Summary
Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.
Abstract
연령 관련 황 반 변성 (AMD) 등 퇴행 성 망막 질환 전세계 돌이킬 수 없는 시력 상실의 주요 원인입니다. AMD는 기능적으로 지원 하 고 해부학 신경 망막 주위 세포의 단층 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 변성에 의해 특징입니다. 비 신생 AMD (건식 AMD)에 대 한 현재 약물 치료는 질병의 진행을 느리게만 겨냥 한 새로운 치료 전략을 식별 하는 연구를 필요로 하는 비전을 복원할 수 없습니다. 건식 AMD를 미래에 치료 건강 한 세포 파악 약속 퇴행 성 RPE 세포를 교체. AMD에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 광범위 한 전 임상 연구 참여 subretinal 사출 기술을 적용 동물 모델의 subretinal 공간으로 줄기 세포 유래 RPE 세포의 이식. 이러한 전 임상 동물 연구에서 가장 자주 사용 하는 접근 어려운 바늘 끝의 직접적인 시각화의 부족에 의해 만들어지고 종종 망막 손상 될 수 있습니다 트랜스 scleral 경로입니다. 유리 체를 통해 다른 접근 바늘 끝 위치의 직접 관찰에 대 한 수 있지만 더 많은 눈 조직 방해로 수술 외상의 높은 위험을 운반. 덜 위험 하 고 재현할 수 수정된 트랜스 scleral 주입 방법 정의 바늘 각도 깊이 사용 하 여 성공적으로 하 고 일관 되 게 쥐 subretinal 공간으로 RPE 세포를 제공 하 고 과도 한 망막 손상을 방지를 개발 했습니다. 이 방식으로 전달 하는 세포는 2 개월 이상에 대 한 외과 의사의 왕 대학 (RCS) 쥐에 효능 되도록 이전 입증 되었습니다. 이 기술은 세포 이식 뿐만 아니라 작은 분자 또는 유전자 요법의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간의 망막 눈 기능 뒤 가벼운 감각 조직으로 있으며 비전 인식에 중요 한 역할을 한다. 망막 세포 역 기능 또는 세포 죽음 따라서 시력 문제 또는 영구적인 실명을 발생합니다. 변성 또는 망막의 다른 층에 있는 세포의 기능 장애와 관련 된 장애 퇴행 성 망막 질환, 중 AMD는 가장 일반적인 유형 및 선진국 노인에 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 1,2. AMD의 병 적인 과정은 관련 RPE 레이어와 차례로 손상의 포토 리셉터 생리학, 신경 망막 위축 및 비전 손실3, RPE 지원 기본 Bruch 막 사이 "드루" 축적 된 4,5. 지금까지, 치료법은 고급 건조 (비 신생) AMD. 재생 의학의 새로운 패러다임으로 줄기 세포 치료의 출현 줄기 세포 유래 건강 한 세포 기능 장애 또는 죽은 RPE 세포 교체의 희망을 제공 합니다. 실제로, 이식의 광범위 한 전 임상 연구 줄기 세포 (예를들면, 인간 배아 줄기 세포)-RPE 퇴행 성 동물 모델에 파생 된 RPE 세포 수행된6,7, 일부는에 진행 되었습니다 임상 시험8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). 최근, 줄기 세포 인간의 RPE 레이어, 인간의 RPE 줄기 세포 (hRPESCs)에서의 대안 소스 우리의 실험실에 의해 확인 되었다와 amd hRPESC 파생 된 RPE 세포 (hRPESC-RPE) 이식 치료의 임상 연구에서 현재 사용 되 고 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal 주입 기술은 우리의 그룹을 포함 하 여 여러 그룹에 의해 위에서 언급 한 전 임상 연구에 적용 됩니다. 동물에서 subretinal 주입을 위한 일반적인 방법은 두 가지: 트랜스 vitreal 및 트랜스 scleral. 트랜스-vitreal 접근 앞쪽 눈 침투, 십자가 전체 vitreal 구멍 렌즈에 인접 하 고 침투는 subretinal 도달 하 눈 뒤에 망막 바늘 끝을 직접 관찰할 수 있는 외과 의사의 이점이 있다 공간14,,1516. 그러나, 그것은 렌즈, 손상의 위험 전달 하 고 바늘을 철회 하는 때 유리 체로 셀의 역류에서 발생할 수 있습니다 (앞쪽에 및 사후), 두 개의 위치에 망막을 방해를 요구 한다. 반면, 트랜스 sclera 접근의 원칙, 망막 및 유리 체의 관련을 방지 하 고 역류 눈을 종료 합니다. 안료 설치류에서 외과 의사 처음 sclera의 침투를 관찰할 수 있다 하지만 안료 맥락 막에 통로, 후 바늘 끝은 더 이상 표시. 직접 관찰 없이 망막 위배 일반적 이며 망막 해 부 및 세포 혈액의 유리 체에 배달 될 수 있습니다. 또한, 눈 표면 곡선 때문에 그것은 매우 어떤 바늘 각도 깊이 트랜스 scleral 주사에 대 한 가장 효과적인 알고 어렵다.
