Summary
इस के साथ साथ हम विशिष्ट प्रतिजन टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs), TCRα या एक मौजूदा TCR की TCRβ बाँधना ब्याज की प्रतिजन विशिष्टता रखने, परिधीय टी सेल रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची के पूरक hemichain साथ द्वारा उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। नए सिरे से उत्पन्न TCRs आत्मीयता के साथ अलग प्रतिजन विशिष्टता बरकरार रहती है।
Abstract
टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) टी कोशिकाओं की विशिष्टता को निर्देशित करने के लिए प्रतिरक्षा का एक होनहार साधन के रूप में ट्यूमर को लक्षित करने के चिकित्सकीय इस्तेमाल कर रहे हैं। इसलिए, विभिन्न ट्यूमर जुड़े एंटीजन के लिए विशिष्ट क्लोनिंग TCRs कई अध्ययनों का लक्ष्य दिया गया है। एक प्रभावी टी सेल प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना, TCR इष्टतम आत्मीयता के साथ लक्ष्य प्रतिजन समझना चाहिए। हालांकि, इस तरह के क्लोनिंग TCRs एक चुनौती है और कई उपलब्ध TCRs किया गया है आत्मीय प्रतिजन के लिए उप इष्टतम आत्मीयता के पास है। इस प्रोटोकॉल में, हम नए सिरे से उच्च आत्मीयता विशिष्ट प्रतिजन hemichain केन्द्रित शोषण से मौजूदा TCRs का उपयोग कर TCRs क्लोनिंग की विधि का वर्णन है। यह ज्ञात है कि कुछ TCRs के लिए, प्रत्येक TCRα या TCRβ hemichain प्रतिजन मान्यता के लिए भी उतना ही योगदान नहीं है, और प्रमुख hemichain केंद्रित hemichain के रूप में जाना जाता है। हमें पता चला है कि मूल जवाबी श्रृंखला से अलग काउंटर-चेन के साथ केंद्रित hemichain बाँधना द्वारा, हम प्रतिजन रों बनाए रखने में सक्षम हैंpecificity, आत्मीय प्रतिजन के लिए अपनी बातचीत ताकत नियमन है। इस प्रकार, एक दिया TCR की चिकित्सीय क्षमता केंद्रित और काउंटर hemichains के बीच बाँधना अनुकूलन के द्वारा सुधार किया जा सकता है।
Introduction
टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) heterodimeric अनुकूली प्रतिरक्षा टी lymphocytes द्वारा व्यक्त रिसेप्टर्स, एक TCRα और TCRβ श्रृंखला से बना रहे हैं। वे वी (डी) जे जीन क्षेत्रों, जो एक अत्यंत विविध एचएलए / पेप्टाइड परिसरों के लगभग असीमित विन्यास को पहचानने में सक्षम प्रदर्शनों की सूची का उत्पादन का दैहिक पुनर्व्यवस्था के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। चिकित्सकीय, टी कोशिकाओं ट्यूमर जुड़े एंटीजन के लिए clonotypic TCRs विशिष्ट व्यक्त करने के लिए इंजीनियर के कैंसर 1 की एक किस्म में प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है। हालांकि, कई TCRs इस उद्देश्य के लिए क्लोन ब्याज की प्रतिजन, जो उनके चिकित्सीय आवेदन सीमा के लिए पर्याप्त समानता की कमी है।
यहाँ, हम श्रृंखला केन्द्रित शोषण से मौजूदा TCRs के लिए इस सीमा को पार करने के लिए एक विधि का वर्णन। यह बताया गया है कि एक TCR hemichain लक्ष्य प्रतिजन 2 की मान्यता में एक अधिक प्रभावी भूमिका निभा सकता है, यहाँ केन्द्रित करार दिया। क्रिस्टल संरचनात्मक विश्लेषण है कि एक केंद्रित से पता चला हैएक TCR की hemichain एमएचसी / पेप्टाइड जटिल 3,4 पर पदचिह्न के बहुमत के लिए खाते सकता है। इस अवधारणा का उपयोग करना, हम पहले से दिखा दिया है कि SIG35α TCRα TCRβ चेन की एक विविध प्रदर्शनों की सूची के साथ जोड़ी और एचएलए-A2 5 द्वारा प्रस्तुत MART1 27-35 पेप्टाइड के खिलाफ जेट बनाए रख सकते हैं। इसी तरह के परिणाम TAK1 TCR, जहां केंद्रित TCRβ hemichain विभिन्न TCRα चेन के साथ रखा और एचएलए-A24 6 द्वारा प्रस्तुत WT1 235-243 पेप्टाइड के लिए जेट बनाए रखा के साथ प्राप्त किया गया। दोनों MART1 और WT1 ट्यूमर जुड़े एंटीजन होते हैं। चेन केन्द्रित भी CD1d-प्रतिबंधित अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा (iNKT) TCRs के प्रतिजन मान्यता अध्ययन करने के लिए अलग अलग Vβ11 TCRβ चेन 7 के साथ मानव iNKT TCRs के अपरिवर्तनीय Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα श्रृंखला बाँधना द्वारा लागू किया गया था।
