Summary
Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.
Abstract
Microinjection in vivo é a técnica de transferência do gene mais comumente usados para analisar as funções do gene em mosquitos individuais. No entanto, esse método requer uma mais tecnicamente exigente operação e envolve procedimentos complicados, especialmente quando usado em larvas devido ao seu pequeno tamanho, cutícula relativamente fina e frágil e alta mortalidade, que limitam a sua aplicação. Em contraste, vetores virais para a entrega do gene foram desenvolvidos para superar barreiras extracelulares e intracelulares. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, gene alta eficiência de transdução, manutenção a longo prazo da expressão do gene e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) são específicos de mosquito, pequenos vírus de DNA único-encalhado que podem efetivamente entregar estrangeiros ácidos nucleicos nas células de mosquito; no entanto, a substituição ou a inserção de genes estrangeiros para criar vírus recombinantes normalmente provoca uma perda de habilidades de embalagens e/ou replicação, que é uma barreira para o desenvolvimento destes vírus como vetores de entrega.
Neste documento, nós relatamos utilizando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. São descritos os procedimentos detalhados para a construção, a embalagem e a análise quantitativa dos vetores rAaeDV e para infecção larval.
Este estudo demonstra, pela primeira vez, a viabilidade de desenvolver um com defeito não recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressão sistema, desta forma fornecendo uma poderosa ferramenta de análise funcional de genes no mosquito e estabelecendo uma base para o aplicação de paratransgenesis viral para controlar doenças transmitidas por mosquitos. Demonstrámos que instar as larvas do Aedes albopictus 1st podem ser facilmente e eficazmente infectadas introduzindo o vírus para o corpo de água das larvas reprodução local e que o rAaeDVs desenvolvido poderia ser usado para overexpress ou derrubar o expressão de um gene alvo específico em larvas, fornecendo uma ferramenta de análise funcional de mosquito genes.
Introduction
Doenças transmitidas por mosquitos, como malária, febre do dengue, febre zika e febre amarela, são problemas de saúde pública internacional que continuam a ser responsáveis por uma fração significativa da carga global de doenças infecciosas1,2. Insecticidas convencionais, que têm sido utilizados em resposta a vetores, são um componente importante da estratégia de controle de mosquito integrado sustentável para a prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, tais estratégias provaram para ser relativamente ineficazes ou indesejáveis devido os impactos ambientais negativos associados, bem como a evolução da resistência no mosquito populações3,4. Por estas razões, há uma necessidade urgente de métodos alternativos de mosquito controle e o uso de métodos transgênicos para produzir mosquitos machos estéreis e o lançamento de mosquitos resistentes ao patógeno surgiram como promissoras novas estratégias de controle. Para desenvolver novo eficaz controlar métodos, tais como seguras e eficazes abordagens para na vivo entrega de gene, a análise abrangente da função do gene de mosquito é necessária.
Microinjeção direta de plasmídeo, dobro encalhado RNA (dsRNA) ou RNA de interferência pequeno (siRNA) é o mais comumente usado em vivo gene entrega método em mosquitos. Na verdade, a produção de variedades transgênicas de mosquitos ainda dependem de um processo de embrião microinjeção5,6,7. No entanto, microinjeção tem várias limitações. Em primeiro lugar, esta técnica é tecnicamente exigente e envolve procedimentos complicados. Em segundo lugar, a injeção faz com que um insulto físico para o embrião, larvas, pupas e adultos, que afecta directamente a viabilidade do organismo alvo. Em terceiro lugar, é difícil imobilizar as larvas de mosquito para microinjection porque a maioria vive em um habitat aquático e possuem uma característica que se contorcendo de movimento. Em quarto lugar, o tamanho de 1st-2nd ínstar larvas é 10 a 20 vezes menor do que a de 4th ínstar e larvas mais velhas e as cutículas da antiga são mais delicadas. Estas características tornam difícil de manipular 1st-2nd ínstar larvas em comparação com aqueles em estágios mais antigos. Combinados, esses fatores contribuem para uma taxa de sobrevivência de pós-injeção reduzida para larvas (cerca de 5%) em comparação com adultos8. Sistemas de entrega baseada em viral foram desenvolvidos para superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, transdução de alta eficiência, a longo prazo e robustos níveis de expressão e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Portanto, gene entrega sistemas utilizando lentivírus, retrovírus e adenovírus foram amplamente utilizado linhas de células inmammalian e espécie de modelo. O sistema de expressão viral de Sindbis tinha sido anteriormente usado para analisar a função do gene no mosquito adulto; Além das preocupações de segurança biológica, no entanto, a injeção é ainda um processo necessário para infecção viral9. Embora, a entrega oral por larvas de imersão na solução dsRNA tem sido relatada anteriormente como um método de entrega viável, é inadequada para o pequeno RNA função análise10. Então, métodos de efetiva entrega viral ainda devem ser desenvolvidos para os mosquitos.
