Summary
حقن سوبريتينال قد طبقت على نطاق واسع في الدراسات الإكلينيكية للعلاج باستبدال الخلايا الجذعية لكبر السن البقعي. في هذه المقالة تصور، يصف لنا تقنية حقن سوبريتينال أقل مخاطرة واستنساخه وتعديل التحديد عن طريق نهج ترانس-سكليرال لتوصيل الخلايا إلى عيون الفئران.
Abstract
أمراض الشبكية التنكسية مثل كبر السن البقعي (AMD) هي السبب الرئيسي لفقدان البصر الذي لا رجعة فيه في جميع أنحاء العالم. أية أم دي تتميز بانحطاط الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) التي هي أحادي الطبقة خلايا الداعمة وظيفيا وتشريحيا الالتفاف حول الشبكية العصبية. العلاجات الدوائية الحالية لعدم نيوفاسكولار أية أم دي (AMD الجافة) فقط إبطاء تطور المرض ولكن لا يمكن استعادة الرؤية، مما يستدعي دراسات تهدف إلى تحديد الاستراتيجيات العلاجية الرواية. استبدال الخلايا RPE التنكسية بالوعد يحمل الخلايا السليمة لعلاج أية أم دي الجاف في المستقبل. وتشمل الدراسات السريرية واسعة النطاق من الخلايا الجذعية العلاج البديلة لأية أم دي زرع الخلايا RPE المستمدة من الخلايا الجذعية في الفضاء سوبريتينال من النماذج الحيوانية، التي تطبق تقنية حقن سوبريتينال. والنهج الأكثر استخداماً في هذه الدراسات السريرية على الحيوانات طريق ترانس-سكليرال، الذي صعوبة بسبب انعدام التصور مباشرة من نهاية الإبرة، وكثيراً ما يمكن أن يؤدي إلى تلف الشبكية. نهج بديل من خلال الجسم الزجاجي يسمح للمراقبة المباشرة لوضع نهاية الإبرة، ولكن فإنه ينطوي على مخاطر عالية للصدمات الجراحية كما نشعر بالقلق أكثر من أنسجة العين. قمنا بتطوير أسلوب حقن ترانس سكليرال معدلة أقل مخاطرة واستنساخه يستخدم زوايا محددة بإبرة وأعماق بنجاح واستمرار تسليم RPE الخلايا في الفضاء سوبريتينال الفئران وتجنب الأضرار الشبكية المفرط. الخلايا التي تم تسليمها بهذه الطريقة أثبتت سابقا أن تكون فعالة في الفئران "الكلية الملكية للجراحين" (نظام المنسقين المقيمين) لمدة شهرين على الأقل. يمكن استخدام هذا الأسلوب ليس فقط لزرع الخلايا ولكن أيضا لتسليم الجزيئات الصغيرة أو العلاج الجيني.
Introduction
شبكية العين البشرية تقع في الجزء الخلفي من وظائف العين كأنسجة حسية خفيفة ويلعب دوراً حاسما في تصور الرؤية. الخلل في الخلية الشبكية أو موت الخلايا وبالتالي يسبب مشاكل في الرؤية أو العمى الدائم. الاضطرابات التي تشمل ضمور أو اختلال وظيفي للخلايا في طبقات مختلفة من الشبكية معروفة كأمراض الشبكية التنكسية، بينها AMD هو النوع الأكثر شيوعاً، والسبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في كبار السن في البلدان المتقدمة النمو 1،2. عملية المرضية من AMD يرتبط بتراكم "دروسين" بين طبقة RPE وغشاء بروخ الكامنة في، الذي بدوره يضعف الدعم RPE الفسيولوجيا مستقبله، مما يؤدي إلى ضمور الشبكية العصبية و فقدان الرؤية3، 4،5. وحتى الآن لا يوجد علاج متقدمة الجاف AMD (غير نيوفاسكولار). ظهور العلاج بالخلايا الجذعية كنموذج جديد في الطب التجديدي يجلب الأمل لاستبدال الخلايا RPE المختلة وظيفيا أو الميت بالخلايا السليمة المستمدة من الخلايا الجذعية. في الواقع، وقف الدراسات السريرية واسعة النطاق لزرع خلايا (مثلاً، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية)-المشتقة من الخلايا RPE في نماذج حيوانية RPE التنكسية قد أجرى6،7، التي انتقلت إلى التجارب السريرية8،9 (NCT01344993، ClinicalTrials.gov). في الآونة الأخيرة، وحددت لدينا مختبر مصدر بديل للخلايا الجذعية المقيم في طبقة RPE البشرية، أن الخلايا الجذعية RPE البشرية (هربيسكس)، ويستخدم حاليا في الدراسات السريرية لعلاج زرع الخلايا (هربيسك-RPE) RPE المستمدة هربيسك لأية أم دي 10 , 11 , 12 , 13.