सभी मामलों में, हम ट्रांस द्वारा TCRs के एक नए सिरे से प्रदर्शनों की सूची उत्पन्न करने में सक्षम थेपरिधीय रक्त टी कोशिकाओं, जहां शुरू की hemichain अंतर्जात TCRα या TCRβ जवाबी चेन के साथ रखा करने के लिए केंद्रित TCR hemichain ducing। संक्षेप में, केंद्रित hemichain एक चारा है कि उचित जवाबी चेन, जो जब एक साथ रखा TCRs है कि ब्याज की प्रतिजन विशिष्टता बनाए रखने के लिए फार्म, फिर भी आत्मीयता में बदलती पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है। इन उपन्यास repertoires से, हम लक्ष्य प्रतिजन पूर्व मौजूदा TCRs की तुलना के खिलाफ सुधार बातचीत ताकत के साथ clonotypic TCRs को अलग-थलग करने में सक्षम थे। इसलिए, हमें विश्वास है कि इस विधि के नैदानिक आवेदन के लिए इष्टतम TCRs की पहचान की पाइप लाइन को गति देगा।
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Protocol
1. तैयारी रेट्रोवायरल निर्माण ब्याज की एन्कोडिंग TCR Hemichain
- PMX वेक्टर Linearize बाद के चरणों में एक TCR जीन की प्रविष्टि की अनुमति है। 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (1 टेबल) पर EcoRI और चना प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्लास्मिड डीएनए डाइजेस्ट 8।
- 1.2% agarose जेल पर पचा प्लाज्मिड के वैद्युतकणसंचलन बाहर ले। लगभग 4,500 आधार जोड़े (बीपीएस) की आबकारी बैंड, और Elute 30 μl बाँझ पानी में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल निकालना किट 9 का उपयोग।
- ब्याज की TCR जीन भी है कि 15-20 PMX वेक्टर क्रमश: 8 की EcoRI और चना पाचन साइट ओवरलैपिंग बीपीएस सांकेतिक शब्दों के लिए डिजाइन 5 'और' 3 प्राइमरों।
- प्राइमरों के साथ TCR जीन बढ़ाना। 1.2 चरण में वर्णित के रूप में पीसीआर उत्पाद और लगभग 1,000 बीपीएस की Elute बैंड के वैद्युतकणसंचलन बाहर ले।
- पचा वेक्टर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड के साथ प्रत्येक रेखीय टुकड़ा संयोजन से TCR जीन क्लोनविधानसभा मास्टर मिश्रण अभिकर्मक और 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर incubating।
नोट: प्रत्येक घटक के रिश्तेदार संस्करणों के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का संदर्भ लें। इस विधानसभा विधि तकनीक मूल रूप से गिब्सन एट अल। 10 द्वारा वर्णित पर आधारित है। - (ΔNGFR, अमीनो एसिड 1-277) 11 Furin दरार साइट, सेरीन ग्लाइसिन लिंकर से अलग, और 2A दृश्यों 12,13 (वैकल्पिक) टैग TCR जीन मानव तंत्रिका वृद्धि कारक रिसेप्टर के छोटा फार्म के साथ transduced कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए। डिजाइन प्राइमरों एन्कोडिंग दृश्यों टुकड़ा समाप्त होता है ओवरलैपिंग और कदम 1.3-1.5 में वर्णित के रूप में प्लाज्मिड इकट्ठा।
नोट: इन दृश्यों संदर्भों 11-13 में पाया जा सकता है। - रासायनिक सक्षम ई रूपांतरण निर्माता प्रोटोकॉल 14 निम्नलिखित इकट्ठे प्लाज्मिड के साथ कोलाई। अगर प्लेटों पर बीज तब्दील बैक्टीरिया (20 मिलीग्राम / एमएल Lysogeny शोरबा (पौंड), 15 मिलीग्राम / एमएल अग्रवाल, और 1 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन) और 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और न्यूनतम प्रति 200 राउंड में 50 लेग माध्यम से (20 मिलीग्राम / मिलीलीटर लेग 1 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और) एक मिलाते इनक्यूबेटर में 16 घंटे के लिए मिलीलीटर में एक जीवाणु कॉलोनी।
- निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध midiprep किट का उपयोग कर plasmids शुद्ध। लगभग 1 माइक्रोग्राम / μl की एकाग्रता के लिए प्लाज्मिड पतला।
ध्यान दें: प्लाज्मिड शुद्धि प्रोटोकॉल क्षारीय निष्कर्षण विधि 15 पर आधारित है।
2. जनरेटिंग स्थिर पैकेजिंग सेल लाइन
नोट: दोनों 293GPG और PG13 कोशिकाओं पक्षपाती हैं। Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में संस्कृति कोशिकाओं 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक। अभिकर्मक से पहले 1 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन के साथ संस्कृति 293GPG कोशिकाओं। सभी चरणों के बीच 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
- Transfect 293GPG पैकेजिंग कोशिकाओं hemichain एन्कोडिंग कदम 1.9, उसी में प्राप्त वेक्टर के साथ T75 फ्लास्क में 16 सुसंस्कृतनिर्माता प्रोटोकॉल 1 से 7 निम्नलिखित एनजी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मक। ध्यान दें: Transfect 293GPG 50-60% confluency पर कोशिकाओं।
- 293GPG कोशिकाओं के लिए महाप्राण मध्यम और ताजा DMEM मध्यम 1 दिन बाद अभिकर्मक के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- हार्वेस्ट क्षणिक 2 दिन संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरित सिरिंज के लिए और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर से 2.2 कदम के बाद ट्रांसफ़ेक्ट 293GPG कोशिकाओं से वायरस का उत्पादन किया।
नोट: वायरस तुरंत इस्तेमाल किया है या भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - संस्कृति 1 x 10 5 PG13 T25 फ्लास्क में कोशिकाओं। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। एक दिन, महाप्राण संस्कृति के माध्यम से और कदम 2.3 और 1.5 मिलीलीटर DMEM माध्यम से 293GPG व्युत्पन्न वायरस के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने, polybrene के 8 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ साथ के बाद।
- 4 दिनों के लिए प्रति दिन एक बार 2.4 चरण में वर्णित के रूप में मध्यम बदलें, स्थिर PG13 पैकेजिंग सेल लाइन का निर्माण ब्याज की TCR hemichain एन्कोडिंग रेट्रोवायरस की स्थापना।
- महाप्राण मध्यम और जगहPG13 सेल लाइनों आगे संस्कृति के लिए पिछले संक्रमण के बाद 24 घंटे के लिए ताजा DMEM माध्यम के साथ।
नोट: 0.05% trypsin EDTA समाधान के साथ निकाल कर रुक या उप-संस्कृति कोशिकाओं। - कोशिकाओं को बोने के बाद 2.3 तीन दिन के कदम के रूप में वर्णित ट्रांसड्यूस PG13 सेल लाइनों से वायरस, संस्कृति T75 में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं 10 मिलीलीटर DMEM मध्यम के साथ फ्लास्क, और फसल वायरस का उत्पादन करने के लिए।
नोट: वायरस सबसे अच्छा तुरंत इस्तेमाल किया है, लेकिन अप करने के लिए दो महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
3. एक्टिवेशन और मानव टी कोशिकाओं के पारगमन
नोट: मानव नमूने प्राप्त और संस्थागत नैतिकता समिति को मंजूरी दी प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है। रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान में संस्कृति प्राथमिक मानव कोशिकाओं (RPMI) मध्यम 10% मानव सीरम के बजाय एफसीएस और 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक। सभी चरणों के बीच 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
- पृथक मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) घनत्व सेढाल जुदाई निर्माता प्रोटोकॉल 18 के बाद।
