Summary
Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour produire des récepteurs de cellules T spécifiques de l'antigène (TCR) par couplage du TCRa ou TCRβ d'un TCR existant, possédant l'antigène de la spécificité d'intérêt, avec hemichain complémentaire du répertoire des récepteurs des cellules T périphériques. Les TCR de novo générés conservent l' antigène de spécificité avec une affinité variable.
Abstract
Les récepteurs des cellules T (TCR) sont utilisés cliniquement pour diriger la spécificité des lymphocytes T à cibler des tumeurs en tant que modalité prometteuse de l'immunothérapie. Par conséquent, le clonage des TCR spécifiques de divers antigènes associés à des tumeurs a été l'objectif de nombreuses études. Pour provoquer une réponse efficace des lymphocytes T, le TCR doit reconnaître l'antigène cible avec une affinité optimale. Cependant, le clonage tel TCR a été un défi et beaucoup disponibles TCR possèdent une affinité sous-optimale pour l'antigène correspondant. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de clonage de novo TCR spécifiques de l'antigène à haute affinité en utilisant des TCR existants en exploitant hemichain centricity. Il est connu que pour certains TCR, chacun TCRa ou TCRβ hemichain ne contribuent également à la reconnaissance de l'antigène, et le hemichain dominant est désigné sous le nom hemichain centrée. Nous avons montré que par l'appariement du hemichain centric avec des contre-chaînes différentes de la contre-chaîne d'origine, nous sommes en mesure de maintenir l'antigène specificity, tout en modulant sa force d'interaction pour l'antigène correspondant. Ainsi, le potentiel thérapeutique d'un TCR donné peut être améliorée en optimisant l'appariement entre les centriques et la contre-hemichains.
Introduction
Les récepteurs des cellules T (TCR) sont des récepteurs immunitaires adaptatives hétérodimères exprimés par les lymphocytes T, constitués d'une chaîne TCRa et TCRβ. Elles sont produites par un réarrangement somatique de V (D) des segments de gène J, qui produit un répertoire très diversifié capable de reconnaître des configurations pratiquement illimitées de complexes HLA / peptide. Cliniquement, les cellules T modifiées pour exprimer clonotypique spécifiques des TCR pour des antigènes associés à une tumeur ont montré une efficacité dans une variété de cancers 1. Cependant, de nombreux clones de TCR à cet effet, ne disposent pas une affinité suffisante pour l'antigène d'intérêt, ce qui limite leur application thérapeutique.
Ici, nous décrivons une méthode pour surmonter cette limitation pour les TCR existants en exploitant la chaîne Centricity. Il a été rapporté que l' un hemichain TCR pourrait jouer un rôle plus important dans la reconnaissance de l'antigène cible 2, appelé ici centricity. analyses structurales de Crystal ont montré que l'une centréehemichain d'un TCR pourrait représenter la majorité de l'empreinte sur le CMH / peptide complexe 3,4. En utilisant ce concept, nous avons déjà démontré que le SIG35α TCRa peut jumeler avec un répertoire varié de chaînes TCRβ et maintenir la réactivité contre le peptide MART1 27-35 présenté par HLA-A2 5. Des résultats similaires ont été obtenus avec le RCT TAK1, où le hemichain TCRβ centré sur apparié avec différentes chaînes TCRa et maintenu la réactivité du peptide 235-243 WT1 présenté par HLA-A24 6. Deux MART1 et WT1 sont des antigènes associés aux tumeurs. Chain-centricity a également été appliquée à l' étude reconnaissance de l' antigène des cellules tueuses naturelles (iNKT) TCR invariants CD1d-restreintes, en associant l'invariant chaîne Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRa des TCR iNKT humaines avec différentes chaînes Vβ11 TCRβ 7.
