Summary
Subretinal injektion er blevet bredt anvendt i prækliniske studier af stamceller substitutionsterapi for aldersrelateret makuladegeneration. I denne visualiseret artikel beskriver vi en mindre risikabelt, reproducerbare og netop ændrede subretinal injektionsteknik via den trans-scleral tilgang til at levere celler til rotte øjne.
Abstract
Degenerative retinal sygdomme, såsom aldersrelateret Macula degeneration (AMD) er den hyppigste årsag til uoprettelige synstab på verdensplan. AMD er karakteriseret ved degeneration af retinale pigment epitel (ÅV) celler, som er en éncellelag af celler funktionelt støtte og anatomisk indpakning omkring neurale nethinden. Nuværende farmakologiske behandlinger for ikke-neovaskulær AMD (tør AMD) kun bremse sygdomsprogression, men kan ikke gendanne vision, nødvendiggør undersøgelser med henblik på at identificere nye terapeutiske strategier. Erstatter de degenerative ÅV celler med raske celler holder løfte om at behandle tør AMD i fremtiden. Omfattende prækliniske undersøgelser af stamceller udskiftning behandlingsformer for AMD involverer transplantation af stamceller-afledt ÅV celler i dyremodeller, hvor subretinal injektionsteknik er anvendt subretinal plads. Den tilgang, der oftest bruges i disse prækliniske dyreforsøg er gennem den trans-scleral rute, som er vanskeliggjort af manglen direkte visualisering nål afslutning og kan ofte resultere i nethinde beskadige. En alternativ fremgangsmåde gennem glasagtige giver mulighed for direkte observation af nål afslutning holdning, men det bærer en høj risiko for kirurgiske traumer som mere øjet væv er forstyrret. Vi har udviklet et mindre risikabelt og reproducerbare modificerede trans-scleral injektion metode, der bruger definerede nål vinkler og dybder til succes og konsekvent leverer ÅV celler ind i den rotte subretinal plads og undgå overdreven nethinde beskadige. Celler leveres på denne måde har tidligere vist sig for at være virkningsfuldt i Royal College of Surgeons (RCS) rotte i mindst 2 måneder. Denne teknik kan bruges ikke kun til celle transplantation, men også for levering af små molekyler eller genterapier.
Introduction
Den menneskelige nethinde placeret på bagsiden af øjet funktioner som en lys sensoriske væv og spiller en afgørende rolle i visionen opfattelse. Retinal celle dysfunktion eller celledød derfor forårsager problemer med synet eller permanent blindhed. Sygdomme involverer degeneration eller dysfunktion af celler i forskellige lag af nethinden er kendt som degenerative retinal sygdomme, blandt hvilke AMD er den mest almindelige type og den hyppigste årsag til uoprettelige blindhed i ældre i udviklede lande 1,2. Den patologiske proces af AMD er forbundet med "drusen" akkumulering mellem ÅV lag og de underliggende Bruchs membran, som igen forringer ÅV støtte af fotoreceptor fysiologi, fører til neurale retinal atrofi og vision tab3, 4,5. Hidtil, er der ingen kur for avanceret tørre (ikke-neovaskulær) AMD. Fremkomsten af stamcelleterapi som et nyt paradigme i regenerativ medicin bringer håb for at erstatte de dysfunktionelle eller døde ÅV celler med stamcelle-afledt raske celler. Faktisk, omfattende prækliniske undersøgelser af transplantere stamceller (fx, menneskelige embryonale stamceller)-afledte ÅV celler i ÅV-degenerative dyremodeller har været udført6,7, hvoraf nogle har udviklet sig til kliniske forsøg8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). For nylig en alternativ kilde til stamceller hjemmehørende i den menneskelige ÅV lag, de menneskelige RPE-stamceller (hRPESCs), blev identificeret af vores laboratorium og i øjeblikket bliver brugt i prækliniske studier af hRPESC afledt ÅV celle (hRPESC-RPE) transplantation terapi for AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal injektionsteknik anvendes i ovennævnte af flere grupper, herunder vores gruppe prækliniske undersøgelser. Der er to generelle tilgange til subretinal injektion i dyr: trans-vitreal og trans-sclera. Trans-vitreal tilgangen har fordelen, at kirurgen at være i stand til direkte observere nål afslutning, da det trænger de forreste øje, krydser hele vitreal hulrum støder op til linsen, og trænger nethinden bagest i øjet til at nå subretinal plads14,15,16. Det kræver imidlertid forstyrre nethinden i to steder (anterior og posterior), bærer risikoen for at beskadige linsen, og kan resultere i tilbagestrømning af celler ind i glaslegemet når nålen er trukket tilbage. Derimod trans-sclera metode, i princippet, undgår inddragelse af nethinden og glasagtige, og tilbagestrømning forlader øjet. I pigmenteret gnavere, kirurgen kan i første omgang observere penetration af sclera, men efter passage i pigmenteret årehinden, nål afslutning er ikke længere synlig. Uden direkte observation, overtræder nethinden er fælles og kan resultere i retinal dissektion og levering af celler og/eller blod i glaslegemet. Desuden, fordi øjet overflade er buet, det er meget svært at vide hvilken nål vinkler og dybder er mest effektivt i trans-scleral injektioner.
