Summary
이 연구는 자유롭게 움직이는 마우스에서 깨어있는 낭종 측정법을 수행하기위한 수술 절차 및 실험 기술을 설명합니다. 또한 최적화 및 표준화를 지원하는 실험적 증거를 제공합니다.
Abstract
Awake filling cystometry는 자유롭게 움직이는 생쥐에서 방광 기능을 평가하기 위해 오랫동안 사용되어 왔지만 사용 된 특정 방법은 실험실마다 다릅니다. 이 연구의 목적은 깨어 있고 자유롭게 움직이는 마우스에서 방광 내강을 이식하는 데 사용 된 미세 수술 절차와 방광 압력을 기록하기위한 실험 기술을 설명하는 것이 었습니다. 또한, 수술 데이터뿐만 아니라 튜브 유형과 크기가 낮은 요로 기능과 녹음 감도에 영향을 보여주는 실험 데이터가 제공됩니다. 압력 기록에 대한 튜브 지름의 영향은 폴리에틸렌 및 폴리 우레탄 튜브 내에서 상이한 내경을 가지고 평가되었다. 결과적으로 두 재료의 최고 성능 튜브를 수컷 C57BL / 6 마우스 방광의 돔에 외과 적으로 이식 하였다. 수술 후 2, 3, 5, 7 일 동안 건강한 손상되지 않은 동식물에 12 시간 동안 밤새 배뇨 횟수가 기록되었다. 수확시 bladders w총 관찰을 사용하여 부종의 징후를 평가 한 후 병리학 적 분석을 위해 처리했다. 가장 큰 방광 팽창 정도가 2 및 3 일에 관찰되었으며, 이는 방광 기능이 현저하게 손상된 행동 배뇨 데이터와 상관 관계가 있었다. 5 일째, 방광 조직학 및 배뇨 빈도가 정상화되었다. 우리 연구에서 제공 한 문헌 및 증거에 근거하여, 우리는 깨어있는 마우스의 intravesical pressure와 void volume의 생체 내 기록을 위해 다음과 같은 단계를 제안합니다 : 1) 수술 현미경과 미세 수술 도구를 사용하여 수술 수행 2) 폴리에틸렌 -10 3) 수술 후 5 일째 방광 팽창이 해소되었을 때 방광 조영술을 시행하십시오.
Introduction
Filling cystometry (FC)는 방광 충진이 완만 한 동안 압력을 기록하기 위해 카테터를 방광에 삽입하는 진단 방법입니다. 1927 년에 처음으로 하부 요로 기능을 평가하는 임상 진단 방법으로 소개되었지만 널리 사용되었습니다. 연구 응용에서 FC는 건강하고 질병이있는 동물 모델에서 방광 기능을 테스트하고 약리학 적 약제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 설치류 동물 모델은 일반적으로 하부 요로 기능을 조사하는 데 사용됩니다. 2 이 포유류 그룹에서 FC는 처음에는 쥐에서 사용하기 위해 개발되었습니다. 3 방광 내로 튜브를 이식하고 FC를 수행하는 방법은 수용 가능한 수준의 재현성을 가진 많은 연구자들에 의해 잘 기술되고 사용되고있다. 4 트랜스 제닉 및 노크 아웃 균주의 이용 가능성은 수많은 연구 분야에서 쥐를 중요한 종으로 만들고 있으며,하부 요로 기능 장애의 분야를 포함한다. 마우스 방광 측정법을 수행하는 데 사용 된 방법론은 실험실 간 차이가있어 결과를 비교하기가 어렵습니다. 5
생체 외 모델과 비교하여 FC는 하부 요로 조직을 보존하여 배뇨 순환의 저장 및 배뇨 단계를 평가하는 동안 방광과 유출구 사이의 조정 된 기능을 평가할 수 있습니다. 이전의 연구에 따르면 흔히 사용되는 수많은 마취제가 배뇨 수축을 억제합니다. 소변 방광 평활근 수축 (우레탄, 알파 - 클로 라로 오스, 케타민 및 크 실라 진)을 보존하고 동물이 허약 해지도록하는 약제는 기능성 방광 기능을 현저히 감소시키고 신경 전달을 억제합니다. 6 , 7 , 8 , 9 기술적으로 더 도전적이지만, FC는동물을 걷는 것은 배뇨 반사의 기능적 완전성을 보존합니다.