- रेट्रोवायरल संक्रमण के लिए आवश्यक प्रसार प्रेरित करने के लिए टी कोशिकाओं को सक्रिय करें। संस्कृति 2 10 x 7 ताजा या thawed 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति PBMC, 100 आइयू / पुनः संयोजक मानव इंटरल्यूकिन -2 विरोधी CD3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की (rhIL-2) और 50 एनजी / एमएल के मिलीलीटर के साथ RPMI माध्यम के 5 मिलीलीटर में (क्लोन OKT3)।
- तीन दिन उत्तेजना पोस्ट, 4 मिनट के लिए 350 XG पर pipetting और सेंट्रीफ्यूज द्वारा टी कोशिकाओं को इकट्ठा। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 24 अच्छी तरह से थाली कदम 2.7 से PG13 वायरस के 1 मिलीलीटर में resuspended में अच्छी तरह से प्रति 0.5-1 एक्स 10 6 टी कोशिकाओं बीज, और RPMI मध्यम 200 आइयू / rhIL-2 मिलीलीटर के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर। 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र प्लेट और 1 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस।
- 24 घंटे के बाद, 4 मिनट के लिए 350 XG पर pipetting और सेंट्रीफ्यूज द्वारा टी कोशिकाओं को इकट्ठा। कदम 2.7 से PG13 वायरस के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागें, और RPMI मध्यम 200 आइयू / rhIL-2 मिलीलीटर के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर। 6 संक्रमित की कुल के लिए इस चरण को दोहराएँआयनों।
नोट: संक्रमणों की संख्या सेल लाइन पैकेजिंग द्वारा उत्पादित वायरस के अनुमापांक के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो, पारित होने टी कोशिकाओं कोशिकाओं के 20-30% हटाने प्रत्येक दिन से अधिक बढ़ना रोकने के लिए। - पिछले संक्रमण के बाद 24 घंटे, 4 मिनट के लिए 350 XG पर pipetting और सेंट्रीफ्यूज द्वारा टी कोशिकाओं को इकट्ठा। 100 आइयू / आगे संस्कृति के लिए rhIL -2 के मिलीलीटर के साथ RPMI माध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागें।
- 2-3 दिन 3.5 चरण, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, तो विरोधी मानव CD3 में एचएलए multimer और सह रिसेप्टर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) के साथ दाग टी कोशिकाओं के बाद। प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण। 19 - अप्रासंगिक multimer और / या नकारात्मक नियंत्रण (3 चित्रा 1) के रूप में untransduced कोशिकाओं का प्रयोग करें।
- पेश किया केंद्रित hemichain एक TCRα श्रृंखला है, तो प्रवाह से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Vβ विशिष्ट एंटीबॉडी पैनल का उपयोग कर 20 cytometry नए सिरे से multimer सकारात्मक कोशिकाओं के Vβ उपयोग का विश्लेषण।
4. क्लोनिंग डी नोवो TCR काउंटर hemichains
- क्रमबद्ध नए सिरे से multimer सकारात्मक प्रवाह की मदद से सेल छँटाई से कदम 3.6 में आबादी।
- एसिड guanidinium thiocyanate फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि 21,2 2 का उपयोग कर हल किया टी कोशिकाओं से शाही सेना को अलग।
नोट: आरएनए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन जितनी जल्दी हो सके सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। - निकाले शाही सेना से सीडीएनए पुस्तकालय synthesize व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर निर्माता प्रोटोकॉल 23,24 निम्नलिखित किट का उपयोग कर।
- क्लोनिंग TCRβ जवाबी चेन, तो, Vβ जीन और TCRβ निरंतर क्षेत्र विशिष्ट प्राइमरों डिजाइन 3.7 चरण में निर्धारित के रूप में, और पूर्ण लंबाई क्लोन TCRβ जीन के रूप में कदम 1.3-1.9 में वर्णित है। 4.5 कदम अगर काउंटर श्रृंखला TCRα है देखो, अन्यथा कदम करने के लिए 5.1 जारी है।
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Vα विशिष्ट एंटीबॉडी सीमित कर रहे हैं, इस प्रकार Vα जीन उपयोग नहीं कर सकतेप्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया। क्लोन TCRα सीडीएनए समाप्त होता है (दौड़) 25 की 5'-तेजी से प्रवर्धन के माध्यम से जवाबी चेन, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5 'रेस किट 6 का उपयोग कर।