I denne visualiseret artikel introducerer vi en trans-scleral subretinal injektion metode informeret ved brug af post-operative evalueringer med optisk kohærens tomografi (OCT), som giver mulighed for en detaljeret gennemgang af injektionsstedet. Vores trans-scleral injektionsteknik udnytter definerede steder, vinkler og dybder for injektion nåle til at producere meget lav Kirurgisk traume og høj pålidelighed. Her viser vi specifikt indsprøjtning af hRPESC-RPE celler i den subretinal plads af RCS rotte, en præ-klinisk model af menneskelige AMD. Med denne injektion metode leveret vi med succes og konsekvent hRPESC-RPE celler ind i subretinal rummet af RCS rotte øjne med en meget høj succesrate. Indsprøjtning af celler blev tidligere anset for at resultere i bevarelse af RCS fotoreceptorer i mindst 2 måneder efter injektion13. Denne procedure er udført under dissekere mikroskop og er let at lære. Det kræver to personer (en kirurg og assistent) at udføre injektionen og den gennemsnitlige tid for injektion for hvert dyr er mindre end 5 minutter. Definerede vinkler og dybder for injektion nåle gøre det muligt for laboratorierne, hvor OCT er ikke tilgængelig, til at opnå en vellykket subretinal injektion. Det giver mulighed for meget reproducerbare subretinal adgang og kan bruges ikke kun til celle transplantation, men også for drug delivery og gen terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på State University of New York på Albany.
1. før injektion forberedelse
-
Forberedelse af en hRPESC-RPE cellesuspension
Bemærk: Alle de følgende trin er udført i sterile vævskultur hood og kendskab til grundlæggende steril teknik er påkrævet.- Isolere primære hRPE celler fra menneskelige donorer øjne i alderen 50-90 år og kultur celler i 24-godt plader12. Cryopreserve cellerne i passage 1, tø efter behov og kultur passage 2 (P2) celler i 4-5 uger (figur 1A) til injektion.
- Fjerne næringssubstratet12 og forsigtigt skyl wells to gange med 500 µL pre varmes 1 X Dulbeccos phosphat bufferet saltvand uden kalk & Magnesium (1 x DPBS-CMF) ved at tilføje 1 X DPBS-CMF i brønde ved hjælp af en 1.000 µL pipette og fjerne det ved hjælp af et vakuum.
- Tilsæt 300 µL trypsin/DNAse til hver brønd. Inkubér hRPESC-RPE celler i trypsin/DNAse (4 kU DNase pr. 1 mL 0,25% trypsin-EDTA) i 4 min ved 37 ° C til at adskille cellerne.
- Se celler under mikroskop for at se, om de har rundet op. Fortsat at udruge celler i trypsin/DNase for en yderligere 2 min, hvis de ikke har rundet op endnu.