يتم تطبيق تقنية حقن سوبريتينال في الدراسات السريرية المذكورة أعلاه بواسطة مجموعات متعددة، بما في ذلك مجموعتنا. وهناك نهجين عامين لحقن سوبريتينال في الحيوانات: ترانس-فيتريل وعبر سكليرال. النهج ترانس-فيتريل الذي يتميز بالجراح التمكن من مراقبة مباشرة نهاية إبرة تخترق العين الأمامي، يعبر تجويف فيتريل كامل المتاخمة للعدسة، وتخترق الشبكية في الجزء الخلفي للعين لتصل سوبريتينال مساحة14،،من1516. ومع ذلك، فإنه يتطلب تعطيل الشبكية في موقعين (الأمامي والخلفي)، ينطوي على خطر الأضرار بالعدسة، ويمكن أن يؤدي في الدفق خلايا في الجسم الزجاجي عندما يتم سحب الإبرة. وفي المقابل، النهج ترانس-الصلبة العينية، من حيث المبدأ، يتجنب إشراك الشبكية والجسم الزجاجي، والدفق مخارج العين. في القوارض المصطبغة، الجراح في البداية أن نلاحظ تغلغل الصلبة العينية، ولكن بعد مرور في المشيمية المصطبغة، نهاية إبرة لم تعد مرئية. دون المراقبة المباشرة، خرق الشبكية شائع، ويمكن أن يسفر عن تشريح الشبكية والتسليم للخلايا و/أو الدم الجسم الزجاجي. علاوة على ذلك، لأنه منحنى على سطح العين، فإنه من الصعب جداً معرفة زوايا إبرة والأعماق التي هي الأكثر فعالية لحقن ترانس-سكليرال.
في هذه المقالة تصور، نقدم طريقة حقن سوبريتينال ترانس سكليرال أبلغ عن طريق استخدام التقييمات بعد الجراحة مع "البصرية التماسك التصوير المقطعي" (OCT)، التي تتيح إجراء فحص مفصل للحقن. تستخدم تقنية حقن ترانس سكليرال لدينا مواقع المعرفة، والزوايا، وأعماق لابر الحقن لإنتاج منخفضة جداً من الصدمة الجراحية والموثوقية العالية. هنا، علينا أن نظهر على وجه التحديد حقن الخلايا هربيسك-RPE في الفضاء سوبريتينال من الفئران نظام المنسقين المقيمين، نموذج ما قبل سريرية للبشرية أية أم دي. مع هذا الأسلوب حقن، نحن بنجاح واستمرار تسليم الخلايا هربيسك-RPE في الفضاء سوبريتينال من عيون الفئران نظام المنسقين المقيمين مع نسبة نجاح عالية جداً. حقن الخلايا وجد سابقا أن يؤدي إلى الحفاظ على نظام المنسقين المقيمين photoreceptors 2 أشهر على الأقل بعد حقن13. هذه الإجراءات تتم تحت مجهر تشريح وسهلة التعلم. أنه يتطلب شخصين (طبيب جراح ومساعد) للقيام الحقن ومتوسط الوقت لحقن لكل الحيوانات أقل من 5 دقائق. بزوايا محددة والأعماق للحقن بالإبر تجعل من الممكن للمختبرات والتي يتوفر فيها OCT، تحقيق نجاح حقن سوبريتينال. أنها تسمح للوصول سوبريتينال استنساخه بدرجة عالية، ويمكن استخدامها لزرع الخلايا، بل أيضا للمخدرات العلاجات التسليم والجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في "جامعة ولاية نيويورك" في ألباني.