Mosquito densoviruses (MDVs) fazem parte da subfamília Densovirinae de Parvoviridaee uma queda do género Brevidensovirus11. Virions MDV são não-envelopado e consistem de um genoma de DNA (ssDNA) single-stranded e um capsídeo icosaédrica (20 nm de diâmetro). O genoma viral é aproximadamente 4 kb em tamanho e é replicado dentro dos núcleos das células do hospedeiro. MDVs são relativamente estáveis no ambiente e mostram uma gama de hospedeiros estreitas com alta especificidade para os mosquitos. Estes vírus têm o potencial para se espalhar e persistir naturalmente em populações de mosquito e podem invadir quase todos os órgãos e tecidos desses insetos, incluindo o midgut, Malpighi túbulos, gordura corporal, massa muscular, neurônios e glândulas salivares12.
Genomas MDV intactas podem ser subcloned em vetores do plasmídeo para produzir clones infecciosos baseados no plasmídeo; Quando estes clones são entregues em células de mosquito, o genoma viral é extraído do vetor do plasmídeo, e partículas virais infecciosas são produzidas. Porque MDV tem um genoma pequeno ssDNA, clones infecciosos são facilmente construídos e o genoma viral pode ser facilmente manipulado11,13. Estas características fazem MDV um valioso agente para examinar a biologia do mosquito. No entanto, porque quase toda a sequência do genoma viral é essencial para proliferação viral, a criação de vírus recombinantes através da substituição ou inserção de genes estrangeiros provoca uma perda na capacidade de embalagens e/ou replicação viral, que cria um barreira para o desenvolvimento de MDVs como vetores de entrega do gene. Neste documento, nós relatamos usando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um rAaeDV não-defeituoso na vivo RNA entrega sistema que tem as vantagens da construção fácil do plasmídeo e a manutenção de um vírus funcional que pode produzir estável e de longo prazo expressão em células hospedeiras, sem a necessidade de vírus do tipo selvagem. Além disso, este método permite a fácil transdução de larvas.
Os protocolos para as etapas a seguir são descritos neste estudo: linha 1) projeto de rAaeDVs codificação uma gaveta intrônicas expressão pequeno-RNA, 2) produção de partículas de vírus recombinantes usando a célula de empacotamento C6/36, 3) análise quantitativa de célula livre rAaeDV genoma copiar números e 4) infecção do Ae. albopictus larvas por introdução directa de vírus para o corpo de água do habitat larval. Em geral, este trabalho demonstrou que RNAs pequeno específico genes-alvo podem ser overexpressed ou derrubados em larvas de mosquito, usando o sistema de entrega MDV desenvolvido.
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Protocol
todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê ético de Southern University Medical.
1. projetar um intrão Artificial
Nota: O intrão artificial utilizado neste trabalho é 65 bp em comprimento e a sequência é 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Coloque o Hpa eu restrição site em ambas as extremidades do intron artificial então esse Hpa eu digestão pode liberar o intrão de plasmídeos (consulte a Figura 1 A).
- Lugar os dois Xba eu sites de restrição do intron então aquele Xba eu digestão pode ser usado para inserir sequências de RNA de pequena expressão.
- Ordenar a síntese química de sequências de DNA completos do intrão artificial de um fabricante de DNA. O sintético DNA criado é de clonagem em um plasmídeo padrão pUC19.
Nota: Os componentes essenciais do intrão artificial incluem vários elementos de nucleotídeos de consenso, incluindo um 5 ' site de tala doador (DS) com a sequência GUAAGAGU, uma sequência conservada ponto de ramificação (BPS) com a sequência UACUAAC, uma poli-pirimidina tracto (PPT), com a sequência UCUUC(U) 10 e um 3 '-site de tala aceitador (AS) com a sequência de GAUAUCCUGCAG ( Figura 1 A). Dois Xba eu sites de restrição foram introduzidas entre o DS e BPS que pode ser usado para inserir sequências de RNA de pequena expressão. A capacidade de efetivamente emendar esta intrão artificial de células de mamíferos e mosquito foi previamente confirmados 14.