이 시각화 된 문서에서 정보를 가진 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 사출 사이트의 상세한 검사를 수 있는 수술 후 평가의 사용에 의해 트랜스 scleral subretinal 주입 방법을 소개 합니다. 우리의 트랜스 scleral 주입 기술 정의 위치, 각도, 그리고 매우 낮은 수술 외상 및 높은 신뢰성을 주사 바늘에 대 한 깊이 사용 합니다. 여기, 우리가 구체적으로 RCS 쥐, 인간의 AMD의 전 임상 모델의 subretinal 공간으로 hRPESC-RPE 세포의 주입을 보여 줍니다. 이 주입 방법으로 우리가 성공적으로 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐 눈 매우 높은 성공률의 subretinal 공간으로. 세포의 주입 이전13주입 후 최소 2 개월 RCS 대뇌의 보존을 발견 했다. 이 절차는 해 현미경 아래 수행 되 고 배우기 쉽습니다. 그것은 두 사람 (한 의사와 보조) 주사를 수행 요구 하 고 각 동물에 대 한 주입의 평균 시간은 5 분 미만 이다. 정의 된 각도 깊이 주사 바늘에 대 한 실험실, 10 월은 성공적인 subretinal 주입을 달성 하기 위해 사용할 수 없습니다에 대 한 가능 하 게. 그것은 높은 재현성 subretinal 액세스를 허용 하 고 세포 이식, 뿐만 아니라 약물 전달 및 유전자 치료에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 뉴욕 주립 대학의 알바 니에 의해 승인 되었습니다.
1. 사전 사출 준비
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HRPESC-RPE 세포 현 탁 액의 준비
참고: 모든 다음 단계 살 균 조직 문화 후드에서 수행 됩니다 및 기본적인 살 균 기술 가진 친밀 필요 합니다.- 기본 hRPE 세포 격리 인간 기증자에서 눈 세 50-90 년과 24-잘 접시12문화 셀. 통로 1에 셀 cryopreserve, 필요에 따라 해 동 및 문화 통로 2 (P2) 세포 주입에 대 한 4-5 주 (그림 1A).
- 12 문화 매체 제거 하 고 부드럽게 린스 우물 500 µ L로 두 번 미리 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 칼슘 및 마그네슘 없이 X 1을 예 열 (1 DPBS CMF x) 1을 추가 하 여 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 고 진공을 사용 하 여 그것을 제거 하는 것은 우물에 X DPBS CMF.
- 각 우물에 300 µ L 트립 신/DNAse를 추가 합니다. 트립 신/DNAse (4 구 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL 당 DNase) 셀 해리를 37 ° C에서 4 분에 hRPESC-RPE 세포를 품 어.
- 그들은 반올림 있는지 현미경 셀을 확인 합니다. 계속 그들은 아직 둥근 하지 경우 트립 신/DNase를 추가 2 분 동안에 세포를 품 어.
- 셀 반올림 됩니다, 일단 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 triturate 우물에서 분리 된 세포를 트립 신/DNase 비활성화를 미리 데워 진된 문화 매체의 동일한 볼륨 15 mL 원뿔 튜브로 분리 된 셀을 포함 하는 트립 신/DNase 전송.
- 미리 데워 진 1 우물 린스 부드럽게 위아래로 잘;의 가장자리의 주위에 특히 pipetting으로 X DPBS CMF 그런 다음 이전 원뿔 관에 이러한 셀을 추가 합니다.
- 286 x g 작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 원뿔 튜브 원심
- 제거는 상쾌한 고 1 mL 문화 매체와 셀 resuspend.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 대 한 286 x g에서 원심.