Dans tous les cas, nous avons été en mesure de générer un répertoire de novo de TCR par transduction du TCR hemichain centrée sur les cellules T du sang périphérique, où le hemichain introduit jumelé avec le TCRa endogène ou TCRβ contre-chaînes. En substance, la hemichain centrée sert d'appât qui peut être utilisé pour identifier les contre-chaînes appropriées, qui forment ensemble une fois appareillé TCR qui maintiennent la spécificité de l'antigène d'intérêt, mais variant d'affinité. De ces nouveaux répertoires, nous avons été en mesure d'isoler TCR clonotypiques avec une meilleure résistance à l'interaction contre l'antigène cible par rapport à TCR pré-existantes. Par conséquent, nous croyons que cette méthode permettra d'accélérer le pipeline d'identifier les TCR optimales pour l'application clinique.
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Protocol
1. Préparation de rétrovirale codant pour TCR Hemichain d'intérêt
- Linéariser pMX vecteur pour permettre l'insertion d'un gène de TCR dans des étapes ultérieures. Digérer l'ADN du plasmide avec EcoRI et Notl enzymes de restriction à 37 ° C pendant 3 heures ( voir le tableau 1) 8.
- Effectuer une électrophorèse du plasmide digéré sur un gel d'agarose à 1,2%. Bande d'accise d'environ 4500 paires de bases (pb), et éluer dans 30 ul d'eau stérile en utilisant des kits disponibles dans le commerce d'extraction de gel 9.
- Design 5 'et 3' des amorces pour le gène TCR d'intérêt qui codent également 15-20 pb chevauchant le site de digestion EcoRI et Notl du vecteur pMX, respectivement 8.
- Amplifier gène TCR avec des amorces. Effectuer l'électrophorèse du produit de PCR et la bande éluat d'environ 1000 bps comme décrit dans l'étape 1.2.
- Clone gène TCR dans le vecteur digéré en combinant chaque fragment linéaire avec le plasmide disponible dans le commerceEnsemble maître de réactifs de mélange et incubation à 50 ° C pendant 1 h.
REMARQUE: Se reporter au protocole du fabricant pour les volumes relatifs de chaque composant. Ce procédé d'assemblage est basé sur la technique décrite à l' origine par Gibson et al. , 10. - (Facultatif) gène Tag TCR pour marquer les cellules transduction avec la forme tronquée du récepteur du facteur de croissance nerveuse humaine (ANGFR, acides aminés 1-277) 11 séparés par furine site de clivage, la sérine-glycine linker, et 2A séquences 12,13. Concevoir des amorces codant pour des séquences qui se chevauchent les extrémités du fragment et assembler le plasmide comme décrit dans les étapes 1,3-1,5.
REMARQUE: Ces séquences peuvent être trouvées dans les références 11-13. - Transformer E. chimiquement compétente coli avec le plasmide assemblé suivant le protocole du fabricant 14. Semences transformées bactéries sur des plaques d'agar (20 mg / ml de bouillon de lysogénie (LB), 15 mg / ml d'agar et 1 pg / ml d'ampicilline) et on incube à 37 ° C pendant 18 h. Culture une colonie bactérienne unique dans 50 ml de milieu LB (20 mg / ml LB et 1 pg / ml d'ampicilline) pendant 16 heures dans un incubateur à agitation à 37 ° C et 200 tours par minute.
- On purifie les plasmides en utilisant des kits de midiprep disponibles dans le commerce en suivant le protocole du fabricant. Diluer le plasmide à une concentration d'environ 1 ug / ul.
NOTE: Le protocole de purification de plasmide est basé sur la méthode d'extraction alcaline 15.
2. Génération Stable Packaging Cell Line
NOTE: les cellules deux 293GPG et PG13 sont adhérentes. les cellules de culture en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de foetus de veau (FCS) et 50 pg / ml de gentamicine. Culture des cellules 293GPG avec 1 pg / ml de tetracycline avant la transfection. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 entre toutes les étapes.
- Transfecter 293GPG cellules d' encapsidation 16 cultivées en flacon T75 avec le vecteur hemichain-encodage obtenu à l' étape 1.9, using disponible dans le commerce réactif de transfection en suivant le protocole du fabricant 1 7. REMARQUE: les cellules Transfecter 293GPG à 50-60% de confluence.