2. Projetando um Artificial intrônicas pequeno RNA expressão Cassette
Nota: para superexpressão ou nocaute de miRNA endógeno, as sequências que codificam miRNA precursor ou uma esponja de miRNA foram inseridas entre o DS e BPS. Para servir como um exemplo, um precursor endógeno de miRNA de Ae. albopictus aal-deixe-7 foi selecionado para construir vetores virais recombinantes para miRNA superexpressão e nocaute. Uma esponja let-7 foi projetada de acordo com os métodos anteriormente descritos, 15. Para derrubar os genes alvo em larvas, nós projetamos miRNA artificial específico (amiRNA) ou sequências de RNA (shRNA) gancho de cabelo curto usando software online 16 ,, 17; para servir como um exemplo, a subunidade V-ATPase um mRNA (não de adesão. AY864912) foi selecionado como um gene alvo neste estudo. O amiRNA será referido como amiVTP agora em diante. Todos os detalhes de sequências de pre-miRNA, esponja, amiRNA e shRNA são descritos no quadro suplementar 1.
- Ordenar a síntese química de sequências de cDNA completos do precursor miRNAs, miRNA esponjas e shRNA com Xba eu locais da limitação em ambas as extremidades de um fabricante de DNA.
- Depois de receber o DNA ordenado, rotação dos tubos contendo blocos de DNA em 10.000-14.000 x g por 1 min garantir que tudo seco DNA é na parte inferior do tubo.
- Resuspenda o DNA secado em água livre de DNase para atingir uma concentração final de 10 ng / µ l.
- Digerir a espinha dorsal do plasmídeo e DNA sequências com Xba eu a 37 ° C, durante 1 h e em seguida dephosphorylate a 5 ' extremidades da coluna vertebral do plasmídeo linear com bezerro intestinal fosfatase alcalina (CIAP) de acordo com o fabricante ' protocolo s .
- Inativar CIAP por aquecimento durante 60 minutos a 65 ° C.
- Executar um gel de agarose 1,0% e cortar a espinha dorsal linear. Em seguida, extrair o DNA da fatia gel usando um kit de extração de gel após o fabricante ' instruções de s.
- Ligam o fragmento de DNA para o backboneby T4 DNA ligase (5 U / µ l) a 22 ° C, durante 1 h.
- Transformar os produtos da reação da ligadura de células passo 2.7 em competentes de Escherichia coli (e. coli) e placa em uma placa de ágar caldo lisogenia (LB) contendo ampicilina (em uma concentração de 100 µ g/mL).
- Executar a transformação através de um choque de calor método 18 e uso o apropriado Escherichia coli cepa. Por exemplo, usar a estirpe de e. coli DH5α para transformação de choque do calor.
- Escolher uma única colônia de passo 2.8 e incubá-los numa cultura de 3 mL enriquecido média contendo ampicilina (em uma concentração de 100 µ g/mL).
- Extrair o ADN do plasmídeo de cultura bacteriana, usando um kit de mini-preparação seguindo o fabricante ' instruções s. Enviar a amostra para uma empresa de sequenciamento de DNA.
Nota: Para superexpressão ou nocaute de miRNA endógeno, as sequências de codificação miRNA precursor ou uma esponja de miRNA foram inseridas entre os dois Xba eu sites. Todas as construções de expressão ou esponja miRNA devem ser menores do que 400 bp (10% do comprimento do genoma viral), devido ao limite de empacotamento dos vírus 19.
3. Gerando um rAeaDV construção clonando uma miRNA ou shRNA Cassette de expressão em um Backbone de plasmídeo
Nota: pUCA, um clone infeccioso consistindo de um plasmídeo pUCA contendo o genoma de AaeDV (3.981 nt) 19, foi gentilmente cedido pelo Prof Jonathan Carlson e tem sido descrita anteriormente em detalhe 11. p7NS1-DsRed expressa uma proteína não-estruturais 1 (NS1)-proteína de fusão da proteína fluorescente vermelha (DsRed) o promotor p7 e tem sido descrito em detalhe em outro lugar 14. Um precursor de humanos específicos miR-941-1 20 e sua esponja, um shRNA mexido (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), também subcloned AaeDV como controlo negativo.