하부 요로 기능은 수술후 방광 벽 팽창, 통증 및 불편 함으로 인한 스트레스 및 환경 영향을 포함한 여러 요인에 의해 영향을받습니다. 튜브 이식시 조직 손상을 최소화하는 외과 기술을 사용하고 튜브 이동을 줄이는 동시에 동물이 자유롭게 움직일 수있게하는 녹음 방법을 사용하면 정확하고 재현성있는 녹음을 얻는 데 필수적입니다.
적절하게 수행되면, 생체 내 자유롭게 움직이는 동물의 FC는 생리적 방광 기능을 확실하게 반영하는 데이터를 제공 할 수 있습니다. 10 자유롭게 움직이는 동물의 FC는 다음 매개 변수에 대한 데이터를 제공 할 수 있습니다. 기초 또는 기준 압력 : 두 개의 저혈압 사이의 최소 압력. Intermicturition pressure : 두 개의 배뇨 사이의 평균 압력. 임계 압력 : Intravesical 압력 imm배뇨 전에 ediately. 최대 압력 : 배뇨 사이클 중 최대 방광 압력. 자발적인 활동 (또는 평균 intermicturition 진동 압력) : intermicturition 압력 마이너스 기초 압력. 보이드가없는 수축 : 유체 방출과 관련이없는 충진 단계에서 방광 내 압력이 증가합니다. 방광 순응도 : 방광 용량을 임계 압력에서 기저 압력을 뺀 값으로 나눈 값. 배뇨 빈도 : 단위 시간당 배뇨 횟수. Intermicturition interval : 두 개의 최대 배뇨 압력 사이의 기간. 방광 용량 : 주입량을 배뇨 횟수로 나눈 값. 이러한 매개 변수 및 표준화 된 용어에 대한 자세한 설명은 이전에 출판되었습니다. 11
FC는 연속 또는 단일주기의 관내 주입 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 지속적인 방광 측정법은 여러 번의 방수 순환을 기록하고재현성에. 방광 용량 측정의 정확도는 잔여 부피가 알려지지 않아 제한적입니다. 또한, 자유롭게 움직이는 생쥐에서 작은 배설물 (30 ~ 184 μL 사이의 변형률 및 성별에 따라 다름)을 수집하는 것은 어렵습니다. 이 방법을 사용하여 기공 량을 기록하는 것은 마취 된 준비에 비해 덜 정확하지만 방광 기능에 대한 마취제의 억제 효과를 피할 수 있다는 점에서 우수합니다. 방광 용량을 평가하기 위해 단일주기 낭종 측정법을 사용해야합니다. 이 방법에서 방광은 주입 전에 흡입에 의해 비워지고 용량은 최대 압력에 대한 시간으로 곱한 주입 속도의 함수로 계산됩니다.
작은 설치류에서 체외 측정법을 수행하는 기술이 발표되었지만 쥐에서 수술이 수행되었으며 우레탄 마취 하에서 마우스 방광 측정이 수행되어야한다고 권고했다. 10 이 의사 소통의 목표는o 방광의 돔에 intravesical tube를 이식하는 데 사용되는 미세 수술 기술과 깨어지며 자유롭게 움직이는 마우스에서 지속적인 방광 충만 및 배뇨 중 하부 요로 기능, 생체 내 기록 실험에 사용되는 실험 설정을 설명합니다. 또한, 생체 내 FC를 수행하는 방법뿐만 아니라 튜빙 길이, 직경 및 재료가 기록에 어떻게 영향을 주는지 실험 하기 위해 수행되었습니다. 이 실험 프로토콜은 이전에 발표 된 기술을 요약하고 실험 결과를 기반으로 많은 수정을 제안합니다.
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Protocol
동물들은 제도적 지침에 따라 University of Vermont Animal Care Facility에 보관되었습니다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리와 사용을 위해 National Institutes of Health 안내서에 따라 수행되었습니다.