- milieu de Aspirer pour 293GPG cellules et ajouter 10 ml de frais DMEM 1 jour après transfection.
- La récolte produite transitoirement virus à partir de cellules transfectées 293GPG 2 jours après l'étape 2.2 en transférant le milieu de culture à la seringue et passant à travers le filtre de 0,45 um.
REMARQUE: Le virus peut être utilisé immédiatement ou conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. - Culture 1 x 10 5 PG13 cellules T25 flacon. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Après un jour, le milieu de culture par aspiration et ajouter 1,5 ml de virus-293GPG issu de l'étape 2.3 et 1,5 ml de milieu DMEM avec 8 pg / ml de polybrène.
- Changer le support comme décrit dans l'étape 2.4 une fois par jour pendant 4 jours, pour établir la ligne PG13 cellulaire d'emballage stable retrovirus produisant codant pour la hemichain TCR d'intérêt.
- Aspirer moyen et remplaceravec un milieu DMEM frais pour PG13 lignées cellulaires 24 heures après la dernière infection pour plus de la culture.
REMARQUE: Gel ou sous-culture des cellules en détachant avec une solution de trypsine-EDTA 0,05%. - Pour produire un virus à partir de lignées cellulaires transduites de PG13, culture 2 x 10 6 cellules dans T75 flacon avec 10 ml de milieu DMEM, et le virus de la récolte , comme décrit à l' étape 2.3 trois jours après l' ensemencement des cellules.
NOTE: Le virus est mieux utilisé immédiatement mais peut être conservé à -80 ° C pendant jusqu'à deux mois.
3. L'activation et la transduction des cellules T humaines
NOTE: Les échantillons humains sont obtenus et utilisés en conformité avec les comités d'éthique institutionnels protocoles approuvés. cellules humaines Culture primaires à Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10% de sérum humain au lieu de FCS et 50 pg / ml de gentamicine. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 entre toutes les étapes.
- Isoler les cellules humaines mononucléaires du sang périphérique (PBMC) par la densitéla séparation de gradient suivant le protocole du fabricant 18.
- Activer les cellules T pour induire la prolifération nécessaire pour une infection rétrovirale. Culture 2 x 10 7 PBMC fraîches ou décongelées par puits dans une plaque à 6 puits dans 5 ml de milieu RPMI avec 100 UI / ml d'interleukine-2 humaine recombinante (rhIL-2) et 50 ng / ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 (clone OKT3).
- Trois jours après la stimulation, recueillent les cellules T par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Rejeter le surnageant et épépiner 0,5-1 x 10 6 cellules T par puits dans une plaque à 24 puits remis en suspension dans 1 ml de virus de l' étape PG13 2,7 et 1 ml de milieu RPMI supplémenté avec 200 UI / ml de rhIL-2. plaque Centrifuger à 1000 xg et 32 ° C pendant 1 heure.
- Après 24 h, recueillir des cellules T par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Se débarrasser des cellules de surnageant et remettre dans 1 ml de virus de l'étape PG13 2,7 et 1 ml de milieu RPMI supplémenté avec 200 UI / ml de rhIL-2. Répétez cette étape pour un total de 6 infections.
REMARQUE: le nombre d'infections doit être optimisée en fonction de titre du virus produit par la lignée cellulaire d'emballage. Si nécessaire, le passage des cellules T par l'élimination de 20 à 30% des cellules chaque jour pour prévenir la prolifération. - 24 heures après la dernière infection, recueillir des cellules T par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Jeter les cellules surnageant et remettre en suspension dans un milieu RPMI avec 100 UI / ml de rhIL-2 pour la poursuite de la culture.