- Ligate a pre-miRNA, esponja, shRNA ou uma gaveta de expressão amiVTP para o Hpa eu site da região AaeDV NS1-codificação na espinha dorsal do plasmídeo pUCA conforme descrito na etapa de protocolo 2.4 para 2.7.
- Transformar o DNA em Stbl3 competentes de Escherichia coli células e selecione um clone positivo conforme descrito na etapa 2.8 a 2.10.
- Seguindo isso, extrair o plasmídeo rAaeDV de células bacterianas usando um kit de preparação maxi seguindo o fabricante ' instruções de s.
Nota: Células Stbl3 ou Stbl4 e. coli devem ser utilizadas para transformação de DNA rAaeDV para minimizar indesejada recombinação ITR. Uma preparação maxi deve ser usada para extrair o plasmídeo rAaeDV para obter uma grande quantidade de DNA (> 100 µ g). Antes de gerar o vírus, a integridade da sequência do plasmídeo rAaeDV sempre deve ser analisada por sequenciamento de DNA 21.
4. Transfecting células C6/36 com plasmídeos de rAaeDV
- cultura C6/36 células em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio de 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina em uma incubadora de 28 ° C.
- No dia 0, as células em dez frascos de cultura de 2 25 cm da placa 18-20 h antes do transfection dividindo 90-95% confluentes em uma diluição de 1:2.
Nota: Por dia 1, as células devem chegar a confluência de 90-95%. - No dia 1, transfect as células com a série de rAaeDV plasmídeos 22.
- Diluir 10 µ g/ml DNA 600 µ l de meio RPMI-1640 em um tubo de microcentrifugadora e misture delicadamente. Enquanto isso, preparar 600 µ l de meio RPMI-1640 e 25 µ l de reagente de transfeccao por transfecção.
- Incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, adicione 625 µ l da mistura reagente de Transfeccao de 1640 à mistura de DNA de plasmídeo-1640.
- Incubar esta mistura durante 20-30 min à RT Antes de transfeccao, lave as células duas vezes com 2 mL de meio RPMI-1640.
- Incubação após o RT (passo 4.3.3), adicione the1640-transfecção reagente DNA plasmídeo mistura no balão de cultura 25 cm 2 e incubar durante 6 h a 28 ° C.
- Em aproximadamente 6 h pós-do transfection, remover a mídia de transfeccao, lavar as células duas vezes com 5 mL de meio RPMI-1640 e em seguida, adicione o meio RPMI-1640 com 10% FBS.
Nota: rAaeDV mostra altas taxas de infecção (95%) em Ae. albopictus larvas; no entanto, em nossa experiência, em quase 50% de larvas infectadas, a infecção era restrita aos locais de infecção primária (por exemplo, células de cerdas e papila anal) sem divulgação 23. Portanto, se há uma necessidade de infectar as larvas em vários tecidos, um defeituoso vírus recombinante expressando a proteína fluorescente deve ser co-infectados para permitir a visualização dos locais de infecção. Por exemplo, para produzir defeituoso vírus recombinante expressando DsRed, p7NS1-DsRed deve ser co transfectada com um plasmídeo ajudante em células C6/36, de acordo com o procedimento descrito acima (a relação de concentração de cotransfection deve ser de 2:1).
5. Colheita rAaeDV Virions de Transfected C6/36 células
- colher as células 5 dias depois do transfection. Desalojar e suspender as células nos pratos por um conta-gotas de vidro de 5 mL, Pipetar para cima e para baixo com o meio de cultura. Transferir todas as suspensões celulares para tubos estéreis de 15 mL.
- Congelar a-80 ° C ou em um banho de gelo seco (etanol) por 30 min e depois descongelar em 37 ° C. Vortex para 1 min. repetir o procedimento de congelamento e descongelamento vezes 3.
- Centrifugar a amostra a 4.800 x g por 20 min em 4 °C.Collect o sobrenadante e descartar a pelota. Em seguida, passe o sobrenadante através de um filtro de seringa descartável 0,22 µm. Alíquota e loja o vírion final purificado estoques no -80 ° C.