1. Intravesical Tube Implantation
- 외과 수술을위한 튜빙 및기구 준비
- 삽입 용 카테터를 만들기 위해 PE-10 튜브 7cm 조각을 자릅니다.
- 끝이 개방 된 화염쪽으로 천천히 전진하여 PE10 튜브의 한쪽 끝에 플레어를 만듭니다.
참고 : 플레어가 발생하자마자 튜브를 신속하게 회수하십시오. - PE10 튜브 외부의 플레어 끝에서 4.5, 5 및 5.5 cm의 아교 총에 낮은 열 설정을 사용하여 범용 핫 아교 세 방울을 바릅니다. 이것은 동물의 등에 튜브를 고정하는 데 도움이됩니다. ( 그림 1 )
- 70 %의 물에 담가서 소독하십시오.에탄올로 세척 한 후 사용하기 전에 멸균 0.9 % NaCl로 세척하십시오. 공기 방울이 시스템에 유입되지 않도록 튜브를 채우십시오.
- 30 게이지 플러그를 만들어 허브에서 30 게이지 바늘을 손으로 조작하여 PE10 카테터 끝 부분을 밀봉합니다. 마지막에 뜨거운 접착제 한 방울을 바르십시오. 씰이 방수되었는지 확인하십시오. ( 그림 2 )
- 다음과 같은 미세 수술 도구를 사용하십시오 : Dumont # 7 곡선 microforceps 두 쌍, Dumont # 5 곡선 microforceps, 21G 바늘, ultrafine 직선 hemostat, 마이크로 가위, 작은 해부 가위 및 마이크로 바늘 홀더.
- 절차를 시작하기 전에 모든기구를 소독하십시오.
- 동물의 준비
- 동물을 마취 한 후 먼저 복부의 아래쪽 절반을 면도 한 다음 동물을 수그러 뜨려 면도기를 뒤집어 70 % 알코올로 베타 인으로 뒤에서 닦으십시오. 눈가에 베타 연고를 바르면 건조하지 않습니다. 다음으로, 직선형의 무딘 가위와 Dumont # 7 곡선 microforce의 쌍을 사용하여 견갑골 사이에 1.5cm 길이의 피부 절개를하고 멸균 용 커튼으로 덮인 난방 패드 (37 ° C) 위에 동물을 위로 놓습니다.
- 마지막으로 복부를 알코올과 베타 딘으로 닦으십시오.
- 외과 적 시술
참고 : 확대경이 3.15X ~ 20X 인 수술 용 현미경으로 모든 수술 절차를 수행하십시오. 동물을 살균 커튼에 올려 놓은 후 살균 장갑을 착용하십시오. 전체 수술을 통해 멸균 절차를 계속 사용하십시오.- 유도 상자에 동물을 넣고 산소 캐리어 (1 L / 분)와 2 % 흡입 isoflurane를 사용하여 마취. 동물의 머리를 노우즈 콘에 넣고 2 % 흡입 된 이소 플루 란을 산소 운반선 (1 L / 분)과 함께 사용하여 절차 전반에 걸쳐 마취를 유지하십시오. 부정을받은 후 수술을 시작하십시오.발가락 - 꼬집음 시험으로부터의 응답.
- 한 쌍의 똑 바른 무딘 가위와 Dumont # 7 곡선 microforce을 사용하여 피부를 통해 1.5cm 하강, 중간 선 복부 절개를하십시오. 그 다음, 선형 방광의 돔과 상반부를 노출시키기 위해 선형 알바와 근육을 따라 근막을 통해 일치하는 절개 부를 만듭니다. Dumont # 7 곡선 마이크로 포셉 한 쌍을 사용하여 각 조직층에 상향 견인력을 적용하여 방광 손상을 피하십시오. 따뜻한 생리 식염수를 떨어 뜨려 복부 내장을 건조로부터 보호하십시오.