- 2-3 jours après l'étape 3.5, les cellules T avec des taches de HLA multimère à 4 ° C pendant 30 min, puis CD3 anti-humain et des anticorps monoclonaux co-récepteurs (mAb) à 4 ° C pendant 15 min. Analyser par cytométrie de flux. Utilisez multimère hors de propos et / ou des cellules non transduites comme témoins négatifs (Figure 1 - 3) 19.
- Si le hemichain centric introduit est une chaîne TCRa, analyser l' utilisation Vß des cellules positives de novo multimère utilisant disponibles dans le commerce panel d'anticorps Vß spécifique par cytométrie en flux 20.
4. Clonage De Novo TCR Contre-hemichains
- Trier de novo multimère population positif à l' étape 3.6 par tri cellulaire assistée écoulement.
- Isoler ARN à partir de cellules T triées en utilisant le guanidinium acide thiocyanate-phénol-chloroforme méthode d'extraction 21,2 2.
REMARQUE: L'ARN peut être stocké à -80 ° C, mais elle doit être utilisée pour générer l'ADNc le plus tôt possible. - Synthétiser une banque d' ADNc à partir d' ARN extrait en utilisant des kits disponibles dans le commerce reverse transcriptase-PCR suivant le protocole du fabricant 23,24.
- Si le clonage TCRβ contre-chaînes, concevoir gène Vß et TCRβ amorces spécifiques de la région constante, tel que déterminé à l'étape 3.7, et clone complet TCRβ gènes tels que décrits dans les étapes 1,3-1,9. Voir l'étape 4.5 si le compteur-chaîne est TCRa, sinon passez à l'étape 5.1.
- Commercialement anticorps spécifiques Va disponibles sont limités, donc l'utilisation du gène Va ne peut pasdéterminée par cytométrie de flux. Clone TCRa contre-chaînes via l' amplification 5'-rapide des extrémités d'ADNc (RACE) 25, en utilisant disponible dans le commerce 5 'kits RACE 6.
- Synthétiser 5 'ADNc compatible RACE à partir d'ARN extrait à l'étape 4.2 en suivant le protocole du fabricant.
- Effectuer 1 er cycle de PCR comme décrit dans le tableau 2.
- Effectuer une électrophorèse du produit de PCR et éluer bande d'environ 1100 pb, comme décrit dans l'étape 1.2.
- Effectuer 2 ème cycle de PCR comme décrit dans le tableau 3, en utilisant 1 produit PCR round st comme matrice.
NOTE: Les séquences des amorces indiquées dans le tableau 3 ont été conçus pour le clonage dans EcoRI et Notl digéré vecteur PMX. - Effectuer une électrophorèse du produit de PCR et éluer bande d'environ 1000 pb, comme décrit dans l'étape 1.2.
- gènes Clone TCRa dans EcoRI et Notl digéré vecteur pMX et puriplasmides fy comme décrit dans les étapes 1,5-1,9.
Clones TCR 5. Reconstituer Novel spécifiques de l'antigène
REMARQUE: La culture des cellules Jurkat 76 et les lignées cellulaires suivantes dans un milieu RPMI additionné de 10% de FCS et 50 pg / ml de gentamicine. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 entre toutes les étapes.
- Transduction Jurkat 76 cellules 26 (ou équivalent TCR - lignée cellulaire T humaine - /) avec hemichain TCR centrée en utilisant le virus 293GPG produit à l' étape 2.3. Pour Jurkat 76, graines 5 x 10 4 cellules par puits en plaque de 24 puits avec 1 ml de virus et de 1 ml de milieu RPMI. plaque Centrifuger à 1000 xg et 32 ° C pendant 1 heure.
- 24 heures après l'infection, recueillir hemichain transduction Jurkat 76 cellules par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans un milieu RPMI frais destiné à la culture.
- Purifier cellules transduites si le hemichain est moléculairement étiqueté 2-3 jours après l'étape 5.2, par colorationing avec fluorophore conjugué anti-NGFR mAb suivi assisté écoulement ou d'une cellule magnétique assistée de tri ( en option) 27.