- 5 'रेस संगत निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित 4.2 कदम में निकाले शाही सेना से सीडीएनए synthesize।
- तालिका 2 में वर्णित के रूप में 1 सेंट दौर पीसीआर प्रदर्शन करना।
- पीसीआर उत्पाद के वैद्युतकणसंचलन बाहर ले जाने और 1.2 चरण में वर्णित के रूप में लगभग 1,100 बीपीएस का बैंड elute।
- तालिका 3 में वर्णित के रूप में, टेम्पलेट के रूप में 1 सेंट दौर पीसीआर उत्पाद का उपयोग 2 एन डी दौर पीसीआर प्रदर्शन करना।
नोट: 3 टेबल के नीचे दिखाए गए दृश्यों प्राइमर EcoRI और चना में क्लोनिंग के लिए डिजाइन किए गए थे PMX वेक्टर पच। - पीसीआर उत्पाद के वैद्युतकणसंचलन बाहर ले जाने और 1.2 चरण में वर्णित के रूप में लगभग 1,000 बीपीएस का बैंड elute।
- EcoRI और चना में क्लोन TCRα जीन PMX वेक्टर और पुरी पचकदम 1.5-1.9 में वर्णित के रूप में वित्तीय वर्ष plasmids।
5. पुनर्गठन उपन्यास विशिष्ट प्रतिजन TCR क्लोन
नोट: संस्कृति Jurkat 76 कोशिकाओं और RPMI माध्यम में बाद में सेल लाइनों 10% एफसीएस और 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक। सभी चरणों के बीच 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
- 293GPG वायरस 2.3 कदम में उत्पादन का उपयोग कर केंद्रित TCR hemichain साथ (मानव टी सेल लाइन - - / या समकक्ष TCR) Jurkat 76 कोशिकाओं 26 transduce। Jurkat 76, बीज वायरस के 1 मिलीलीटर और 1 मिलीलीटर RPMI माध्यम के साथ 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के लिए। 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र प्लेट और 1 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस।
- संक्रमण के बाद 24 घंटे, 4 मिनट के लिए 350 XG पर hemichain transduced Jurkat pipetting और सेंट्रीफ्यूज से 76 कोशिकाओं को इकट्ठा। आगे संस्कृति के लिए ताजा RPMI माध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें।
- transduced कोशिकाओं को शुद्ध करता है, तो hemichain 2-3 दिनों कदम 5.2 के बाद से टैग molecularly है, दाग सेसंयुग्मित विरोधी NGFR एमएबी प्रवाह की मदद से या चुंबकीय की मदद से सेल छँटाई (वैकल्पिक) 27 के द्वारा पीछा fluorophore साथ हैैं।
- 2.1 2.3 करने के लिए कदम के बाद, उत्पादन 293GPG वायरस एक TCR जवाबी श्रृंखला कदम 4.4 या 4.5 से क्लोन एन्कोडिंग।
- पूरी तरह से TCR पुनर्गठित करने, स्थिरतापूर्वक कदम 5.1-5.3 कदम 5.4 से वायरस का उपयोग करने में उत्पन्न केंद्रित TCR hemichain व्यक्त टी सेल लाइन transduce। कदम 5.1-5.2 में वर्णित के रूप में पारगमन प्रदर्शन करना।
- शुद्ध विरोधी CD3 चुंबकीय की मदद से सेल छँटाई का उपयोग कर CD3 + transfectants निर्माता प्रोटोकॉल का पालन, 2-3 दिन 5.5 कदम के बाद 27।
- प्रतिजन विशिष्टता को मान्य करने के लिए, transfectants विरोधी CD3 और / या सह रिसेप्टर MABS, और एचएलए multimer साथ केंद्रित TCR hemichain विभिन्न काउंटर-चेन के साथ बनती से बना clonotypic TCRs, व्यक्त दाग, 3-5 दिनों के बाद CD3 शुद्धि। 19 - से फ्लो (5 चित्रा 4) से कोशिकाओं का विश्लेषण।
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Representative Results