- 동물을 옆으로 돌려 목덜미의 절개 부위에 접근하십시오. 절개를 통해 좁은 지혈을 피하로 밀어냅니다. 피하 채널은 뒤에서 시작해서 옆을 따라 계속해야합니다.
- 악기의 끝이 흉곽 바닥에 도달하면 팁을 정중선과 복부쪽으로 돌리십시오 (복벽 근육을 뚫을 때 약간의 갑자기 튀어 나옵니다). 팁이 근육 층 아래의 복부 절개에 노출 될 때까지 지혈 재를 계속 전진시킵니다. ( 그림 3 )
- 지혈제로 튜브의 "비 발화"끝 부분을 잡고 천천히 공구를 후퇴시켜 목 뒤쪽의 절개를 통해 튜브의 끝을 당겨 빼내십시오. 튜브의 플레어 끝을 방광의 돔 바로 위에 놓 이도록 조정하십시오.
- 6-0 모노 필라멘트 봉합사 (비 흡수성)를 느슨하게 묶어 방광 돔 꼭대기에 올려 놓습니다. 이 넥타이는 나중에 튜브를 방광에 고정시키는 데 사용됩니다.
- 보풀이없는 천의 작은 롤을 복부와 방광 뒤에 두어 안정시키고 높이십시오.
- 방광으로 PE10 카테터의 플레어 끝 부분을 삽입 할 준비를하십시오.
- 비 지배적 인 손에서 Dumont # 7 곡선 microforce로 방광의 돔을 잡고 카테터가 방광에 위치 할 때까지이 그립을 유지하십시오.
- 21 게이지 바늘 사용o 돔 꼭대기에 생검을하십시오. 부드럽게 카테터가 구멍을 쉽게 통과 할 수 있도록 # 5 곡선 microforce의 폐쇄 쌍으로 cystotomy를 프로브.
- 방광 돔을 비 지배적 인 손에 쥐고 PE10 카테터의 플레어 끝 부분을 방광에 넣으십시오 (방광 목을 아래로 밀어 방광이 튀어 나오지 않도록하십시오).
- 방광과 튜브의 돔 주위에 6-0 모노 필라멘트 봉합사를 넥타이가 튜빙의 앞쪽에 위치하도록 묶으십시오. 인위적으로 방광 용량을 줄이려면 봉합사를 최대한 방광에 묶어야합니다. ( 그림 4 )
- 또는 다음과 같이 지갑 줄 봉합을 사용하여 카테터를 고정하십시오. 6-0 모노 필라멘트를 사용하여 방광의 돔에 느슨한 지갑 줄 봉합을하십시오. cystotomy를 수행하고 카테터를 삽입 1.3.8.1 - 1.3.8.3 단계를 수행하십시오. 지갑 줄 봉합을 묶어서 튜브를 고정시킵니다. ( 도 5 )
- 튜브의 말단부에 30 게이지 바늘로 0.5 ML 인슐린 주사기를 첨부하여 방광에 튜브의 개통과 인감을 테스트합니다. 요도 구멍에 물방울이 나타날 때까지 천천히 0.9 - 0.1 % NaCl 0.1 - 0.2 mL로 방광을 채운 다음 방광을 흡인으로 없앱니다. 방광을 채우거나 비울 수있는 것이 중요합니다.
- 돔에서 누출이 발생하지 않은 경우, 한 쌍의 곡선 형 마이크로 포셉으로 방광을 받치고 플레어가 방광 돔의 안쪽에 닿을 때까지 부드럽게 튜브를 잡아 당깁니다.
- 닫히기 전에 작은 티슈 롤을 꺼내고 방광이 정상 위치에 있는지 확인하십시오.
- 6-0 달리기 봉합으로 두 층 (근육과 피부)의 복벽을 닫습니다. 앞 복부 근막 (직근의 전벽)의 가장자리 만 봉합하여 직근 복근을 근사하는 것이 좋습니다.
- 동물들에게 튜브를 고정하려면 부드럽게 ro동물을 배에 태우십시오. interscapular 절개로 금속 앵커의 피하 부분을 삽입합니다. ( 그림 12 ) 6-0 봉합사를 사용하여 수직 매트리스 봉합사로 튜브와 앵커를 둘러싼 다.