- Når cellerne er rundet op, skal du bruge 1.000 µL pipette hakkede de fritliggende celler fra brønden og overføre trypsin/DNase med fritliggende celler ind i en 15 mL konisk rør med lige saa stort volumen af pre varmede næringssubstrat, til at inaktivere trypsin/DNase.
- Skyl brønde med pre varmede 1 X DPBS-CMF af pipettering forsigtigt op og ned, især omkring kanterne af godt; derefter tilføje disse celler til det tidligere koniske rør.
- Der centrifugeres den koniske rør ved 286 x g i 5 min. ved 4 ° C for at sammenpresse cellerne.
- Fjern supernatanten og resuspend celler med 1 mL næringssubstratet.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Der centrifugeres ved 286 x g i 5 min. ved 4 ° C for at sammenpresse cellerne.
- Fjern supernatanten og resuspend celler i sterile Balanced Salt løsning (BSS) på 50.000 celler/µL (at levere 50.000 celler i 1 µL volumen i løbet af subretinal injektion).
- Overføre den endelige cellesuspension (CS) til en 1,7-mL microcentrifuge tube og holde i en is-vand-blanding indtil injektion brug.
-
Forberedelse af celle injektor
- Indsætte en steril 33-gauge skrå nål i injektion sprøjte og skrue stramt at samle injektoren.
- Skyl injektor med 100% ethanol 5 - 6 gange.
- Skyl injektor med 70% ethanol 5 - 6 gange.
- Skyl injektor med BSS 5 - 6 gange.
- Markere injektoren nål med en steril sort tusch på en position på 600 µm fra spidsen af nålen dissekere mikroskopet (figur 1B).
- Sted injektor på et micromanipulator til indsprøjtning.
2. subretinal injektion
-
Kirurgiske område og animalske forberedelse
- Vejer 4-5 uge gamle RCS rotte (60-100 g) og bedøver den med isofluran vapor leveringssystem.
Bemærk: Til at fremkalde anæstesi holde isofluran strømningshastighed på 5%. Bekræfte dybde af anæstesi ved at trykke på poterne, og derefter reducere flowet til 2-3% for anæstesi vedligeholdelse under kirurgi. - Placer en steril kirurgi drapere, med en varmepude under, på scenen i dissekere mikroskop til at oprette en steril kirurgiske område.
- Overføre rotten til det kirurgiske område og placere rotten i en næsen kegle tilsluttet isofluran system til at opretholde anesthesia.
- Dække rottens krop med gaze. Knivspids rottens tå for at bekræfte fuld anæstesi.
- Vejer 4-5 uge gamle RCS rotte (60-100 g) og bedøver den med isofluran vapor leveringssystem.
-
Trans-scleral subretinal indsprøjtning under lup
- Påfør en dråbe af øje lubricant på rottens unoperated øje.
- Placer rotte på sin højre side med sit venstre øje mod loftet for injektion, sit hoved mod kirurgens højre hånd og sin tilbage mod kirurgen.
- Trimme alle whiskers, der dækker øjet med en lille saks.
- Drop en lille mængde af Øjenskyl fra den tidsmæssige side af det venstre øje og indsamle overskydende på den nasale side med en bomuld applikator til at skylle øjet.
- Spile eleven med 1% tropicamid og 2,5% phenylephrin (frisklavet fra 10% phenylephrin ved at fortynde det i steril 0,9% saltvand på dagen for kirurgi) for en post injektion OCT eksamen ved at anvende en dråbe af hver.
- Træk forsigtigt huden omkring øjet 4 - 6 gange at åbner øjenlåget, så øjet er lidt proptosed for lettere adgang til regioner posteriort for limbus.
- Påfør en dråbe af Øjenskyl og holde øje fugtig.
- Forsigtigt hakkede CS (udarbejdet i trin 1.1.12) og indlæse injektor med 1,2 µL CS. Den ekstra 0.2 µL bruges til at kompensere for injektion tilbagestrømning.
Bemærk: Baseret på vores målinger, omkring 5.000-8.000 celler går tabt i tilbagestrømning med en injektion af 50.000 celler/mikroliter, der svarer til ca. 10-16% af celletab og en ekstra af 0,2 µL CS blev sprøjtet for at opveje dette celletab. - Placer injektoren fyldt med CS på en micromanipulator (eller har en assistent sidde inde det) lodret som ÅV celler tendens til at synke let i suspension.