पूर्व ज्ञान के बिना जो hemichain की श्रृंखला केंद्रित TCRα और TCRβ श्रृंखला अलग क्लोन और परिधीय रक्त टी कोशिकाओं है, जो एचएलए-A24 / WT1 प्रतिक्रियाशील TAK1 TCR (चित्रा 1) के मामले में किया गया था करने के लिए transduced किया जाना चाहिए है। TAK1β के पारगमन के प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की एक काफ़ी उच्च आवृत्ति झुकेंगे। इसके विपरीत, एक गैर-केंद्रित hemichain के पारगमन नए सिरे से multimer सकारात्मक टी कोशिकाओं (चित्रा 1) के रूप में TAK1α श्रृंखला के साथ देखा उपज नहीं होता। विश्लेषण के दौरान, NGFR + कोशिकाओं पर फाटक यदि TCR जीन विशेष रूप से transduced कोशिकाओं (- 2 चित्रा 1) का विश्लेषण करने के लिए टैग किया गया। दूसरी ओर, एकल केंद्रित hemichain, अगर यह प्रभावी होने के लिए जाना जाता है transduced किया जा सकता है, उदाहरण के लिए SIG35α और अपरिवर्तनीय Vα24 TCRα चेन (चित्रा 2 और 3)। टी कोशिकाओं संबंधित cogn के लिए विशिष्टप्रतिजन एक केंद्रित TCRα hemichain के पारगमन पर आवृत्ति में वृद्धि हुई खा लिया। (चित्रा 2 - 3)। साथ में, इन आंकड़ों परिधीय रक्त टी कोशिकाओं के लिए एक केंद्रित TCRα या TCRβ hemichain की शुरूआत प्रदर्शित ब्याज की प्रतिजन विशिष्टता के साथ नए सिरे से TCRs उत्पन्न कर सकते हैं।
विशिष्ट प्रतिजन आबादी छँटाई प्रवाह की मदद से सेल द्वारा हल किया जा सकता है और प्रोटोकॉल अनुभाग 4. Clonotypic TCR जवाबी चेन व्यक्तिगत रूप से एक टी सेल लाइन स्थिरतापूर्वक केंद्रित hemichain व्यक्त पर पुनर्गठित किया जा सकता के रूप में वर्णित TCR hemichains क्लोन किया जा सकता है। Jurkat 76 transfectants, नव TAK1β या SIG35α केंद्रित hemichain transduced टी कोशिकाओं से अद्वितीय TCRs क्लोन, के रूप में एचएलए / पेप्टाइड multimer 5,6 धुंधला द्वारा निर्धारित किया जाता है, संबंधित आत्मीय प्रतिजन के लिए उत्सुकता बदलती पास व्यक्त। विशेष रूप से, हम अलग-थलग करने के लिए नए सिरे से TCRα जवाबी चेन टी सक्षम थेटोपी जब TAK1β के साथ जोड़ा (चित्रा 4) माता पिता का TAK1αβ बाँधना से WT1 प्रतिजन जटिल द्वारा या तो कम या अधिक तीव्रता के साथ दाग रहे थे। इसी तरह, SIG35α अद्वितीय काउंटर-चेन के साथ रखा उच्च उत्सुकता (चित्रा 5) के लिए उदार के साथ एचएलए-A2 / MART1 को मान्यता दी। SIG35α एक TCRαβ heterodimer 5 की स्वतंत्र क्लोन किया गया था, इसलिए इस hemichain के लिए एक माता पिता का बाँधना तुलना के लिए उपलब्ध नहीं था। महत्वपूर्ण बात, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि यह विभिन्न काउंटर-चेन के साथ केंद्रित hemichain बाँधना द्वारा लक्ष्य प्रतिजन के लिए आकर्षण मिलाना संभव है।
चित्रा 1:। TAK1β एचएलए-A24 / WT1 प्रतिक्रियाशील TAK1 TCR की एचएलए-प्रतिबंधित TCRβ केंद्रित hemichain TCRα या TCRβ hemichains का एक उदाहरण के रूप में छोटा तंत्रिका वृद्धि कारक rece के साथ टैग की गई थीptor (ΔNGFR), और व्यक्तिगत रूप से परिधीय रक्त टी कोशिकाओं को transduced। Transfectants PC5 संयुग्मित विरोधी सीडी 8 (133x पतला) और FITC संयुग्मित विरोधी NGFR (20x पतला) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) के साथ दाग रहे थे, और संकेत दिया एचएलए-A24 multimer (5 माइक्रोग्राम / एमएल), निम्न दो बार विशिष्ट प्रतिजन उत्तेजना। 6 दाताओं की कुल परीक्षण किया गया। सभी डेटा NGFR + कोशिकाओं पर gated थे। चित्रा फिर से मुद्रित संदर्भ 6 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। SIG35α एचएलए-प्रतिबंधित TCRα केंद्रित hemichain का एक उदाहरण के रूप में SIG35α TCRα श्रृंखला ΔNGFR के साथ टैग, या अकेले टैग, परिधीय रक्त टी कोशिकाओं को transduced किया गया था। Transfectants साथ PC5-सह दाग थेnjugated विरोधी सीडी 8 (133x पतला) और FITC संयुग्मित विरोधी NGFR (20x पतला) MABS, और संकेत दिया एचएलए-A2 multimer (8 माइक्रोग्राम / एमएल)। 