- 상쾌한을 제거 하 고 셀에 살 균 균형 소금 솔루션 (BSS) 50, 000 셀 / µ L에서 (subretinal 주입 중 1 µ L 볼륨에 50, 000 셀을 제공)을 resuspend.
- 1.7 mL microcentrifuge 튜브와 얼음 물 혼합물에 주입 사용까지 최종 세포 현 탁 액 (CS)를 전송 합니다.
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셀 인젝터의 준비
- 주입 주사기와 인젝터를 밀접 하 게 나사에 메 마른 33-게이지 경사진된 바늘을 삽입 합니다.
- 5-6 번 100% 에탄올과 인젝터를 플러시.
- 5-6 번 70% 에탄올과 인젝터를 플러시.
- 플러시 BSS와 인젝터 5-6 시간.
- 인젝터 바늘 메 마른 검은 마커 펜 (그림 1B) 해 현미경 바늘의 팁에서 600 µ m의 위치에 표시 합니다.
- 인젝터 주입 micromanipulator 놓습니다.
2. subretinal 주입
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외과 영역 및 동물 준비
- 그리고 4-5 주 오래 된 RCS 쥐 (60-100 g)를 무게 isoflurane 증기 전달 시스템을 사용 하 여 anesthetize.
참고: 유도 마 취 5%에서 isoflurane 유량을 유지 합니다. 발을 눌러 마 취의 깊이 확인 하 고 수술 시 마 취 유지 보수에 대 한 2-3% 유량을 줄일 수 있습니다. - 메 마른 외과 영역을 설정 해 현미경의 스테이지 밑,가 열 패드와 멸 균 수술 드 레이프를 놓습니다.
- 외과 영역에 쥐를 전송 및 마 취 유지 isoflurane 시스템에 연결 된 코 콘 쥐 장소.
- 거 즈와 쥐의 시체를 커버. 전체 마 취를 확인 하는 쥐의 발가락을 꼬집어.
- 그리고 4-5 주 오래 된 RCS 쥐 (60-100 g)를 무게 isoflurane 증기 전달 시스템을 사용 하 여 anesthetize.
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트랜스 scleral subretinal 주사 현미경
- 쥐의 unoperated 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 합니다.
- 주입, 외과 의사의 오른손 쪽으로 그것의 머리 및 외과 의사를 향해 다시 천장에 직면 하는 왼쪽된 눈과 쥐의 오른쪽 면에 위치.
- 작은 위로 눈을 커버 하는 어떤 수염을 잘라 주세요.
- 왼쪽된 눈의 시간적 측면에서 눈 세척의 작은 금액을 똑 똑 하 고 눈을 씻어 하 면 주걱으로 비 강 측에 초과 수집 합니다.
- 각각의 한 방울을 적용 하 여 주입 후 10 월 시험에 대 한 1 %tropicamide 및 2.5 %phenylephrine (갓 수술 당일 무 균 0.9% 식 염 수에 희석 하 여 10 %phenylephrine 만든)와 학생 같은데요.
- 4-6 시간 눈 주위의 피부를 살짝 당겨 눈은 약간 proptosed 지역에서 limbus 후부에 쉽게 액세스할 수 있도록 눈 꺼 풀을 열고.
- 눈 세척의 방울을 적용 하 고 눈을 촉촉한 유지.
- 부드럽게 (준비 단계 1.1.12) CS를 triturate 하 고 1.2 µ L CS와 인젝터를 로드 합니다. 여분의 0.2 µ L 주입 역류에 대 한 보상 하는 데 사용 됩니다.
참고: 에 대 한 우리의 측정에 따라 5000-8000 셀 50, 000 셀 / µ L 셀 손실의 약 10-16%에 그의 주사와 역류에 손실 됩니다 및 0.2 µ L CS의 추가이 셀 손실 보상을 주입 했다. - 인젝터는 micromanipulator에 CS로 가득 놓습니다 (또는 그것을 잡고 보조) 세로로 RPE 세포에에서 쉽게 침 몰 경향이.
- 눈에 방울 0.5 %proparacaine (지역 국 소 마 취 제)를 적용 하 고 초과 면 주걱으로 제거.
참고: 이 단계는 각 막 반사를 억제 하 고 깜박이 후속 단계에서 눈을 방지 해야 합니다. - 집게를 사용 하 여를 후부는 limbus 결 막, 눈 nasally, 회전 리프트 "텐트"를 만들려고 결.
- 가 위를 사용 하 여 결 막에 작은 개통을 확인 하 고 기본 sclera를 노출 하는 "천막"의 상단을 잘라.