1-حقن قبل إعداد
-
إعداد تعليق خلية هربيسك-RPE
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية في زراعة الأنسجة المعقمة هود والإلمام بتقنية تعقيم الأساسية المطلوبة.- عزل الخلايا الأولية حرب من المانحين البشرية عيون الذين تتراوح أعمارهم بين 50-90 عاماً، وخلايا الثقافة في لوحات جيدا 2412. كريوبريسيرفي الخلايا في مرور 1، وذوبان الجليد حسب الحاجة وثقافة المرور 2 (P2) خلايا لمدة 4-5 أسابيع (الشكل 1A) للحقن.
- إزالة الثقافة المتوسطة12 ولطف الآبار شطف مرتين مع 500 ميليلتر استعد قبل 1 × دولبيكو "الفوسفات مخزنة المالحة" دون الكالسيوم والمغنيسيوم (1 × دببس-مركز المرأة والأسرة) بإضافة 1 X دببس-مركز المرأة والأسرة في الآبار باستخدام ماصة ميليلتر 1,000 وإزالته باستخدام فراغ.
- إضافة 300 ميليلتر التربسين/الدناز لكل بئر. احتضان خلايا هربيسك-RPE التربسين/الدناز (كو 4 الدناز كل 1 مل من 0.25% التربسين-يدتا) لمدة 4 دقيقة عند 37 درجة مئوية فصل الخلايا.
- فحص الخلايا تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانوا قد اعتقلوا. الاستمرار في احتضان الخلايا في التربسين/الدناز 2 دقيقة إضافية إذا كانوا لا قد اعتقلت حتى الآن.
- حالما يتم تقريب الخلايا، استخدم ماصة ميليلتر 1,000 تريتوراتي الخلايا المنفصلة من البئر ونقل التربسين/الدناز الذي يحتوي على خلايا منفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع تساوي حجم المعالجون مسبقاً الثقافة المتوسطة، لإلغاء تنشيط التربسين/الدناز.
- شطف الآبار بحرارة قبل 1 X دببس-مركز المرأة والأسرة بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً، لا سيما حول حواف البئر؛ قم بإضافة هذه الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل السابق.
- الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية في 286 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الخلايا.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 1 مل الثقافة المتوسطة.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- الطرد المركزي في 286 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الخلايا.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في العقيمة متوازنة الملح الحل (BSS) في الخلايا 50,000/ميليلتر (لتقديم خلايا 50,000 في 1 ميليلتر الحجم أثناء حقن سوبريتينال).
- نقل تعليق خلية النهائي (CS) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل ونضع في خليط الماء المثلج حتى استخدام الحقن.
-
إعداد الخلية حاقن
- إدراج إبرة مشطوف 33-قياس معقمة في الحقن بحقنه والمسمار محكم لتجميع محقن.
- مسح الحاقن مع الإيثانول 100% 5-6 مرات.
- مسح الحاقن مع الإيثانول 70% 5-6 مرات.
- مسح الحاقن مع BSS 5-6 مرات.
- علامة الإبرة حاقن بقلم ماركر سوداء عقيمة في موقف من 600 ميكرون بعيداً عن غيض الإبرة تحت مجهر تشريح (الشكل 1B).
- ضع محقن في ميكرومانيبولاتور للحقن.
2-سوبريتينال حقن
-
منطقة العمليات الجراحية وإعداد الحيوانات
- وزن الفئران قديمة في أسبوع 4-5 نظام المنسقين المقيمين (60-100 جرام) وتخدير باستخدام نظام التسليم بالبخار إيسوفلوراني.
ملاحظة: للحث على إبقاء التخدير معدل التدفق إيسوفلوراني 5%. تأكيد عمق التخدير عن طريق الضغط على الكفوف، ومن ثم خفض معدل التدفق إلى 2-3% للحفاظ على التخدير أثناء الجراحة. - مكان ثني جراحة معقمة، مع لوحة تدفئة أسفل، في مرحلة مجهر تشريح إقامة منطقة جراحية معقمة.
- نقل الفئران إلى منطقة العمليات الجراحية والفئران في مخروط الآنف متصل بنظام إيسوفلوراني للحفاظ على التخدير.
- يغطي الجسم في الفئران مع شاش. قرصه تو للفئران للتأكد من التخدير الكامل.
- وزن الفئران قديمة في أسبوع 4-5 نظام المنسقين المقيمين (60-100 جرام) وتخدير باستخدام نظام التسليم بالبخار إيسوفلوراني.
-
ترانس-سكليرال حقن سوبريتينال تحت المجهر
- تطبيق قطره من زيوت التشحيم العين في العين أونوبيراتيد في الفئران.