- 튜브가 빠지지 않도록 접착제 거품이 피부의 위와 아래에 남아 있는지 확인하십시오. 튜브를 피부 위에서 약 2cm 정도 잘라냅니다.
- 소변이 누출되지 않도록 30 게이지 플러그 (1.1.5 단계)를 튜브 끝 부분에 부드럽게 삽입하십시오.
- 0.5 ML 0.9 % NaCl 피하 수화에 대한 주사. 수술 직후 수술후 진통제를주고 48 시간 동안 유지하십시오.
- 적외선 램프 아래에있는 새장에 동물을 넣으십시오. 동물이 새장 주위를 자유롭게 움직일 때까지 일정한 관찰을 유지하십시오.
- 동물을 매일 모니터링하고 기록하기 전에 5 일 동안 회복되도록하십시오.
2. 깨어있는 낭종ometry 녹음
- 기록 프로그램, 압력 변환기 및 주입 펌프 준비.
- 동물을 마취하기 전에 PE50 튜빙을 사용하여 주입 펌프, 압력 변환기 및 22G 스위블을 연결하십시오. ( 그림 6 )
- 컴퓨터에서 시스템 압력을 보정하고 녹음 준비를하기 위해 녹음 프로그램 (예 : 재료 표 참조)을 엽니 다. 보정 및 녹음 중에 동일한 설정을 사용해야합니다.
- 실온 0.9 % NaCl 10 - 15 mL가 들어있는 20 mL 주사기를 채우고 주입 펌프에 넣습니다. 0.6 mL / h의 속도로 주입하도록 펌프를 프로그래밍하십시오.
- 동물의 방광 또는 기록 케이지의 바닥과 같은 높이에서 압력 변환기를 고정시킵니다.
- 22 게이지 스위블을 압력 변환기 끝에 연결하십시오 (PE50 - 튜빙 - 압력 변환기로 스위블하십시오)
참고 : 스위블은 튜브가 꼬이거나 꼬이는 것을 방지하기 위해 사용됩니다.동물이 움직입니다. - 시린지 펌프를 전진시켜 시스템을 통해 0.9 % NaCl을 세척하십시오. 보정하기 전에 모든 기포를 제거하십시오.
- 기록 프로그램이 실행 중일 때 압력계 (cm / H2O)를 눈금자를 사용하여 보정하십시오. 천천히 PE50 테더 끝을 0에서 30cm로 이동하십시오. 필요한 경우 0을 조정하십시오.
참고 : 0cm 표시는 녹음 케이지 및 압력 변환기의 바닥과 동일한 높이에 있어야합니다.
- 녹음 케이지 중앙 위의 22 게이지 회전대를 정지시킵니다. 케이지 바닥이 케이지 아래에 위치한 저울의 수집 장치로 소변을 떨어 뜨릴 수 있도록하십시오. 테어의 높이를 조절하여 마우스가 튜브를 무리하게 당기거나 스트레칭하지 않고 케이지 주변을 자유롭게 움직일 수 있도록하십시오. ( 도 7 )
- 작업이 끝나면 시스템과 외장 PE50 튜브가 0.9 % NaCl로 가득 차고 모든 기포가 제거되었는지 확인하십시오.
- 예습녹음을위한 동물의 aration
- isoflurane 2 %를 흡입하여 동물에게 마취시키고 복부에 놓습니다. 30 게이지 플러그를 제거하고 PE10 테 더 (방광 카테터)를 PE50 테더의 끝으로 밀어 넣습니다. 뜨거운 접착제를 사용하여 방수 밀봉을하십시오.
- 마취를 끄고 소변을 분석 용 저울 위에 놓인 수집 장치에 직접 떨어 뜨릴 수있는 평행선 바닥을 사용하여 동물을 기록 상자에 넣으십시오. ( 도 7 )
- 동물이 새장에 들어갔을 때 기록을 시작하되 주입을 시작하지 마십시오. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 동물을 관찰하십시오. 방광 압력이 안정되면 0.6 mL / h의 속도로 0.9 % NaCl 주입을 시작하십시오.