4 दाताओं की कुल परीक्षण किया गया। सभी डेटा NGFR + कोशिकाओं पर gated थे। चित्रा फिर से मुद्रित से संदर्भ 5 (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, Inc) की अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) सेल रिसेप्टर Vα24 (Vα24i) CD1d-प्रतिबंधित TCRα केंद्रित hemichain का एक उदाहरण के रूप में Vα24i TCRα श्रृंखला परिधीय रक्त टी कोशिकाओं को transduced किया गया था। Transfectants FITC संयुग्मित विरोधी CD3 (20x पतला) एमएबी के साथ दाग और CD1d multimer (5 माइक्रोग्राम / एमएल) ने संकेत दिया गया था। उतार CD1d मोlecules HEK293 कोशिकाओं और वर्तमान अंतर्जात अज्ञात आत्म लिपिड से तैयार किए गए। iNKT TCR CD1d की मान्यता α-GalCer या उसके अनुरूप पीबीएस 57 पेश करके परिभाषित किया गया है। 4 दाताओं की कुल परीक्षण किया गया। चित्रा फिर से मुद्रित संदर्भ 7 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्रतिनिधि TCRα जवाबी चेन TAK1β से क्लोन टी कोशिकाओं transduced TCRα क्लोन T262, A262, A186, A133, और टी -4 एचएलए-A24 / WT1 से क्लोन किया गया multimer सकारात्मक TAK1β transduced परिधीय टी कोशिकाओं, और व्यक्तिगत रूप से Jurkat 76 कोशिकाओं पर पुनर्गठन किया। सीडी 8 व्यक्त TAK1β श्रृंखला के साथ साथ। Transfectants PC5 संयुग्मित विरोधी सीडी 8 एमएबी (133x पतला) के साथ दाग और एचएलए-A24 इंगित किया गया थाmultimer (5 माइक्रोग्राम / एमएल)। डेटा प्रतिनिधि दो स्वतंत्र प्रयोगों हैं। त्रुटि सलाखों सीमा से संकेत मिलता है। चित्रा फिर से मुद्रित संदर्भ 6 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: प्रतिनिधि TCRβ जवाबी चेन SIG35α से क्लोन टी कोशिकाओं transduced TCRβ क्लोन 413, 523, 788, 1086, 794, और 830 एचएलए-A2 / MART1 से क्लोन किया गया multimer सकारात्मक SIG35α transduced परिधीय टी कोशिकाओं, और व्यक्तिगत रूप से Jurkat पर पुनर्गठन किया। 76 कोशिकाओं सीडी 8 व्यक्त SIG35α श्रृंखला के साथ साथ। DMF5 एक पहले क्लोन उच्च आत्मीयता पहचानने एचएलए-A2 / MART1 TCR था। Transfectants PC5 संयुग्मित विरोधी सीडी 8 एमएबी (133x पतला) के साथ दाग और संकेत दिया एचएलए-A2 multimer (2 माइक्रोग्राम / मी थेएल)। डाटा दो स्वतन्त्र प्रयोगों का प्रतिरूप है। त्रुटि सलाखों सीमा से संकेत मिलता है। चित्रा फिर से मुद्रित से संदर्भ 5 (कॉपीराइट 2015. प्रतिरक्षाविज्ञानी के अमेरिकन एसोसिएशन, Inc) की अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1:।। PMX वेक्टर पाचन के लिए सेटअप अभिकर्मकों और संबंधित खंडों में दिखाया जाता है इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 2: 1 सेंट दौर 5 'आरएसी के लिए सेटअपई पीसीआर। अभिकर्मकों और संबंधित खंडों, पीसीआर सेटिंग्स, और प्राइमर अनुक्रम दिखाए जाते हैं। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 3:।। 2 एन डी दौर 5 'रेस पीसीआर अभिकर्मकों और संबंधित खंडों, पीसीआर सेटिंग्स, और प्राइमर दृश्यों को दिखाया जाता है के लिए सेटअप इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस विधि के सफल आवेदन के लिए पहली आवश्यकता ब्याज की hemichain के साथ प्राथमिक टी कोशिकाओं की पर्याप्त पारगमन दक्षता प्राप्त है। हमारे अनुभव, PG13 पैकेजिंग सेल लाइन और PMX मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में शुरू की जीन के स्थिर और कुशल अभिव्यक्ति में रेट्रोवायरल वेक्टर परिणाम के रूप में के रूप में प्रयोग के संयोजन में। PG13 पैकेजिंग कोशिकाओं एकल कोशिका उच्च अनुमापांक पैकेजिंग कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए पारगमन दक्षता में सुधार करने के लिए क्लोन किया जा सकता है। इसके अलावा, टी कोशिकाओं के प्रसार को भी रेट्रोवायरस द्वारा उच्च पारगमन क्षमता के लिए आवश्यक है। वर्णित प्रोटोकॉल में, घुलनशील विरोधी CD3 एमएबी OKT3 के साथ उत्तेजना, rhIL -2 के उच्च एकाग्रता के साथ-साथ, कोशिका विभाजन के लिए प्रेरित करने के लिए आवश्यक सक्रियण संकेत देता है। Monocytes संभावना एफसी रिसेप्टर्स के साथ बंधन के माध्यम से, घुलनशील OKT3 के उत्तेजनादायक क्षमता के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, थोक PBMC, और न टी कोशिकाओं शुद्ध, इस विशेष उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है। टीRPMI में इष्टतम प्रयोगात्मक परिणामों के लिए मानव सीरम के साथ पूरक कोशिकाओं सुसंस्कृत होना चाहिए। यहाँ वर्णित अन्य सभी कोशिकाओं भ्रूण बछड़ा सीरम की उपस्थिति में संवर्धित किया जा सकता है।