- ضع الفئران على الجانب الأيمن مع العين اليسرى، تواجه الحد الأقصى للحقن، ورأسه نحو اليد اليمنى للجراح وظهرها نحو الجراح.
- تقليم أي شعيرات التي تغطي العين مع مقص صغير.
- التنقيط وكمية صغيرة من غسل العين من الجانب الزمني من العين اليسرى وجمع الفائض إلى جانب الآنف مع قضيب القطن شطف العين.
- تمدد التلميذ مع فينيليفريني تروبيكاميدي و 2.5% 1% (طازجة من فينيليفريني 10% باذابته في العقيمة 0.9% المالحة اليوم لعملية جراحية) لامتحان أكتوبر بعد حقن بتطبيق قطره واحدة لكل منهما.
- اجذب الجلد المحيطة بالعين 4-6 مرات لفتح الجفن حيث تكون العين قليلاً بروبتوسيد لتسهيل الوصول إلى المناطق الخلفية ليمبوس.
- تطبيق قطره غسيل العين وإبقاء العين رطبة.
- بلطف تريتوراتي CS (أعد الخطوة 1.1.12) وتحميل الحاقن مع 1.2 ميليلتر CS. يستخدم ميليلتر 0.2 إضافية للتعويض عن حقن الدفق.
ملاحظة: استناداً إلى قياسات لدينا، حول الخلايا 5,000-8,000 تضيع في الدفق مع حقن الخلايا/ميليلتر 50,000 الذي يساوي حوالي 10-16% فقدان الخلية وتم حقن إضافية من 0.2 ميليلتر CS لتعويض هذه الخسارة في الخلية. - ضع حاقن مليئة CS في ميكرومانيبولاتور (أو يكون مساعدا أنه عقد) عمودياً ك RPE الخلايا تميل إلى بالوعة بسهولة في التعليق.
- تطبيق قطره 0.5% بروباراكيني (مخدر موضعي المحلية) على العين وإزالة الزائدة مع قضيب القطن.
ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن قمع منعكس القرنية ويمنع العين من الوميض أثناء الخطوات اللاحقة. - استخدام الملقط بقبضة الملتحمة الخلفي ليمبوس واستدارة العين انفيا، ورفع الملتحمة جعل "خيمة".
- استخدام مقص لقطع الجزء العلوي من "خيمة" لجعل فتحه صغيرة في الملتحمة وفضح الصلبة الكامنة.
- استخدام الملقط إلى قبضة حافة الهامش الملتحمة المتبقية بجوار ليمبوس واستدارة العين انفيا حيث يكون المحور الحدقة بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة بالنسبة إلى أعلى الجدول (الشكل 1). تجتاح استمرار الهامش الملتحمة ضروري لتوفير قوة مضادة أثناء غرز الإبرة والحفاظ على العين بزاوية أمثل.
- جعل ثقب تجريبية لحقن الخلية، ضع نهاية إبرة الأنسولين 31-قياس مشطوف العقيمة على مكم 1,200-1,500 الخلفي ليمبوس مع افتتاح نصيحة مواجهة.
- ضبط زاوية إبرة الأنسولين بحيث أنه من 10-15 درجة فوق الصلبة (عرضية لطائرة وهمية في موقع الحقن المقصود). اختراق المجمع المشيمية الصلبة إلى عمق حوالي 500 ميكرومتر إبرة ببطء. نهاية إبرة في الفئران المصطبغة، سوف 'تختفي' تحت المشيمية المصطبغة. للعلامة تجارية إبرة الأنسولين المستخدمة هنا، هو المسافة من الحافة إبرة إلى المجسم مشطوف الحواف 500 ميكرومتر.
- بعناية سحب إبرة الأنسولين (قد ينظر انصباب صغيرة جداً من الدم).
- إذا أشار إلى النزيف، يمكن تطبيقها رمح عين لمسح الحفرة، إذا لزم الأمر. استمرار النزيف بعد تطبيق الرمح يشير إلى سفينة ربما تكون قد تضررت.
- دليل الإبرة تحميل الخلية حاقن RPE في حفرة رائدة، مع فتح التي تواجه أسفل، وفي زاوية من حوالي 10-15 درجة بالنسبة إلى السطح المحلية من الصلبة العينية.