- Påfør en dråbe af 0,5% proparacaine (lokale aktuel bedøvelsesmiddel) på øjet og fjerne overskydende med en bomuld applikator.
Bemærk: Dette skridt bør undertrykke den cornea refleks og forhindre øjet blinker under efterfølgende trin. - Bruge pincet greb conjunctiva posteriort for limbus, rotere øjet nasalt og løfte conjunctiva for at gøre et "telt".
- Brug saks til at skære toppen af "telt" at gøre en lille åbning i conjunctiva og afsløre de underliggende sclera.
- Bruge pincet greb kanten af den resterende conjunctiva margenen ved siden af limbus og dreje øjet nasalt så pupil-aksen er i en vinkel på omkring 30 grader i forhold til bordplade (figur 1 c). Fortsatte gribende af conjunctiva margen er nødvendigt at yde en Counter kraft under nålen indsættelser og opretholde øjet i en optimal vinkel.
- For at gøre en pilot hul til celle indsprøjtning, placere i slutningen af en steril skrå 31-gauge insulin nål på 1,200-1,500 µm posteriort for limbus med åbningen af spidsen vender opad.
- Justere vinklen på insulin nål, så det er 10-15 grader over sclera (tangerer en imaginær fly på det tilsigtede injektionsstedet). Langsomt trænge sclera-choroidea komplekset til en nål dybde på omkring 500 µm. I pigmenteret rat, vil nål afslutning 'forsvinde' under pigmenteret årehinden. For brand af insulin nål bruges her, er afstanden fra needle-tip til facet 500 µm.
- Forsigtigt trække insulin nål (en meget lille effusion blod kan ses).
- Hvis overdreven blødning er bemærket, kan en øje spyd anvendes markeringen i hullet, hvis nødvendigt. Fortsatte blødning efter programmet spyd angiver et fartøj kan have været beskadiget.
- Guide ÅV celle-belæsset injektoren nål ind i pilot hullet, med åbning vender ned, og i en vinkel på omkring 10-15 grader i forhold til den lokale overflade af sclera.
- Isæt forsigtigt injektoren nål ind i pilot hul til en dybde af ca. 500 µm hen til adgang den subretinal plads. Der bør være omkring 100 µm margen mellem kanten af sort blyant mark og det punkt, hvor nålen er omfattet af den pigmenterede årehinden (figur 1 c og 1 D).
- Spørge-assistenten til at forsigtigt trykke stemplet af injektor sprøjten for at injicere det passende antal celler (ca 1,2 µL). Være klar til at give nogle Counter kraft som assistent trykker på stemplet.
Bemærk: Forudgående mock praksis med assistenten kan give både kirurg og assistent med den nødvendige erfaring med dette trin. - Mens visuelt fokus på pennen markere kanten, holde injektoren på plads til 25-30 s og derefter langsomt trække injektoren. En lille mængde af tilbagestrømning er almindeligt observeret.
Bemærk: Hvis ingen tilbagestrømning er observeret, kan der have været en intravitreal injektion. Hvis du ser tilbagestrømning gennem segl eller celler fylder under sclera, var injektion alt for overfladisk. - Skyl celle efflux fra injektionsstedet med steril Øjenskyl 3 gange og saml overskydende med en bomuld applikator.
- Påfør en dråbe af øje lubricant på det opererede øje og overføre rotten til OCT stationen for at undersøge placeringen af transplanterede celler og størrelsen af subretinal bleb.
3. efter injektion behandling
-
Anti-inflammatoriske og smerte reliever behandling
- Injicere buprenorphin på 0,1 mg/kg legemsvægt i saltvand subkutant til at mindske smerter.
- Injicere dexamethason på 1,6 mg/kg legemsvægt i saltvand ved intraperitoneal injektion (I.P.) for betændelse kontrol.
-
Animalske opsving
- Returnere rotten til recovery buret under en varmelampe til at opretholde kropstemperaturen.