- 집게를 사용 하 여 나머지 결 한계는 limbus 옆의 가장자리 회전 눈 nasally 동 공 축 테이블 위쪽 (그림 1C)을 기준으로 약 30도의 각도에서를. 결 막의 지속적인 창과 바늘 삽입 하는 동안 카운터 힘을 제공 하 고 최적의 각도에서 눈을 유지 하기 위해 필요 합니다.
- 세포 주입 안내 하는 구멍을 향하도록 팁의 개막과 함께 limbus를 후부 1200-1500 µ m에서 메 마른 경사진된 31 게이지 인슐린 바늘의 끝을 놓습니다.
- 그것은 10-15도 sclera (의도 된 주사 사이트에서 가상 평면에 접선) 위에 인슐린 바늘의 각도 조정 합니다. 천천히 sclera 맥락 막 복잡 한 약 500 µ m의 바늘 깊이 침투. 색칠 한 쥐에서 바늘 끝 사라질 것 이다 '' 안료 맥락 막 아래. 여기에서 사용 하는 인슐린 바늘의 브랜드에 대 한 경사에 바늘 끝에서 거리 500 µ m입니다.
- 신중 하 게 철수 인슐린 바늘 (혈액의 아주 작은 유출을 볼 수 있습니다).
- 과도 한 출혈, 지적 필요한 경우 눈 창 구멍, 취소를 적용할 수 있습니다. 지속적인 출혈 후 창 응용 프로그램 나타냅니다 선박 수 있습니다 손상 되었을.
- 오프닝, 그리고는 공 막의 지역 표면에 상대적으로 약 10-15도 각도 직면 하 고 안내 하는 구멍으로 RPE 세포 로드 인젝터 바늘을 안내.
- 부드럽게 subretinal 공간에 액세스를 약 500 µ m의 깊이를 안내 하는 구멍에 인젝터 바늘을 삽입 합니다. 검은 펜 마크의 가장자리와 바늘 (그림 1C 및 1d) 안료 맥락 막에 의해 덮여 있다 지점 사이의 100 µ m 여백에 대 한 이어야 한다.
- 부드럽게 셀 (약 1.2 µ L)의 적절 한 볼륨을 주입 하는 인젝터 주사기의 플런저를 우울 하 게 보조를 요구 하십시오. 플런저 프레스는 조수로 일부 카운터 힘을 제공 하기 위해 준비가 되어있습니다.
참고: 도우미와 사전 모의 연습 의사와이 단계는 필요한 경험을 가진 보조를 제공할 수 있습니다. - 시각적으로 펜에 집중 하는 동안 가장자리를 표시, 인젝터 25-30에 대 한 장소에서를 누른 다음 천천히 인젝터를 철회 합니다. 역류의 작은 금액은 일반적으로 관찰 된다.
참고: 없는 혈 류 관찰 되는 경우 수 있었다 intravitreal 주사. 인감 또는 공 막 엔 아래 작성 하는 셀을 통해 역류 하십시오 경우 주사 너무 얕은 했다. - 3 번에 메 마른 눈 세척과 사출 사이트에서 셀 경과 헹 구 고 면 주걱으로 초과 수집 합니다.
- 운영된 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 하 고 10 월 역 이식된 세포의 위치와 subretinal bleb의 크기를 검사 하는 쥐를 전송.
3. 포스트 주입 치료
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항 염증 및 통증 진통제 치료
- 고통을 감소를 피하 염 분에 0.1 mg/kg 몸 무게에서 buprenorphine 주사.
- 염 분에 1.6 mg/kg 몸 무게에서 dexamethasone 염증 제어용 복 주사 (I.P.) 주사.
-
동물 복구
- 체온을 유지 하기 위해 열 램프 아래 복구 케이지를 쥐를 반환 합니다.
- 출혈의 징후에 대 한 운영된 눈을 관찰 합니다.
- 마 취 나올 수 있도록 쥐를 관찰 합니다.
- 신선한 케이지를 복구 된 동물을 반환 하 고 수술 카드 케이지를 플래그 조 난, 안구 출혈, 또는 각 막 불투명도의 어떤 표시 든 지를 위한 매일 모니터링. 문제가 있다면 수 의사를 즉시 통보.