- برفق إدراج إبرة محقن في حفرة رائدة على عمق حوالي 500 ميكرون الوصول إلى الفضاء سوبريتينال. ينبغي أن يكون هناك حول هامش 100 ميكرومتر بين حافة علامة قلم أسود ونقطة حيث تغطيها الإبرة المشيمية المصطبغة (الشكل 1 ود 1).
- اسأل المساعد كساد برفق المكبس المحاقن محقن لحقن ملائمة حجم الخلايا (حوالي 1.2 ميليلتر). تكون على استعداد لتقديم بعض قوة مضادة المساعد يضغط على المكبس.
ملاحظة: يمكن أن توفر الممارسة السابقة وهمية مع المساعد كل الجراح والمساعد مع الخبرة اللازمة مع هذه الخطوة. - بينما تركز بصريا على القلم مارك الحافة وعقد محقن في مكان ل 25-30 s ثم تتراجع ببطء محقن. ويلاحظ عادة كمية صغيرة من الدفق.
ملاحظة: إذا كان يتم ملاحظة لا الدفق، قد يكون هناك حقن حقن. إذا كنت ترى الدفق عن طريق الختم أو خلايا ملء تحت الصلبة العينية، تم الحقن ضحلة جداً. - شطف efflux خلية من موقع الحقن مع غسل العين العقيمة 3 مرات وجمع الفائض مع قضيب القطن.
- تطبيق قطره من زيوت التشحيم العين في العين تعمل ونقل الفئران إلى مركز أكتوبر لدراسة موقع الخلايا المزروعة وحجم بليب سوبريتينال.
3-بعد حقن العلاج
-
علاج مسكن للالتهابات والألم
- حقن البوبرينورفين في 0.1 مغ/كغ من وزن الجسم في المياه المالحة تحت الجلد لخفض الألم.
- حقن الديكساميتازون في 1.6 ملغ/كغ من وزن الجسم في المحلول الملحي بالحقن داخل (القائمة) لمكافحة الالتهابات.
-
استرداد الحيوان
- تعود الفئران إلى القفص الانتعاش تحت مصباح حرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
- مراقبة العين تعمل لعلامات النزف.
- مراقبة الفئران للتأكد من أنها تأتي من التخدير.
- العودة الحيوان المستردة إلى قفص طازجة والعلم القفص مع بطاقة جراحة، ورصد يومي لأي إشارات الاستغاثة، ونزيف في العين، أو نسبة تظليل القرنية. إعلام الطبيب البيطري فورا إذا كان هناك مخاوف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام تقنية الموضحة في هذه المقالة، نحن ألقي باستمرار خلايا هربيسك-RPE في الفضاء سوبريتينال من الفئران نظام المنسقين المقيمين بالتحكم في دقة الموقع، وزاوية وعمق إدخال إبرة محقن الأنسجة (الشكل 1B-د ). فورا أجرى زرع الأعضاء التالية، النظر في أكتوبر للاحتفال بالحقن وبليب سوبريتينال التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا المزروعة. بعد الجراحة أكتوبر التقييم بمثابة أداة فحص لتقييم نوعية الحقن والرصد لتلف الشبكية أو نزيف. كلا بليب سوبريتينال (الشكل 2 أ، ج ود) ويمكن رؤية موقع الحقن (الشكل 2 أ وب) بوضوح تحت OCT المسح. بليب سوبريتينال يحل عادة في غضون 24 ساعة بعد الحقن. ورغم أن من الصعب قياس حجم بليبس استخدام OCT، يمكن أن نقدر منطقة بليب على افتراض أنها مساوية لمنطقة الحفاظ على مستقبله بزرع الخلايا. أظهرنا سابقا أن حقنه 1 ميليلتر من الخلايا 50,000 يمكن أن يؤدي توفير حوالي 6-7% منطقة الشبكية المنسقون المقيمون حول موقع الحقن13. كما هو مبين في الشكل 2 أ، ج د، الشبكية طبقات كانت سليمة في موقع الحقن، تم الكشف عن لا الدم في بليب، ولم يلاحظ أي خلايا في الجسم الزجاجي، مما يدل على الحد الأدنى من الصدمة الناجمة عن الحقن. بالإضافة إلى ذلك، الممثل الصور أكتوبر فشل الحقن أدرجت أيضا للرجوع إليها (الشكل 2 هاء و واو).