Nota: Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
6. Quantificar rAaeDV
- preparar o DNA padrões. Linearizar todo rAaeDV plasmídeos com Hpa e purificar os produtos digeridos com um gel de extração kit 24.
- Construir a curva padrão quantitativa absoluta e medir do título do vírus de acordo com os métodos anteriormente descritos 25.
7. Transdução de mosquito
- lavagem 100 1 st ínstar Ae. albopictus as larvas três vezes usando água deionizada água e em seguida, transferir as larvas em um béquer contendo 95 mL de água desionizada. Adicionar 5 mL de rAaeDV ações (concentração final de 1,00 x 10 10 cópias/mL).
- Incubar por 24 h a 28 ° C, lavar as larvas três vezes usando água deionizada e depois transferir as larvas para as placas e alimentar regularmente.
- Monitorar o nível de expressão do gene alvo em larvas com qPCR ou Western blot (representante resultados são mostrados nas figuras 3 e 4).
Nota: O método de deteção do sinal de fluorescência pode ser usado para isolar as larvas infectadas, mais precisamente. Por exemplo, para detectar sinais fluorescentes de larvas infectadas com vírus recombinante expressando DsRed, as larvas podem ser colocadas em um slide de concavidade e observadas sob um microscópio de fluorescência invertido cada 8 h até pós-infecção 2 dias. Uma vez que as larvas fluorescentes são detectadas, eles devem ser separados em copos de plástico de teste individual para permitir a observação contínua subsequente. Larvas com vários tecidos infectados podem ser identificadas usando esse método.
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Representative Results
Estratégias para a construção de rAaeDV
Um vetor de rAaeDV com defeito foi gerado para expressar o gene DsRed em larvas do mosquito. O plasmídeo resultante continha uma gaveta de proteína NS1-DsRed fusão com a proteína VP eliminada (Figura 1A). rAaeDV plasmídeos contendo a expressão construções para miRNA, amiRNA, Plasmideo e miRNA esponja foram projetados (mostrado na Figura 1B). Por exemplo, um vetor de rAaeDV foi gerado para overexpress aal-deixe-7 em larvas do mosquito. O plasmídeo resultante continha uma gaveta de pre-aal-deixe-7 intrônicas no viral NS1 exon (Figura 1B). Um vetor de rAaeDV contendo uma gaveta de expressão intrônicas aal-deixe-7 esponja no exon NS1 viral foi gerado para derrubar aal-deixe-7 expressão em larvas de mosquito (Figura 1B e Figura 2B). Um vetor de shRNA de rAaeDV e um vetor de amiRNA de rAaeDV contendo intrônicas shRNA e fitas de expressão de pre-amiRNA, respectivamente, foram usados para derrubar V-ATPase mRNA em larvas de mosquito (Figura 2C).
Calcular a concentração de rAaeDV com base em uma curva padrão que geradas com a análise de regressão linear
O eixo y representa o valor de Log10 do padrão concentração molecular do DNA, e o eixo x indica o valor do CT. Os números de CT (eixo x) e Log10 (concentração) valores (eixo y) exibidos uma boa correlação (R2 = 0.9988) e conhecer a equação y = - 0,288 ponto x + 13.87 (Figura 3). Calcule a concentração de rAaeDV de amostras usando a equação linear (tabela 1). Usando o método descrito no protocolo (passo 6.2 e tabela 1), a elevada concentração de rAaeDV (4 mL, > 7.65 x 1010 partículas/mL) foram colhidas. Vírus recombinantes (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s e VrepUCA-shct) foram gerados pelo transfecting o correspondente infecção clones pUCA-7 pUCA-7s, pUCA-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct em células C6/36 (pontos 3, 4 e 5).
Determinação da eficiência de miRNA superexpressão e nocaute de vetores rAaeDV
No exemplo, 1 100st ínstar larvas foram tratadas com quantidades iguais (1,00 x 1010 partículas/mL) de rAaeDV, que contém a expressão let-7 intrônicas vector, o vector de expressão intrônicas esponja deixe-7, os humanos específicos vetor de expressão pre-miR-941-1 ou o vetor de expressão de miR-941-1 esponja adicionando o vírus para o corpo de água do habitat larval. Cinco dias após a infecção, a expressão de aal-deixe-7 foi determinada por qPCR (Figura 4, n = 3; Suplementar, tabela 2). Os níveis de deixe-7 que são exibidos como a média ± DP de três biológicos Replica em larvas, foram substancialmente aumentado ou diminuído pelo rAaeDV pre-let-7-expressando (overexpressed em 2.843,31 ± 80.72%, p < 0,0001, teste-t) e o rAaeDV deixe-7-esponja-expressando (ativador 74.78 ± 1,60%, p < 0,0001, teste-t), respectivamente.