- Observere det opererede øje for tegn på blødning.
- Observere rotte at sikre, at det kommer ud af anæstesi.
- Returnere den gendannede dyr til en frisk bur og flag buret med en kirurgi kort, og overvåge dagligt for eventuelle tegn på angst, okulær blødning eller hornhinde opaciteter. Advisér dyrlægen straks, hvis der er betænkeligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af den teknik, der er beskrevet i denne artikel, leveret vi konsekvent hRPESC-RPE celler ind i subretinal rummet af RCS rotter ved præcist at kontrollere placering, vinkel og dybde af injektoren nål indsættelse i væv (figur 1B-D ). Umiddelbart følgende transplantation, OCT undersøgelse blev udført for at observere injektionsstedet og den subretinal bleb lavet af de transplanterede celler. Post-operative OCT evaluering tjener som en screeningsværktøj til at vurdere kvaliteten af injektioner og overvågning for nethinde beskadige eller blødning. Begge de subretinal bleb (figur 2A, C og D) og injektionsstedet (figur 2A og B) kunne ses tydeligt under OLT scanning. Den subretinal bleb forsvinder sædvanligvis inden for 24 timer efter injektion. Selv om måling af størrelsen af blebs er vanskelig, ved hjælp af OCT, kan vi vurdere området bleb forudsat det er lig med området fotoreceptor bevarelse af celle transplantation. Vi tidligere har vist, at en 1 µL injektion af 50.000 celler kan resultere i at spare omkring 6-7% område af RCS nethinden omkring injektion site13. Som vist i figur 2A, C og D, retinal lag var intakt på injektionsstedet, ingen blod blev opdaget i bleb, og ingen celler blev observeret i glaslegemet, demonstrerer minimal traumer som følge af injektion. Derudover var repræsentative OCT billeder af mislykkede injektioner også inkluderet for reference (figur 2E og F).
Med brugen af OCT som en tilbagemelding værktøj optimeret vi vinkel og dypde af injektoren nål indsættelse i vævet. Når optimeret, mislykkes metoden tillod os at opnå en succesrate på 90,8% subretinal adgang med kun 5,7% kirurgiske, baseret på resultaterne af mere end 300 tidligere subretinal injektioner udført i vores andre studier13 (tabel 1). I de resterende 3,5%, blev OLT ikke udført af flere årsager, herunder øjne ikke i en passende position på grund af isofluran anæstesi-associerede øje rullende17.
7 dage efter transplantation, drives rotte øjne var kerneløse, fast og sektioneret for immunohistological analyse. En menneskelig celle nukleare markør (Hunu)18 og en ÅV celle markør (OTX2)19 blev brugt til at registrere de transplanterede celler. Figur 3 viste et tykt lag af transplanterede ÅV celler i subretinal plads, en uge efter injektion, var positivt farves med begge markører, bekræfter identitet og vellykket levering af transplantationer. En uge efter injektion, kan det store antal celler, som vist i figur 3 c, hurtigt falde til et lille antal senere på grund af værten immunrespons selv i immunosuppressed RCS rotter20. Som nævnt ovenfor, findes der dog degenererede fotoreceptor laget af RCS rotte øjne at blive reddet i mindst 2 måneder efter transplantation med hRPESC-RPE13.