مع استخدام OCT كأداة للتغذية مرتدة، ونحن الأمثل بزاوية وعمق غرز الإبرة حاقن الأنسجة. بمجرد الأمثل، فشل هذا الأسلوب يسمح لنا بتحقيق نسبة نجاح الوصول سوبريتينال 90.8 في المائة مع الجراحية فقط 5.7 في المائة، استناداً إلى نتائج أكثر من 300 حقن سوبريتينال السابقة في أعمالنا الأخرى دراسات13 (الجدول 1). بنسبة 3.5 في المائة المتبقية، لم تجر حرارتها لعدة أسباب، بما في ذلك عيون لا في موقف كافية بسبب العين المرتبطة بالتخدير isoflurane المتداول17.
في 7 أيام بعد زرع الأعضاء، انوكلياتيد عيون الفئران تعمل، الثابتة ومقطعة لتحليل إيممونوهيستولوجيكال. علامة النووي (هنو) خلية بشرية18 و علامة (OTX2) خلية RPE19 استخدمت للكشف عن الخلايا المزروعة. أظهر الرقم 3 طبقة سميكة من زرع RPE الخلايا في الفضاء سوبريتينال، أسبوع واحد بعد الحقن، وكان إيجابيا ملطخة بكل علامات، تأكيد الهوية والنجاح في إيصال زرع. في أسبوع واحد بعد الحقن، عدد كبير من الخلايا، كما هو موضح في الشكل 3، قد سرعة الانخفاض إلى عدد قليل في وقت لاحق بسبب الاستجابة المناعية المضيف حتى في إيمونوسوبريسيد نظام المنسقين المقيمين الفئران20. ومع ذلك، كما ذكر أعلاه، يمكن الاطلاع على طبقة مستقبله تحولت من عيون الفئران نظام المنسقين المقيمين إنقاذهم لمدة شهرين على الأقل بعد زرع مع هربيسك-RPE13.
الشكل 1 : صورة للخلايا هربيسك-RPE P2 4-الأسبوع القديمة ومظاهره من زاوية وعمق الإبرة حاقن يستخدم أثناء الحقن. (A) صورة مرحلة-على النقيض من الخلايا هربيسك-RPE P2 4-الأسبوع القديمة المستخدمة للحقن. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(ب) تخطيطي عرض 600 ميكرون المسافة بين حافة العلامة وطرف الإبرة حاقن تقاس عبارة. تخريج عبارة الحد الأدنى هو 100 ميكرومتر. (ج) الكرتون عرض المقطع العرضي التشريحي من العين الجرذ وطريقة عرض جانب من زاوية وعمق الإبرة حاقن يدرج في الجدار العين. المحور الحدقة العين الجرذ 30 درجة بالنسبة إلى أعلى الجدول والإبر حاقن 15 درجة بالنسبة إلى السطح المحلية من مقلة العين. (د) رسم كاريكاتوري يظهر نقطة انطلاق للعلامة على الإبر حاقن وعرض أعلى من موقع الحقن حيث يتم إدخال 500 ميكرومتر الإبرة حاقن في الأنسجة ومسافة 100 ميكرومتر متروك بين فتح ثقب الحقن وحافة marke ر. موقع الحفرة هو مكم 1,200-1,500 الخلفي ليمبوس. نصيحة إبرة يظهر على جانبها، لكن ينبغي أن الوجه للأسفل أثناء الحقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الصور أكتوبر العين الجرذ تعمل فورا بعد الحقن. (أ) صورة أكتوبر ب-المسح الضوئي للعين تعمل بعرض موقع بليب وحقن سوبريتينال، دون حقن نزيف. (ب) أكتوبر حجم كثافة إسقاط (VIP) صورة من سلسلة ب-المسح الضوئي الذي يمثل صورة منطقة حقن النظارة انفيس. موقع الحقن الصغيرة مرئياً في الصورة كبار الشخصيات تظهر الصدمة الحد الأدنى. (ج) صورة أكتوبر موسع (أ) إظهار الخلايا المزروعة في الفضاء سوبريتينال مع جميع طبقات الشبكية ملحوظ. هذه الصورة تبين أن الخلايا المزروعة كانت موجودة في الفضاء سوبريتينال. (د) صورة أكتوبر ب-مسح عرض بليب سوبريتينال حجم متوسط. (ه) صورة أكتوبر ب-مسح عرض حقنه سوبريتينال فاشلة مع خدمات العملاء الموجودة في الفضاء حقن. (و) صورة أكتوبر ب-مسح عرض حقنه سوبريتينال فاشلة مع دس الشبكية كامل عن طريق في موقع الحقن. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إيمونوهيستولوجيكال تلطيخ من الشبكية تجميد الأجزاء بعد زرع الخلايا هربيسك-RPE. (أ) الإنسان النووية علامة خلية (هنو) تلطيخ يشير إلى الكشف عن زرع الخلايا البشرية RPE. (ب، ه) خلية نووية مضادة تلطيخ (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي؛ DAPI) عرض طبقات الشبكية وزرع الأعضاء، وطبقة RPE. (ج) الصورة المدمجة من هنو و DAPI مشيراً إلى أن حرب زرع الخلايا الموجودة في الفضاء سوبريتينال. الفصل بين عملية زرع وطبقة RPE قطعة أثرية معالجة المرتبطة بحماية البرد عيون نظام المنسقين المقيمين للمقاطع المجمدة. (د) RPE خلية تلطيخ علامة (OTX2) لزرع خلايا RPE البشرية. (و) صورة مدمجة OTX2 و DAPI. شريط المقياس = 20µm- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| نظام المنسقين المقيمين إجمالي حقن الفئران العيون | حسن بليبس سوبريتينال تحت أكتوبر | بليبس سوبريتينال الصغيرة تحت أكتوبر | مجموع بليبس سوبريتينال غير معقدة في أكتوبر | كومبليكاتد بليبس سوبريتينال تحت أكتوبر (أي فقاعة هواء في ذلك أو نزيف الشبكية) | أكتوبر لا إجراء | فشل العمليات الجراحية (لا بليب سوبريتينال تحت OCT) | |
| العد | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % من مجموع العيون حقن | ------ | 82.80% | 7.96% | 90.76% | 1.59% | 1.91 في المائة | 5.73% |
| (يتم تلخيص هذه البيانات من عشرة أفواج من حقن سوبريتينال في الفئران نظام المنسقين المقيمين) | |||||||
الجدول 1: موجز لحقن سوبريتينال من عشرة أفواج التجريبية في الفئران نظام المنسقين المقيمين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية حقن سوبريتينال المبينة في هذه المادة عبر المسار عبر سكليرال، حيث تخترق الإبرة حاقن الطبقات الخارجية (الصلبة-المشيمية-RPE مجمع) الجدار العين دون إيذاء الشبكية العصبية أو الإخلال بتجويف الزجاجي. وقد نهج بديلة ترانس-فيتريال مخاطرة محتملة الضرر العدسة مما يؤدي إلى إعتام عدسة العين، منذ عدسة القوارض يشغل معظم التجويف الزجاجي. مقارنة بهذا الأسلوب، لدينا تقنية أقل مخاطرة ويسبب الصدمة الحد الأدنى كما إبرة محقن لا تحتاج إلى الذهاب عبر تجويف الزجاجي كاملة الوصول إلى مساحة سوبريتينال. وفي الواقع، امتحانات أكتوبر في دراساتنا بينت أحداث اختراق الشبكية نادرة جداً، وفي متابعة الامتحانات في الحيوانات، وهناك لا انفصال الشبكية المستمرة. بالإضافة إلى ذلك، موقع حقن صغيرة جداً (< 200 ميكرومتر في القطر) عند استخدام حاقن 33-قياس إبرة حتى الاضطرابات الهيكلية الصلبة-المشيمية-RPE المجمع محدود جداً. بعد سحب الإبرة، ثقب الحقن الذاتي الأختام تلقائياً حتى لا غرزة أو يحتاج إلى التصاق الأنسجة.