참고 : 변경 사항이있을 때 녹음 프로그램에 메모하십시오. 주입 시작, 중단 또는 불규칙이 언제 발생했는지에 대한 기록을 갖는 것이 중요합니다. - 시스템에 누출이 있는지 점검하고 동물이 쉽게 누출되는지 확인하십시오물과 음식에.
- 재현 할 수있는 배뇨주기가 3 회 발생할 때까지 조용한 방에서 계속 녹음하십시오.
참고 : 동물은 녹음 과정을 완전히 방해받지 않아야합니다. 바람직하게는 동작을 관찰하기 위해 원격 비디오 모니터링을 사용하십시오.
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Representative Results
tube occlusion 동안 시스템 내 압력 상승과 하강의 일관성에서 튜빙 재료와 직경 사이에는 유의 한 차이가 없었다. 폴리에틸렌 (PE)과 폴리 우레탄 (PU) 재료 모두에서 방광 내벽 팽창 포스트 삽관 튜브 삽입은 유의 적이었다. 2 일째, 심한 점막하 부종이 발생했습니다. 그것은 방광의 단면을 반으로 차지하여 루멘이 막혔습니다. 5 일째, 부종이 완전히 완결되어 점막 부분에 염증 세포가 침투하여 부분적으로 근경을 침범했다. 7 일째에 염증성 침윤이 현저하게 감소되었고 방광벽 조직학이 정상으로 돌아왔다 ( 그림 8 ). 2 일째와 3 일째에 관찰 된 조직 부종의 최대 범위는 행동 장애가있는 방광 데이터와 유의 한 장애가있는 방광 기능을 보여 주었다 ( 그림 9 ). PO로 정규화 된 보잉 주파수 수술 중 5 일째.
깨어있는 자유로이 움직이는 마우스 (최소한의 움직임 인공물)에서의 혈관 내 압력은 10-15cmH2O의 기본 압력을 특징으로하는데, 이는 채우는주기 동안 변화가 없거나 10cmH2O 이상으로 점진적으로 증가 할 수 있습니다 , 갑작스런 박동성 압력 증가가 나타난 다음 배뇨시 떨어집니다 ( 그림 10 및 11 ).
그림 1 : 요로 방광에 이식하기위한 PE10 튜빙. ( A ) 플레어 끝에서 4.5, 5 및 5.5 cm에 뜨거운 아교 방울이있는 PE10 튜빙 7cm 조각. ( B 및 C ) 튜브의 플레어 끝 (튜브를 방광에 고정시키는 데 사용됨)을 보여주는 자세한 그림.es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : PE10 블래 더 튜브의 외부 부분 플러그. 플러그는 30G 바늘과 핫 아교로 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 방광 튜브의 과정. 복부를 통한 튜빙과 목덜미쪽으로의 피하 경로를 보여주는 개략적 인 선 그리기. 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 버전.