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Representative Results
이 문서에서 설명 하는 기술을 사용 하 여, 우리가 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐의 subretinal 공간으로 정확 하 게 위치, 각도, 그리고 조직 (그림 1B-D에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 조절 하 여 ). 즉시 다음 이식, 10 월 시험 사출 사이트와 이식된 세포에 의해 만들어진 subretinal bleb을 수행 했다. 수술 후 10 월 평가 주사 및 망막 손상이 나 출혈에 대 한 모니터링의 품질을 평가 하기 위한 검사 도구 역할을 합니다. 모두 subretinal bleb (그림 2A, C 및 D)과 사출 사이트 (그림 2A , B) 스캔 하는 10 월에서 명확 하 게 볼 수 있었다. Subretinal bleb는 보통 주입 후 24 시간 이내에 해결합니다. Blebs의 크기의 측정은 어려운 OCT를 사용 하 여, 우리 세포 이식으로 포토 리셉터 보존 지역이 가정 bleb 영역을 추정할 수 있다. 우리는 이전 50000 세포의 1 µ L 주사 약 6 ~ 7% 절약 될 수 있습니다 증명 사출 사이트13주위 RCS 망막의 지역. 피는 bleb에서 검색 되었습니다 같이 그림 2A, C 와 D는 망막에 레이어 했다 주사 사이트에서 그대로, 그리고 셀 주입으로 인 한 최소한의 외상을 보여주는 유리 체에서 관찰 되었다. 또한, 실패 한 주사의 대표 10 월 이미지 참조 (그림 2E 및 F) 포함 했다.
10 월 피드백 도구를 사용 하 여, 우리 조직에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 각도 최적화. 일단 최적화, 300 이상 이전 subretinal 주사 우리의 다른 연구13 (표 1) 수행의 결과에 따라 subretinal 접근 수술만 5.7%와 90.8%의 성공률을 달성 하기 위해 우리가이 메서드가 실패 합니다. 나머지 3.5%에는 OCTs isoflurane 마 취 관련 눈 압 연17는 적절 한 위치에 눈을 포함 한 여러 가지 이유로 하지 수행 했다.
이식 후 7 일, 고정 및 immunohistological 분석 sectioned 운영된 쥐 눈 enucleated 했다. 인간의 세포 핵 마커 (Hunu)18 과 RPE 세포 마커 (OTX2)19 이식된 세포를 검출 하기 위하여 사용 되었다. 그림 3 id 및 이식의 성공적인 납품 확인, 주입 후 1 주일은 긍정적으로 두 마커 스테인드 subretinal 공간에 이식된 RPE 세포의 두꺼운 층을 보여주었다. 주입 후 1 주일에 셀의 다 수 그림 3C와 같이 수 있습니다 빠르게 감소 immunosuppressed RCS 쥐20에서도 호스트 면역 반응으로 인해 나중에 작은 숫자에. 그럼에도 불구 하 고, 위에서 설명 했 듯이, RCS 쥐 눈의 퇴 화 포토 리셉터 레이어 hRPESC RPE13이식 후 2 개월 이상 구조를 찾을 수 있습니다.
그림 1 : 4 주 오래 된 P2 hRPESC RPE 세포의 각도 인젝터 바늘 주사 하는 동안 사용 하는 깊이의 데모 이미지. (4 주 오래 된 P2 hRPESC RPE 세포의 단계 대조 이미지 A)를 주입에 대 한 사용. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 600 µ m 거리 사이 표시자의 가장자리와 인젝터 바늘의 끝을 보여주는 회로도 눈금으로 측정. 미의 최소 눈금은 100 µ m. (C) A 만화 쥐 눈의 해 부 구조와 각도 눈 벽에 인젝터 바늘을 삽입 하는 깊이의 측면 보기의 단면을 보여주는. 쥐 눈의 동 공 축 테이블 위쪽을 기준으로 30도 이며 인젝터 바늘이 안구의 로컬 표면 기준으로 15도. (D) 인젝터 바늘에 인젝터 바늘의 500 µ m 조직과 100 µ m의 공간에 삽입 되는 사출 사이트의 상위 뷰 마커의 시작점을 보여주는 만화는 마르크의 가장자리와 주입 구멍의 개통 사이 왼쪽 r. 구멍의 위치는 limbus를 후부 1200-1500 µ m 이다. 