- Après les étapes 2.1 à 2.3, produire le virus 293GPG codant pour une contre-chaîne TCR clonée à partir des étapes 4.4 ou 4.5.
- Pour reconstituer complètement le RCT, transduire lignée de lymphocytes T exprimant de manière stable le RCT hemichain centrée généré dans les étapes 5.1-5.3 utilisant le virus de l'étape 5.4. Effectuer transduction comme décrit dans les étapes 5.1-5.2.
- Purifier CD3 + transfectants utilisant des anticorps anti-CD3 tri cellulaire magnétique assistée suivant le protocole du fabricant, 2-3 jours après l' étape 5.5 27.
- Pour valider la spécificité de l'antigène, tache transfectants exprimant le TCR clonotypiques composé du RCT hemichain centrée associé à différents contre-chaînes, avec des anti-CD3 et / ou mAb co-récepteur, et HLA multimère, 3-5 jours après la purification de CD3. Analyser les cellules par cytométrie de flux (Figure 4 - 5) 19.
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Representative Results
Sans connaissance préalable de ce qui est hemichain chaîne centrée, la chaîne TCRa et TCRβ devrait être cloné séparément et transduction des cellules T du sang périphérique, qui a été fait dans le cas de HLA-A24 / WT1 réactive TAK1 TCR (Figure 1). Transduction de TAK1β a abouti à une fréquence sensiblement plus élevée de lymphocytes T spécifiques de l'antigène. A l' inverse, la transduction d'un hemichain non-centric ne donnerait pas de novo des cellules T multimère positives, comme on le voit avec la chaîne TAK1α (Figure 1). Lors de l' analyse, porte sur NGFr cellules + si le gène TCR a été marqué pour analyser spécifiquement les cellules transduites (Figure 1 - 2). D'autre part, la hemichain centrée unique peut être transduit si elle est connue pour être dominante, par exemple , le SIG35α et des chaînes invariantes TCRa Vα24 (figure 2 et 3). Les cellules T spécifiques pour l'cogn respectifmangé antigène augmenté en fréquence lors de la transduction d'un hemichain TCRa centrée. (Figure 2 - 3). Ensemble, ces données démontrent que l' introduction d'un ou TCRβ TCRa hemichain centrée sur des lymphocytes T du sang périphérique capable de générer de novo TCR avec l'antigène de la spécificité d'intérêt.
population spécifique de l'antigène peut être triée par cellule assistée flux de tri et hemichains TCR peut être cloné comme décrit dans la section Protocole 4. clonotypique TCR contre-chaînes peuvent être reconstituées individuellement sur une lignée de cellules T exprimant de manière stable le hemichain centric. 76 Jurkat transfectées, exprimant nouvellement clonés RLT uniques à partir de cellules T ou TAK1β SIG35α centrée hemichain transduite, possèdent une avidité pour faire varier l'antigène correspondant respectif, tel que déterminé par HLA / peptide multimère coloration 5,6. Plus précisément, nous avons pu isoler de novo TCRa contre-chaînes tlorsqu'il est associé à un chapeau TAK1β ont été colorées avec soit une intensité inférieure ou supérieure par le complexe antigène WT1 que l'appariement TAK1αβ parentale (figure 4). De même, SIG35α jumelé avec des contre-chaînes uniques reconnu HLA-A2 / MART1 modérée à forte avidité (Figure 5). SIG35α a été cloné indépendante d'un hétérodimère TCRap 5, donc un appariement des parents pour cette hemichain était indisponible pour la comparaison. Surtout, ces données indiquent qu'il est possible de moduler l'affinité pour l'antigène cible par l'appariement hemichain centrée avec différentes contre-chaînes.
