer transkripsjon regulator IκBζ 15, obligatorisk for uttrykk av visse målgener inkludert IL6 25,26, en pro-inflammatorisk cytokin.
For å bekrefte disse funnene, HIBCPP celler infisert med N. meningitidis i en invertert kultursystem har blitt brukt for å undersøke frigjøring av cytokiner og kjemokiner. Det er kjent at denne fremgangsmåte tar sikte på å iverksette en inflammatorisk respons ved aktivering av den medfødte immunsystemet 13,14. HIBCPP celler produsere og utskille cytokiner og chemokiner, inkludert CXCL1-3, IL6, IL8 og TNFa 15,16, som har blitt beskrevet å tiltrekke nøytrofile granulocytter og monocytter 27. Ved å ansette vår modell systemet vifant at polymorphnuclear nøytrofile, monocytter og også T-lymfocytter vandrer gjennom HIBCPP celler 16,28, understreker at HIBCPP celler er egnet til å tyde mekanismer for transepitelial migrasjon av immunceller.
Den her presenteres modellsystem tilbyr også muligheten for modifikasjoner. HIBCPP celler kan være forbehandlet med antistoffer eller kjemiske inhibitorer for å identifisere reseptorer og signaltransduksjonsveier som er involvert i infeksjonen. DMSO, et felles løsemiddel for celle stimulerende reagenser kan brukes i passende volumer til HIBCPP celler, som viser stabile barrierefunksjoner som ikke er berørt av den kjemiske hele undersøkt tid kurset. Denne egenskapen er også relevant for bruk av modellen i farmasøytiske studier.
Selv om vi har vist at HIBCPP celler viser en viss grad av polaritet, vil de ikke nødvendigvis naturlig hver eneste detalj av en in vivo-modell. <em> Eg lokalisering av ABC transporter familiemedlemmer bare delvis matcher de forventede mønstre 6, hvorfor farmasøytiske applikasjoner kan trolig bare brukes på et begrenset omfang. Dessuten gjør de HIBCPP cellene ikke ut til å produsere CSF (data ikke vist). Likevel har vi funnet ut at HIBCPP celler uttrykker proteiner transthyretin, insulin-like growth factor 2 (IGF2) og gaffelhodeboks J1 (FOXJ1) på RNA nivå 5, som er karakteristiske markørproteiner for CP epitelceller 29,30,31,32 . Denne observasjonen støtter at HIBCPP celler har beholdt typiske egenskaper av CP epitelceller. Viktigere, bør det bemerkes at HIBCPP cellene ikke til stede kontakt-inhibering. Det er derfor viktig å bruke cellene for eksperimentering når egnede Teer verdier er nådd. Videre HIBCPP cellene bør ikke brukes etter passasje 38, siden potensialet til å utvikle en barrierefunksjon synes å falle sammen med høyere passasjer. Til slutt, for å studere imphandling av celle-celle interaksjoner ved infeksjoner ved BCSFB en co-kultur modell bestående av CP epitel og endotel ville være av stor interesse, men en slik modell må videreutvikles.
Som konklusjon kan HIBCPP cellekultur modellen brukes til å avdekke viktige invasjons trasé og underliggende signaltransduksjonsveier, spesielt på menneske-spesifikke patogener på BCSFB. Som det er kjent at epitelceller CP er også involvert i nevrologisk degenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom så vel som multippel sklerose 2, og også i hjernemetastase av tumorceller 33, gir systemet generelt en stor variasjon av muligheter for undersøkelse av sykdomsrelaterte mekanismer, som gir mulighet for å finne nye terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