바늘 팁의 측면에 표시 됩니다 하지만 얼굴 다운 해야 주사 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 주입 후 즉시 운영된 쥐 눈의 10 월 이미지. (A) 한 subretinal bleb 및 사출 사이트, intravitreal 출혈 없이 보여주는 운영된 눈의 10 월 B-스캔 이미지. (B)는 10 월 볼륨 강도 투영 (VIP)의 이미지 삽입 된 영역의 enface 저 이미지를 나타내는 B-스캔 시리즈. 작은 사출 사이트 최소한의 외상을 보여주는 VIP 이미지에 표시 됩니다. (C) (A) 모든 망막 레이어와 subretinal 공간에서 이식된 세포를 보여주는 확대 10 월 이미지 표시. 이 이미지는 이식된 세포 subretinal 공간에 위치 하 고 있었다 설명 했다. (D)는 평균 크기 subretinal bleb을 보여주는 10 월 B-스캔 이미지. (E) 10 월 B-스캔 이미지 intravitreal 공간에 있는 CS와 실패 한 subretinal 주입을 보여주는. (F) 10 월 B-스캔 이미지 보여주는 주사 사이트에서 통해 전체 망막 파고와 실패 한 subretinal 주입. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Immunohistological hRPESC-RPE 세포의 이식 후 섹션을 고정 하는 망막의 얼룩. (A) 인간의 세포 핵 마커 (Hunu) 이식된 인간 RPE 세포의 검출을 나타내는 얼룩입니다. (B, E) 세포 핵 카운터 얼룩 (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) 망막 층, 이식, RPE 레이어를 보여주는. (C) A Hunu와 DAPI 이식된 hRPE 셀 subretinal 공간에 있습니다 나타내는 병합 된 이미지. 이식 및 RPE 레이어 사이의 분리는 냉동된 섹션에 대 한 RCS 눈 cryo 보호와 관련 된 처리 아티팩트입니다. (D) RPE 세포 마커 (OTX2) 이식된 인간 RPE 세포의 얼룩. (OTX2와 DAPI F)는 병합 된 이미지. 눈금 막대 = 20µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 총 주입된 RCS 쥐 눈 | 10 월에서 좋은 subretinal blebs | 10 월에서 작은 subretinal blebs | 10 월에서 총 비 복잡 한 subretinal blebs | 10 월 (즉, 기포 또는 망막 출혈)에서 Complicatd subretinal blebs | 아니 10 월 수행 | 수술 실패 (10 월에서 아니 subretinal bleb) | |
| 개수 | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| 전체 주입 된 눈의 % | ------ | 82.80% | 7.96% | 90.76% | 1.59% | 1.91% | 5.73% |
| (이 데이터는 RCS 쥐 subretinal 주사 10 동료에서) 요약 | |||||||
표 1: 10 실험 동료 RCS 쥐에서에서 subretinal 주사의 요약.
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Discussion
이 기사에서 묘사 된 subretinal 주입 기술은 트랜스 scleral 통로, 인젝터 바늘 신경 망막 손상 또는 유리 구멍을 방해 하지 않고 눈 벽의 바깥 레이어 (sclera-맥락 막-RPE 복잡 한)를 침투를 통해 이다. 대체 트랜스-vitreal 접근 설치류 렌즈 유리 구멍의 대부분을 차지 하는 때문에, 백 내장, 이어지는 렌즈 손상의 잠재적인 위험이 있다. 이 방법에 비해, 우리의 기술 덜 위험 하 고 인젝터 바늘 subretinal 공간을 도달 하는 전체 유리 캐비티를 통해 갈 필요가 없습니다으로 최소한의 외상의 원인. 사실, 우리의 연구에서 10 월 시험 행사, 매우 드문 망막 침투 것 고, 동물에 따라 시험에는 없는 영구적인 망막 분리. 또한, 사출 사이트는 매우 작은 (< 200 µ m 직경에서) 때 33-게이지 인젝터를 사용 하 여 바늘 sclera 맥락 막 RPE 복잡 한 구조적 장애는 매우 제한 된 그래서. 바늘 철회 후 주입 구멍 자체 자동으로 그렇게 스티치 물개 또는 조직 접착제 필요 하다.