Figure 1:. TAK1β comme un exemple de HLA-restreint TCRβ centric hemichain TCRa ou TCRβ hemichains du HLA-A24 / WT1 réactive TAK1 TCR a été marqué avec le nerf tronqué facteur de croissance recePtor (ANGFR) et transduction individuellement aux cellules T du sang périphérique. Les transfectants ont été colorées avec PC5-conjugué anti-CD8 (133x après dilution) et conjugué au FITC anti NGFR (20x après dilution) d'anticorps monoclonaux (mAb), et indiqués HLA-A24 multimère (5 ug / ml), à la suite de deux fois l'antigène spécifique stimulation. Total de 6 donneurs ont été testés. Toutes les données ont été bloqués sur les cellules NGFR +. Figure re-imprimé avec la permission de référence 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. SIG35α comme un exemple de HLA-restreint TCRa centric hemichain chaîne SIG35α TCRa marqués avec ANGFR, ou l'étiquette seule, a été transduction des cellules T du sang périphérique. Les transfectants ont été colorées avec PC5-conjugated anti-CD8 (dilué 133x) et conjugué au FITC anti NGFR (20x) dilués mAb et le HLA-A2 ont indiqué multimère (8 pg / ml). Total de 4 donneurs ont été testés. Toutes les données ont été bloqués sur les cellules NGFR +. Figure réimprimé avec la permission de la référence 5 (Droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Récepteur des cellules tueuses naturelles Invariant T (iNKT) Vα24 (Vα24i) comme un exemple de CD1d-restreinte TCRa centric hemichain Vα24i chaîne TCRa a été transduite à des cellules T du sang périphérique. Les transfectants ont été colorées avec du FITC conjugué à l'anti-CD3 (20x après dilution) et le mAb ont indiqué CD1 multimère (5 ug / ml). Déchargé mo CD1dlaires organiques ont été produites à partir de cellules HEK293 et présentent des auto-lipides inconnus endogènes. iNKT TCR est définie par la reconnaissance de CD1 présentant α-GalCer ou son analogue PBS-57. Total de 4 donneurs ont été testés. Figure re-imprimé avec la permission de la référence 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Représentant TCRa contre-chaînes clonés à partir TAK1β transduction des lymphocytes T TCRa clones T262, A262, A186, A133 et T4 ont été clonées à partir de HLA-A24 / WT1 cellules T multimère positives TAK1β transduites périphériques, et reconstitués individuellement sur Jurkat 76 Les cellules. exprimant CD8, en même temps que la chaîne TAK1β. Les transfectants ont été colorées avec PC5 conjugué anti-CD8 mAb (133x dilué) et indiqué HLA-A24multimère (5 ug / ml). Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les barres d'erreur indiquent plage. Figure re-imprimé avec la permission de référence 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Représentant TCRβ contre-chaînes clonés à partir SIG35α transduction des lymphocytes T TCRβ clones 413, 523, 788, 1086, 794, et 830 ont été clonées à partir HLA-A2 / MART1 cellules T périphériques multimère de SIG35α positif transduction, et individuellement reconstitué sur Jurkat. 76 cellules exprimant le CD8, ainsi que la chaîne SIG35α. DMF5 était un TCR d'affinité élevée précédemment cloné reconnaissant HLA-A2 / MART1. Les transfectants ont été colorées avec PC5 conjugué anti-CD8 mAb (133x dilué) et indiqué HLA-A2 multimère (2 pg / ml). Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les barres d'erreur indiquent plage. Figure réimprimé avec la permission de la référence 5 (Droit d' auteur 2015. L'Association américaine des immunologistes, Inc.). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1:.. Configuration pour pMX vecteur digestion Réactifs et volumes respectifs sont indiqués S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Tableau 2: Configuration pour le 1 er tour 5 RAC 'E PCR. Réactifs et volumes respectifs, les paramètres de PCR, et la séquence d'amorçage sont affichés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Tableau 3: installation de 2 ème tour 5 'RACE PCR Réactifs et volumes respectifs, les paramètres de PCR, et des séquences d' amorces sont montrées.. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
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Discussion
La première exigence pour une bonne application de ce procédé réalise l'efficacité de transduction suffisante de cellules T primaires avec le hemichain d'intérêt. Dans notre expérience, la combinaison de l'utilisation de PG13 comme lignée cellulaire d'emballage et pMX que les résultats de vecteurs rétroviraux dans l'expression stable et efficace du gène introduit dans les cellules T humaines primaires. les cellules d'emballage PG13 peuvent être une seule cellule clonée pour sélectionner les cellules d'emballage à titre élevé pour améliorer l'efficacité de transduction. En outre, la prolifération des lymphocytes T est également nécessaire pour une grande efficacité de transduction par retrovirus. Dans le protocole décrit, la stimulation avec anti-CD3 soluble AcM OKT3, avec une forte concentration de rhIL-2, fournit les signaux d'activation nécessaires pour induire la division cellulaire. Les monocytes sont requis pour la capacité stimulatrice de l'OKT3 soluble, probablement par liaison aux récepteurs Fc. Par conséquent, PBMC en vrac, et non purifiés des cellules T, est requise pour ce protocole de stimulation particulier. Tles cellules doivent être cultivées dans du RPMI complété avec du sérum humain pour obtenir des résultats expérimentaux optimaux. Toutes les autres cellules décrites ici peuvent être cultivées en présence de sérum de veau foetal.