그림 4 : 방광 / 튜브 비교 및 손실 Monofilament 봉합사를 사용하여 튜브를 삽입하고 고정하는 데 사용되는 단계. Intraoperative 사진 묘사 : ( A ) 마우스 방광에 PE50과 PE10을 비교하는 그림. ( B ) 방광 주위에 배치 된 6-0 모노 필라멘트 봉합사의 작은 루프. 한 쌍의 # 5 microforceps가 방광의 돔을 걸쇠로 잡아 주며 21G 바늘은 cystotomy를 만드는 데 사용됩니다. ( C ) 방광의 돔을 풀지 않고 반대쪽 손에있는 5 쌍의 마이크로 포플러가 PE10 카테터를 삽입하기 전에 구멍을 조사합니다. ( D ) 6-0 모노 필라멘트 봉합사로 방광의 돔에 고정 된 PE10 카테터. 여기를 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 5 : Purse String Suture는 방광에서 튜브를 고정하기위한 대체 방법으로 사용될 수 있습니다. ( A ) 방광의 돔에서 봉합사를 꿰맨다. ( B ) 지갑 스트링의 중심을 통해 삽입 된 PE10 튜빙. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 실험 설정. 압력 변환기와 intravesical 카테터에 직렬로 연결된 주입 펌프에 0.9 % NaCl을 포함하는 주사기. 오른쪽 아래의 컴퓨터 화면은 3 개의 재생 가능한 음소를 보여줍니다.촉구주기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 실험용 레코딩 설정. ( A ) 22G 회전대가 녹음 케이지 및 균형에 매달려 있습니다. ( B ) 22G 스위블과 PE50 테더가있는 주입 튜빙의 외부 부분의 전체 길이를 보여주는 사진. ( C ) PE50 튜빙을 덮는 스프링 외장으로 22G 회전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : Re의 조직 학적 평가이식 된 PE10 튜브에 요로 방광벽의 스폰지. 수술 전, 수술 후 2, 3, 5, 7 일째에 hematoxylin과 eosin (H & E)로 염색 된 방광 단면. 수술 후 5 일에 방광벽 팽창이 해결되었습니다 .이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : Voiding Spot Assay를 이용한 기능성 방광 평가. 0 일 (관 이식 전), 2, 3, 4, 5 및 7 일의 관상 동맥 내관 이식에서 대표적인 배뇨 패턴을 기록한 자외선으로 여과지상의 소변 반점을 관찰했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : Cystometrogram. 깨어 있고 자유롭게 움직이는 마우스에서 방광 내 방광압의 대표적인 흔적. 재현성있는 3 회의 배뇨 사이클을 보여주는 흔적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11 : 배뇨 단계. 초기 압력 증가, 최대 압력 및 기압으로의 급격한 압력 강하 중 고주파 진동으로 배뇨 단계를 묘사하는 흔적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12 : 테더 고정. ( A ) 앵커는 동물에서 PE10 카테터를 고정하고 튜브가 방광에서 당기는 것을 방지합니다. 디스크가 스프링 외장에 부착되어 있습니다. ( B ) 외부 PE50 튜빙에 연결된 내부 PE10 카테터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13 : 회전 앵커. 앵커의 피하 부분은 ( 1 ) 천으로 만들어진 디스크와 ( 2 ) 금속 루프로 구성됩니다.
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Discussion
intravesical tubing의 최적의 재료와 크기
튜빙의 직경이 압력 기록에 미치는 영향을 결정하기 위해, 우리는 다른 미세 유체 튜브를 테스트했습니다. PE50 (0.58 mm ID), 폴리 우레탄 PU027 (0.4 mm ID), PE25 (0.46 mm ID) 및 PE10 (0.28 mm ID). 각 튜브에 대해 1 mL / h로 작동하는 주입 펌프로 압력을 기록하면서 튜브를 0에서 30 cm까지 수직으로 빠르게 이동 시켰습니다. 초기 생체 내 실험은 PE50 튜빙을 사용하려고 시도했지만 마우스 방광에 비해 튜빙 크기 때문에 실패했습니다 ( 그림 4A ). 이것은 Smith와 Kuchel의 발견을 뒷받침하지만, 마우스의 깨어있는 낭종 측정법에 PE50 튜빙을 사용하면 인공물이 생겨 데이터 해석이 어려워진다는 제안이 있습니다 .12 다른 사람이 깨어있는 비 제한적 PE50 튜빙을 성공적으로 사용했음을 주목하는 것이 중요합니다. , 깨어있는 억제 및 마취 된 마우스 방광 측정. 9 ,PE10은 PE50에 비해 PE10이 더 유연하여 마우스가 움직일 때 튜브가 방광에 가하는 장력을 줄여 운동 장애를 줄입니다. PE10의 단면은 가능한 한 짧아야합니다 (≤ 7cm). PE10 배관이 길수록 압력 판독 값이 낮아질 가능성이 높아집니다. 염증 반응을 감소시키기 위해 intravesical implantation을 위해 PU와 같이 더 부드럽고 생체가 더 불활성 인 물질을 사용하는 것이 이론적으로 유리하지만, 수술 후 방광 팽창에는 큰 차이가 없다. 또한,보다 부드러운 PU 튜빙을 사용하는 시험은 꼬임과 막힘과 관련이 있습니다.