사출 주변 또는 내에서 과도 한 출혈 수술 합병증 포함 안내 하는 구멍. 집게를 사용 하 여 그립에 limbus 결 여백만 부드러운 힘 필요 혈관을 곤란 하 게 하지 않도록 하 고 가능한 출혈 감소 합니다. 안내 하는 구멍을 만들기 전에 표면 혈관의 침투를 피하기 위해 원하는 주사 사이트를 검사 합니다. 스피어를 사용 하 여 셀 주사 바늘의 삽입 하기 전에 혈액의 안내 하는 구멍을 지울 수 있습니다. 안내 하는 구멍에서 출혈이 지속 되 면 스피어의 몇 가지 애플 리 케이 션 후, 그릇 되었을 수도 있습니다 고장. 우리가 관찰 하는 또 다른 합병증 post-operatively 각 막 불투명도 개발 하는 RCS 쥐의 작은 백분율 이다. 어떤 경우에는 불투명도 만성 되었고 다른 과도 했다. 영구 불투명도와 동물 연구 그룹에서 제거 되었습니다. 각 막 불투명도 눈 건조, 물리적 손상, 염증, 약물 또는 화학 자극21개발할 수 있습니다. 그들의 형성을 줄이기 위해 눈 지켜져야 한다 촉촉한 눈을 충분 한 윤 활을 유지 하 여 고 작업 중 각 막 면 주걱 또는 다른 도구를 만지지 마십시오.
주입 프로토콜 사용 하 여 정의 된 접근 각도 눈 랜드마크, 상대적인 바늘 깊이 우리의 설정에 수술 테이블에 상대적으로 눈 각도 여기 설명. 포스트 주입 10 월 검사를 사용 하 여 높은 정확도 RPE 세포 이식 쥐의 subretinal 공간으로 재현할 수 제어를 제공 하려면 이러한 주입 매개 변수 정제에 중요 했다. 일단 반복된 연습에 의해 지배, 방법은 간단 하 게 수행입니다. 그것은 권장, 훈련에서 특히 수술 후 눈 시험 결과 확인 하기 위해 수행 됩니다. 각도 깊이 주입 바늘 지 가능성이 필요 조정의 따라 수술 설정에 따라이 의견을, 나이, 동물의 다른 동물 종에 사용 하는 경우 및/또는 (예를 들어, 마우스).
사출 품질을 평가 하 고 포함 또는 연구에서 제외 결정, 10 월 관측에서 출혈이 subretinal의 존재가 중요 합니다. 어디 OCT를 사용할 수 없는 실험실에서 아래에서 설명 하는 조건을 사용할 수 있습니다 빠른 심사 외과 의사에 의해 의심된 주입 실패를 제외 하: (1) 이전 주입에: (a) 조종사 구멍 너무 깊은 이루어집니다 (즉, 상당한 깊이 > 500 µ m; 대 한는 여기, 빗면의 중간에 바늘 끝에서 거리를 사용 하는 인슐린 바늘의 브랜드는 500 µ m). (b) 안내 하는 구멍 지나치게 유혈 (즉, 출혈 멈출 수 없습니다 눈 스피어스와 구멍에 힘을 적용). (c) 주입 바늘이 너무 깊이 (즉, 상당한 깊이 > 500 µ m 또는 주사 바늘에 표식 sclera/맥락 막/RPE 복잡 한 조직으로 간다). (2) 동안 주입: 주입 중 안내 하는 구멍에 주사 바늘을 유지 하기 위해 (a) 수 없습니다. (b) 주입 시 주입 바늘 주위 즉시 누설. (c) 주입 바늘 너무 깊이 전달 됩니다 (즉, 주사 바늘에 마커 sclera/맥락 막/RPE 복잡 한 조직으로 간다) 주입 동안에 외과 의사에 의해 발견. (d) 위치에서 주입 바늘 주입 후 5 초 이상 유지 수 없습니다. (e) 과도 한 혈액 주사 바늘을 제거 하는 경우. (f) 역류/경과 후 2 단계와 결합 될 때 주사 바늘의 철회.
바늘 위치, 각도, 깊이의 주의 깊은 관리와 함께, 촬영 트랜스 scleral subretinal 주입 기술은 매우 안정적이 고 정확, 이며 최소한의 수술 외상을 수행할 수 있습니다. 이러한 모든 혜택과 함께, RPE 세포의 전달 뿐만 아니라 다른 세포 유형, 화합물 또는 유전자 치료에 대 한이 기술을 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
패티 Lederman RPE 세포 준비에 대 한 수술과 수잔 보든에 그녀의 지원에 대 한 감사 하 길. 우리는 또한이 프로젝트에 대 한 자금에 대 한 NYSTEM C028504를 인정 합니다. 저스틴 디 밀러 NIH에서 지원 되는 F32EY025931를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
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