दूसरा, नए सिरे से उत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन TCRs कोशिकाओं को व्यक्त detectable होना चाहिए। ऐसे TAK1β के रूप में कुछ TCR hemichains, के लिए, नए सिरे से TCR व्यक्त कोशिकाओं प्रतिजन स्पंदित प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) के साथ उत्तेजना के बाद ही पता लगता है। इस प्रकार, यदि विशिष्ट प्रतिजन TCRs केंद्रित hemichain के पारगमन के बाद तुरंत पता नहीं कर रहे हैं, वे APCs से विस्तार के बाद detectable हो सकता है। नोट एक गैर-केंद्रित hemichain की है कि पारगमन के रूप में TAK1α hemichain (चित्रा 1) के साथ देखा, APCs के साथ विशिष्ट प्रतिजन विस्तार के बाद भी नए सिरे से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं उपज नहीं होता। हमारे अध्ययन में, एचएलए multimers का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, तथापि, यह नहीं उपलब्ध कुछ TCRs, विशेष रूप से एचएलए वर्ग द्वितीय प्रतिबंधित TCR के लिए हो सकता हैएस। एक वैकल्पिक टी सेल कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए किया जाएगा। Hemichain transduced टी कोशिकाओं ब्याज की प्रतिजन के साथ स्पंदित APCs के साथ प्रेरित किया जा सकता है। वाहन स्पंदित APCs और untransduced टी कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जवाब में टी कोशिकाओं ऐसे CD107a, CD154, या CD137 के रूप में सतह सक्रियण मार्कर की अपरेगुलेशन से पता लगाया जा सकता है।
अंत में, यह मान्य करने के लिए है कि क्लोन जवाबी चेन वास्तव में ब्याज की प्रतिजन पहचानते हैं जब केंद्रित hemichain के साथ रखा महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब केंद्रित hemichain TCRβ है और जवाबी चेन TCRα हैं, क्योंकि TCRα जीनों के लिए allelic बहिष्कार टपका हुआ है और यह अनुमान है कि परिधीय αβ टी कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण भाग एक से अधिक TCRα श्रृंखला 28 का इजहार है। जेट multimer धुंधला या आत्मीय प्रतिजन APCs के साथ उत्तेजना के बाद कार्यात्मक प्रतिक्रिया को मापने के साथ बात की पुष्टि की जा सकती है।
एक limitatiइस तकनीक के पर, है कि नहीं हर TCR एक केंद्रित hemichain रचना जाएगा के बाद से दोनों TCRα और TCRβ कुछ मामलों में 3 मान्यता प्रतिजन तुलनात्मक योगदान करते हैं। इसलिए, परिधीय टी कोशिकाओं में इस तरह के गैर-केंद्रित hemichains साथ ट्रांसड्यूस नए सिरे से विशिष्ट प्रतिजन TCRs उपज नहीं हो सकती है।
फिर भी, इस विधि क्लोनिंग TCRs, जहां दोनों TCRα और TCRβ जीन का क्लोन तैयार किया जाना चाहिए और सही बाँधना 29,30 सुनिश्चित किया जाना चाहिए करने के लिए परंपरागत दृष्टिकोण पर एक वैचारिक प्रगति का प्रतिनिधित्व करता। हमारे तकनीक में, hemichains के बीच बाँधना अब एक मुख्य चिंता का विषय है और TCR चेन से केवल एक ही क्लोन किया जा करने के लिए दिया है कि अन्य तय हो गई है की जरूरत है। एचएलए वर्ग मैं या CD1d-प्रतिबंधित TCRs के अलावा, वर्णित विधि भी TCR जीन थेरेपी के लिए एचएलए वर्ग द्वितीय-प्रतिबंधित TCRs के अलगाव के लिए लागू किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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