수술로 방광 수축 및 팽창에 미치는 영향
지금까지 방광 기능 및 방광벽 팽창에 대한 데이터는 실험실 내 관의 임플란트 식립 후 래트에서만 이용 가능했다. 이전에 따르면tudies, 배뇨 횟수가 적고 배뇨 횟수는 수술 후 1 ~ 3 일에 더 높았다. 15 또한 랫트의 방광 기능 변화는 방광의 심한 부종과 관련이 있었고 부종은 3 일 후 가라 앉기 시작했다. 일. 16 PE10 튜빙을 이식 한 후 발생하는 수컷 C57BL / 6 마우스의 방광 기능의 변화, 방광 벽의 부종 및 수선 일정을 더 잘 이해하기 위해 12 시간 행동 배뇨 빈도를 여과지 기록 방법을 사용하여 평가했습니다 . 마지막 기록 후, 마우스를 마취시키고 방광을 심하게 평가하고, 수확하고, 고정시키고, 조직 학적으로 평가 하였다. 수술 1 일째와 2 일째에 보이드 빈도가 감소하고 점화가 증가하고 보팅이 3 일째에 증가했다. 5 일째 정상화 된 보디 닝 작용이 나타났다. 수확시와 H & E 염색 후 방광의 총 평가에서 가장 많은 양이 나타났다수술 2 일과 3 일째에 부 피부가 부어 오르고, 튜브 삽입 후 5 일과 7 일에 방광이 대조 방광과 유사하게된다.
임상 역학 연구와 마찬가지로, 대부분의 실험실은 상온 0.9 % NaCl을 사용했다. 이전 연구에서의 주입 속도는 10 μL / min에서 100 μL / min까지 현저히 다양합니다. 마우스에서 방광 기능에 대한 다른 주입 속도의 효과를 비교 한 연구는 수행되지 않았지만, 더 큰 동물 연구에서 얻어진 데이터는보다 느린 충전 속도가 사용되어야한다고 권고했다. 마우스 방광의 작은 체적으로 인해, 연동 펌프가 적절하지 않고 연속 메커니즘 주입 펌프가 필요합니다.
가장 정확하고 유용한 FC 기록은 제한된 인공물과 함께 압력 변화의 양호한 투과율의 균형을 맞 춥니 다. 다음을 사용하여 얻은 결과PE50에 직접 연결된 PE10 튜빙의 짧은 세그먼트는 마우스 방광의 정확한 압력 측정을 제공했습니다. 동물의 움직임으로 인한 압력 변동은 튜브가 목덜미에서 빠져 나오는 지점에서 피부에 고정함으로써 제한 될 수 있습니다 ( 그림 12 및 13 ). 이것은 접착제 거품과 피하에 놓인 금속 패브릭 덮개 판과 튜브를 덮고있는 금속 스프링에 부착 된 외부 피스로 구성된 특수 앵커를 사용하여 얻을 수 있습니다. 튜브가 방광에서 당기는 것을 방지하기위한 추가 방법으로는 PE10 튜빙의 내부 부분을위한 곡선 피하 트랙을 만드는 것이 있습니다.이 피하 트랙은 튜브에 느슨 함을 제공하고 트위스트 및 꼬임을 방지하는 스위블 및 테더를 사용합니다. 이 연구에서 제공 한 문헌 및 증거를 바탕으로 생체 내에서 가장 재현 가능하고 생리적으로 정확한 방법을 제공하기 위해 다음 단계가 권장됩니다마우스 내 방광 내압의 기록. 수술 현미경과 미세 수술 도구를 사용하여 카테터를 방광의 돔에 삽입하십시오. 수술과 기록 사이에 5 일의 회복 기간을 두십시오. 녹음이 수행 될 동일한 케이지에서 동물을 적응시키고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수있게하십시오. 최소의 사람과의 접촉으로 조용한 환경에서 실험을 수행하십시오. 동물의 행동을 관찰하기 위해 원격 비디오 모니터링을 사용하는 것이 이상적입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
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