مضاعفات عملية جراحية تشمل النزيف حول منطقة الحقن، أو من داخل حفرة رائدة. عند استخدام الملقط قبضة الهامش الملتحمة في ليمبوس، يلزم القوة فقط لطيف لتجنب معسر الأوعية الدموية وتقليل النزيف ممكن. قبل إنشاء حفرة رائدة، بفحص موقع حقن المقصود لتجنب اختراق الأوعية الدموية سطحية. باستخدام رمح، يمكن أن يتم مسح ثقب التجريبية للدم قبل إدراج إبرة حقن الخلية. إذا استمر النزيف من ثقب التجريبية بعد عدد قليل من الطلبات الرمح، سفينة قد تكون مكسورة. لاحظنا تعقيد آخر نسبة مئوية صغيرة من الفئران نظام المنسقين المقيمين النامية نسبة تظليل القرنية قد. وفي بعض الحالات، نسبة تظليل المزمنة وآخرون عابرة. وأزيلت الحيوانات مع نسبة تظليل المستمرة من فريق الدراسة. يمكن وضع نسبة تظليل القرنية بسبب جفاف العين، والأضرار المادية، والتهاب، والمخدرات أو تهيج الكيميائية21. لتقليل تكونها، العين ينبغي أن تظل رطبة في طريق الحفاظ على تزييت العين وافرة، وتجنب لمس القرنية مع قضيب القطن أو أدوات أخرى خلال العملية.
بروتوكول الحقن المبينة هنا يستخدم نهج محدد الزوايا وأعماق إبرة بالنسبة إلى معالم العين، وزوايا العين بالنسبة للجدول الجراحية في التشكيل لدينا. من المهم استخدام الحقن بعد أكتوبر مسح في صقل هذه المعلمات حقن توفير المراقبة استنساخه لزرع الخلايا RPE في الفضاء سوبريتينال الفئران بدقة عالية. مرة واحدة يتقن الممارسة المتكررة، الطريقة بسيطة لتنفيذ. من المستحسن، لا سيما في مجال التدريب، أن امتحانات العين بعد الجراحة تتم لتحديد النتائج. زاوية وعمق التكيف المحتمل ضرورة الإرادة إبرة حقن تبعاً لذلك إلى هذه الملاحظات اعتماداً على طريقة إعداد العمليات الجراحية، عمر الحيوان، و/أو إذا كان يتم استخدام الأنواع الحيوانية الأخرى (مثلاً، الماوس).
لتقييم نوعية الحقن وتحديد إدراج أو استبعاد من دراسة، وجود سوبريتينال نزف من أكتوبر المراقبة أمر بالغ الأهمية. في المختبرات، حيث يتوفر OCT، المعايير المبينة أدناه يمكن أن يستخدمها لفحص سريع الجراحين لاستبعاد فشل الحقن المشتبه فيهم: (1) قبل الحقن: ثقب تجريبية (أ) يرصد عميق جداً (أي، عمق كبير > 500 ميكرومتر؛ العلامة التجارية لابره الأنسولين المستخدمة هنا، المسافة من الحافة إبرة في وسط المجسم مشطوف الحواف هو 500 ميكرومتر). (ب) ثقب التجريبية ينزف مفرطة (أينزيف لا يمكن إيقافه تطبيق القوة في الحفرة مع سبيرز العين). (ج) إبرة حقن يذهب عميق جداً (أي، وعمق كبير > 500 ميكرومتر أو العلامة على إبرة حقن يذهب إلى الأنسجة المعقدة الصلبة/المشيمية/RPE). (2) أثناء الحقن: (أ) قادر على الحفاظ على إبرة حقن في حفرة رائدة خلال الحقن. (ب) التسرب فورا حول إبرة حقن أثناء الحقن. (ج) إبرة حقن دفعت عميق جداً (أي، العلامة على إبرة حقن يذهب إلى الأنسجة المعقدة الصلبة/المشيمية/RPE) كما لاحظت من قبل الطبيب الجراح أثناء الحقن. (د) قادر على الحفاظ على إبرة حقن في موقف لأكثر من 5 ثوان بعد الحقن. (ﻫ) المفرط الدم عند سحب إبرة حقن. (و) أي الدفق/efflux ينظر بعد سحب إبرة حقن عندما تقترن بالخطوة 2.
أخذت معا، مع إدارة حذرة من مكان الإبرة والزوايا، وأعماق، تقنية حقن سوبريتينال ترانس سكليرال هو موثوق بها للغاية، ودقيقة، ويمكن أن تحمل الصدمات الجراحية الحد الأدنى. مع كل هذه الفوائد، يمكن استخدام هذا الأسلوب لإيصال الخلايا RPE، بل أيضا لسائر أنواع الخلايا أو المركبات أو العلاج الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر ليدرمان باتي لمساعدتها على الجراحة وسوزان بوردن لإعداد الخلية RPE. ونعترف أيضا C028504 نيستيم للتمويل اللازم لهذا المشروع. جوستين ميلر دال-معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