Figur 1 : Et billede af 4 - uger gamle P2 hRPESC-RPE celler og en demonstration af vinkel og dypde, injektoren nål bruger under injektionen. (A) en fase-kontrast billede 4 - uger gamle P2 hRPESC-RPE celler anvendes til injektion. Skalalinjen = 100 µm. (B) en skematisk viser 600 µm afstanden mellem kanten af markør og spidsen af injektoren nål målt af en individuel. Den mindste graduering af individuel er 100 µm. c A tegneserie viser tværsnit af den anatomiske struktur af en rotte øje og en sideudsigt over vinkel og dypde, injektoren nål indsættes i øje væggen. Rotte øjet pupil akse er 30 grader i forhold til bordpladen og injektoren nål er 15 grader i forhold til den lokale overflade af øjeæblet. (D) en tegneserie viser udgangspunktet for mærket på injektoren nål og ovenfra af injektionsstedet hvor 500 µm i injektoren nål er sat ind i vævet og 100 µm plads der er tilbage mellem åbningen af injektion hul og kanten af marke r. placeringen af hullet er 1,200-1,500 µm posteriort for limbus. Needle-tip er vist på sin side, men bør være face-down under injektionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : OCT billeder af betjente rotte øjet umiddelbart efter injektion. (A) en OCT B-scan billede af øje drives viser en subretinal bleb og injektion websted, uden intravitreal blødning. (B) en OCT volumen intensitet projektion (VIP) billedet af en B-scan serie der repræsenterer enface fundus billedet af det injicerede område. Det lille injektionsstedet er synlige i VIP billedet viser den minimale traumer. (C) en udvidet OCT billede af (A) viser de transplanterede celler i den subretinal plads med alle retinal lag markeret. Dette billede viste, at de transplanterede celler blev placeret i den subretinal plads. (D) en OCT B-scan billede viser en gennemsnitlig størrelse subretinal bleb. (E) en OCT B-scan billede viser en mislykket subretinal injektion med CS beliggende i intravitreal plads. (F) en OCT B-scan billede viser en mislykket subretinal injektion med hele nethinden poking gennem på injektionsstedet. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunohistological farvning af retinal frosne sektioner efter transplantation af celler, hRPESC-RPE. (A) menneskelige celle nukleare markør (Hunu) farvning med angivelse af påvisning af transplanterede ÅV menneskeceller. (B, E) Celle nukleare counter farvning (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) viser de retinale lag, transplantation og ÅV lag. C A flettede billede af Hunu og DAPI angiver, at de transplanterede hRPE celler er placeret i den subretinal plads. Adskillelsen mellem transplantation og ÅV lag er en behandling artefakt forbundet med beskyttelse af cryo RCS øjne for frosne sektioner. (D) ÅV celle markør (OTX2) farvning af de transplanterede celler, menneskelige ÅV. (F) en flettede billede af OTX2 og DAPI. Skalalinjen = 20µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Samlede injiceres RCS rotte øjne | God subretinal blebs under OCT | Lille subretinal blebs under OCT | Samlede ikke-kompliceret subretinal blebs under OCT | Complicatd subretinal blebs under OCT (dvs. luftboble i det eller retinal blødning) | Ingen OCT udføres | Kirurgisk fejler (ingen subretinal bleb under OCT) | |
| Grev | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % af samlede injiceres øjne | ------ | 82.80% | 7,96% | 90.76% | 1,59% | 1,91% | 5,73% |
| (Disse data er sammenfattet fra ti kohorter af subretinal injektioner i RCS rotter) | |||||||
Tabel 1: Et resumé af subretinal injektioner fra ti eksperimentelle kohorter i RCS rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den subretinal injektionsteknik afbildet i denne artikel er via den trans-scleral vej, hvor injektoren nål trænger de ydre lag (sclera-choroid-ÅV komplekse) på øje væggen uden at skade de neurale nethinden eller forstyrre Corpus vitreum-hulen. En alternativ trans-vitreal tilgang har en potentiel risiko for linsen skader fører til grå stær, da gnavere linse optager størstedelen af Corpus vitreum-hulen. Sammenlignet med denne metode, vores teknik er mindre risikabel og forårsager minimal traumer som injektoren nål ikke behøver at gå på tværs af hele Corpus vitreum-hulen at nå den subretinal plads. Faktisk, OCT undersøgelser i vores undersøgelser viste meget sjældne retinal penetration begivenheder, og i opfølgende eksamener i dyr, der er ingen vedvarende retinal afdelinger. Derudover injektionsstedet er meget små (< 200 µm i diameter) når ved hjælp af en 33-gauge injektoren nål så den strukturelle forstyrrelse af sclera-choroid-ÅV komplekset er meget begrænset. Efter nålen retraktion, injektion hul selv sæler automatisk så ingen søm eller væv lim er nødvendig.