Deuxièmement, de novo générés TCR spécifiques de l' antigène des cellules exprimant doivent être détectables. Pour certains hemichains TCR, comme TAK1β, les cellules exprimant de novo TCR ne sont détectables après stimulation avec des cellules présentatrices d'antigène puisées par l' antigène (APC). Ainsi, si TCR spécifiques de l'antigène ne sont pas détectés immédiatement après transduction de hemichain centric, ils pourraient être détectable après expansion par TTB. On notera que la transduction d'une hemichain non centrée ne donnerait pas de novo de cellules T spécifiques de l' antigène , même après l' expansion spécifique de l' antigène avec des APC, comme on le voit avec le hemichain TAK1α (figure 1). Dans nos études, multimères de HLA sont utilisés pour la détection, cependant, cela pourrait ne pas être disponible pour certains TCR, en particulier HLA de classe II restreint TCRs. Une autre solution consisterait à détecter les réponses de cellules T fonctionnelles. Les lymphocytes T transduits Hemichain peuvent être stimulés avec des APC puisées avec l'antigène d'intérêt. APC puisées au véhicule et les lymphocytes T non transduites peuvent être utilisés comme témoins. les cellules T répondantes peuvent être détectés par la régulation positive des marqueurs d'activation de surface, tels que CD107a, CD154, CD137 ou.
Enfin, il est important de vérifier que les contre-chaînes clonés ne reconnaissent en fait l'antigène d'intérêt quand il est associé avec le hemichain centric. Ceci est particulièrement important lorsque le hemichain centric est TCRβ et contre-chaînes sont TCRa, car l' exclusion allélique des gènes TCRa fuit et on estime qu'une partie importante des cellules αβ T périphériques expriment plus d'une chaîne de TCRa 28. Réactivité peut être confirmée avec une coloration multimère ou la mesure de la réponse fonctionnelle après stimulation avec des APC présentant l'antigène correspondant.
Un Limitatisur de cette technique est que chaque TCR va composer un hemichain centric, puisque les deux TCRa et TCRβ contribuent comparativement à l' antigène reconnu dans certains cas 3. Par conséquent, les cellules T périphériques transduction avec ces hemichains non-centriques ne donnent pas de novo TCR spécifiques de l' antigène.
Néanmoins, cette méthode représente une avancée conceptuelle sur l'approche classique de TCR clonage, où les gènes à la fois TCRa et TCRβ doivent être clonées et correcte appariement doivent être garantis 29,30. Dans notre technique, le jumelage entre hemichains est plus une préoccupation principale et seulement l'une des chaînes de TCR doit être cloné, étant donné que l'autre est fixé. En plus de HLA de classe I ou de TCR CD1d-restreinte, le procédé décrit peut également être appliqué à l'isolement de TCR HLA de classe II restreints pour la thérapie génique du TCR.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