Komplikationer med operation omfatter overdreven blødning omkring området injektion eller indefra den pilot hul. Når du bruger pincet greb conjunctiva margen på limbus, kun blid kraft er nødvendig for at undgå klemning blodkar og mindske eventuel blødning. Før du opretter den pilot hul, undersøge det tilsigtede injektionsstedet for at undgå indtrængen af overfladiske blodkar. Ved hjælp af et spyd, kan pilot hul blive ryddet af blod før indsættelse af celle indsprøjtning nål. Hvis blødning fra pilot hullet fortsætter efter et par anvendelser af spyd, kan et fartøj er blevet brudt. En anden komplikation vi observerede er en lille procentdel af RCS rotter udvikle hornhinde opaciteter post-operatively. I nogle tilfælde opaciteter var kronisk og andre var forbigående. Dyr med vedvarende opaciteter blev fjernet fra study group. Hornhinde opaciteter kan udvikle på grund af øjet tørhed, fysisk skade, inflammation, medicin eller kemisk irritation21. For at reducere deres dannelse, øjet bør holdes fugtig ved at opretholde rigelig eye smøring, og undgå at berøre hornhinde med en bomuld applikator eller andre værktøjer under operationen.
Injektion protokol skitseret her bruger defineret tilgang vinkler og nål dybder i forhold til okulær vartegn, og øjet vinkler i forhold til kirurgisk tabellen i vores set-up. Brugen af Post injektion OCT scanninger var vigtigt i raffinering disse injektion parametre for at sikre reproducerbare kontrol af ÅV celle transplantation til den rats' subretinal plads med stor nøjagtighed. Når styr på med gentagen praksis, er metoden enkel at udføre. Det er især i uddannelse, anbefalede, at post-operative okulær eksamener udføres for at bestemme resultater. Vinkel og dypde af injektion nålen vil sandsynligvis behov for justering i overensstemmelse hermed at denne feedback afhængigt af den kirurgiske set-up, alder af dyr, og/eller hvis andre dyrearter bruges (fx, mus).
For at evaluere injektion kvalitet og bestemme medtagelse eller udelukkelse fra en undersøgelse, er tilstedeværelsen af subretinal blødte fra OCT observation kritisk. I laboratorier, hvor OCT er ikke tilgængelig, de kriterier, der er beskrevet nedenfor kan bruges til en hurtig screening af kirurger for at udelukke formodede injektion mislykkes: (1) før injektion: (a) Pilot hul er lavet for dybt (dvs., betydelig dybde > 500 µm; for den brand af insulin nål bruges her, afstand fra needle-tip til midten af facet er 500 µm). b pilot hul blødninger overdrevent (dvs., blødning kan ikke stoppes aktiveringskraft på hullet med øjet spears). c injektion nålen går for dybt (dvs, betydelig dybde > 500 µm eller markør på injektion nål går ind i sclera/choroidea/ÅV komplekse væv). (2) under injektion: (a) kan ikke opretholde injektion nålen i den pilot hul under injektion. b lækage umiddelbart omkring injektion kanyle under injektion. c injektion kanyle er skubbet for dybt (dvs., markør på injektion nålen går ind i sclera/choroidea/ÅV komplekse væv) som bemærket af kirurgen under injektionen. (d) ikke i stand til at opretholde injektion nålen i stilling i mere end 5 sekunder efter injektionen. (e) overdreven blod når tilbagetrækningskraften injektion nålen. f ingen tilbagestrømning/efflux set efter retraktion af injektion nålen når kombineret med trin 2.
Taget sammen, med omhyggelig forvaltning af nålen placering, vinkler og dybder, trans-scleral subretinal injektionsteknik er meget pålidelige og præcise, og kan bære minimalt Kirurgisk traume. Med alle disse fordele, kan denne teknik bruges til levering af ÅV celler, men også til andre celletyper, forbindelser eller genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Patty Lederman for hendes hjælp på kirurgi og Susan Borden for ÅV celle forberedelse. Vi anerkender også NYSTEM C028504 for finansieringen af dette projekt. Justine D. Miller understøttes af NIH give F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