Monitorar a eficiência de "knockdown" V-ATPase mRNA de vetores rAaeDV
Um total de 1 100st ínstar larvas foram tratadas com quantidades iguais (1,00 x 1010 partículas/mL) de rAaeDV de amiRNA-expressando intrônicas, rAaeDV intrônicas expressando de shRNA, humanos específicos pré-miR-941-1-expressando rAaeDV orscramble expressando de shRNA rAaeDV adicionando o vírus para o corpo de água do habitat larval. Cinco dias após a infecção, a expressão do mRNA de V-ATPase foi determinada por qPCR (Figura 5, n = 3; Suplementar, tabela 2). O nível de V-ATPase exibido como a média ± DP de três biológicos Replica em larvas foi substancialmente reduzido por rAaeDV amiRNA-expressando (ativador de 43,01% de ±6.37, p = 0.0011, teste-t) e rAaeDV expressando de shRNA intrônicas (ativador por ± 72.88 5,74%, p = 0.0001, teste t).
Figura 1 : Organização esquemática do plasmídeo recombinante de AaeDV. (A) os promotores virais pNS e pVP conduzir a expressão dos genes NS1/NS2 e genes de VP, respectivamente. No plasmídeo p7NS1-DsRed, o gene DsRed foi fundido ao gene NS1. (B) pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-941-1, pUCA-941-1s, pUCA-shct, pUCA-shVTP e amiVTP-pUCA contêm intrões artificiais, incluindo a esponja aal-deixe-7, 7-aal-deixe, tem-miR-941-1, tem-miR-941-1 esponja, mexido Plasmideo shRNA V-ATPase e artificial miRNA, respectivamente, que foram clonados para o Hpaeu site do gene NS1. O intrão artificial é mostrado flanked por um doador da tala (DS) e um site acceptor (AS) e contém um domínio ponto de ramificação (BrP), um trato de poli-pirimidina (PPT) e pre-miRNA. A esponja de miRNA ou sequência de miRNA artificial é inserida dentro do intron entre o site 5-tala e o BrP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Biogênese de microRNA intrônicas artificial (miRNA) e estratégia para a geração de miRNA esponjas e miRNAs artificiais. (A) miRNA intrônicas é co transcrito dentro de um precursor do RNA mensageiro (pre-mRNA) de NS1, que será conduzido pelo promotor pNS1 e clivada fora pre-mRNA por splicing de RNA. Embora os exões são ligados para formar um maduro RNA mensageiro (mRNA) para a síntese de proteína NS1, o intrão emendado com o pre-miRNA é subsequentemente transformado em miRNA maduro por Dicer. (B) estratégia para gerar as construções let-7 e anti-miR-941-1. Alinhamento de let-7 e anti-miR-941-1 sequências com aal-deixe-7 e tem-miR-941-1, respectivamente. Correspondência completa das regiões com as regiões de sequência e cauda de anti-miRNA semente é mostrado. Esponjas de ambos deixe-7 e miR-941-1 contêm três repetição antisentidas construções (cartas vermelhas) que podem ligar a aal-deixe-7 e tem-miR-941-1, respectivamente. (C) sequências e estruturas precursor previsto para os miRNAs artificiais baseada em miRNA e shRNA utilizado neste estudo. Os miRNAs artificiais maduros e shRNA são mostrados em vermelho, e suas sequências de mRNA alvo relacionados estão em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Curva padrão para a titulação de rAaeDV e a conce calculadontrations de MDVs. (A) em tempo real qPCR foi realizada com um padrão de pUCA que foi diluída pela taxa de 10 vezes a ampliação e o valor de CT foi medido em um ABI 7500 como x. Número de cópia foi calculado conforme item 6.2 e 6.3, com a seguinte fórmula: copiar número (y) =-0.288x + 10.87; R2 = 0.9988. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Recombinante mediada por MDV aal-deixe-7 superexpressão e nocaute em Ae. albopictus larvas. (A) análise de expressão endógena miRNA em larvas após infecção com vírus recombinante contendo a gaveta de aal-deixe-7 expressão (painel esquerdo). (B) a eficiência do anti-let-7 construto foi determinado em larvas (painel direito). O tem-miR-941-1 e tem-941-1 esponja (controle negativo) overexpressed e ativador os maduros miRNAs deixe-7, respectivamente, em comparação com os níveis basais observados no grupo controle. abundância de miRNA foi normalizada para o rRNA 5S, e os dados são exibidos como a média ± DP de três biológicos Replica. T-testes foram realizados em diferentes níveis de significância. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre as larvas infectadas e correspondentes mock-tratada (quatro asteriscos, p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Análise da expressão de RNAm de V-ATPase após infecção com vírus recombinante contendo fitas de shRNA e amiRNA. abundância de mRNA foi normalizada para aalrpS7. Barras de erro representam o desvio padrão dos valores de 2−ΔΔCT para a expressão de RNAm de V-ATPase em Ae. albopictus larvas conforme avaliado por RT-PCR em tempo real (* *, p < 0,01; * * *, p < 0.001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: A recombinação MDV C T o valor determinado por qPCR corresponde a x valor na fórmula, que é usada para calcular o y valor. O número de cópia do genoma viral em cada 1 µ l da amostra foi obtido pelo poder função (10, y), que em última análise, foi multiplicado por 40, convertendo o valor para a concentração de vírus de suspensão de vírus.
Suplementar tabela 1: Sequências de miRNA precursor.
Suplementar tabela 2: dados de qPCR.
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Discussion
É importante superar dois das principais barreiras que limitam a construção rAaeDV. O primeiro é a produção de vírus recombinantes com defeito. Tem sido relatado que o MDV pode ser usado como um vetor para expressar apropriadamente dimensionada genes estrangeiros, tais como neurotoxins20 de inseto específico de escorpião e a proteína GFP; no entanto, independentemente da estratégia de construção, uma vez que as ORFs do MDV são inserido ou substituído com genes exógenos, virions não podem formar independentemente a menos que um plasmídeo ajudante é cotransfected para fornecer as proteínas virais indispensáveis falta. O vírus defeituoso é incapaz de se envolver em transmissão secundária, que ocorre na vivo em mosquitos com genomas com defeito. Nossos resultados validam uma estratégia de expressão intrônicas que oferece um novo paradigma que pode superar as limitações do MDVs com genomas com defeito para permitir a entrega eficiente de genes estrangeiros em mosquitos.
O segundo é o limite de comprimento exigentes do genoma viral recombinante imposto pelo tamanho do capsídeo viral. Para o empacotamento eficiente, o tamanho do genoma não pode exceder 4.400 nucleotídeos (110% do comprimento do genoma MDVs wt). Uma gaveta de expressão miRNA intrônicas (incluindo miRNA expressão cassette e artificial intrão) de não mais de 400 nt pode ser introduzida no genoma da AaeDV. Embora o comprimento do genoma do vírus recombinante é ainda adequado para embalagem, este sistema de entrega tem espaço para melhorias. Devido à limitação no tamanho do genoma, é difícil expressos genes sem estratégias de expressão intrônicas defeituoso.
É essencial para garantir que as células C6/36 são saudáveis para permitir a transfeccao bem-sucedidos e embalagem de rAaeDV. No entanto, os lipossomas catiônicos os reagentes aqui e inseto comercial reagentes específicos transfecção de células, não melhoram a eficiência da transfecção de células C6/36 (40-60%). Portanto, colher os vírus recombinantes alta-título, é necessário manter as células por 5 dias depois do transfection com base em características de crescimento descrito anteriormente14. Além disso, para infecção larval bem sucedida, é essencial para as larvas estar em contacto com partículas de vírus infecciosos por 24–36h para garantir alta infecção rácios23.
Em conclusão, a estratégia de expressão intrônicas descrita aqui é o primeiro a ultrapassar as barreiras impostas pela geração de MDV defeituoso. Esta estratégia permite a produção de não-defeituoso recombinante MDVs que pode overexpress ou downregulate genes miRNAs e alvo em mosquitos. Esta técnica fornece uma ferramenta de análise funcional de genes de mosquitos sem o uso de procedimentos de microinjeção de larvas complicada e tem aplicações comerciais claras. Mais estudos irão expandir a aplicação da estratégia de expressão descrito para investigar a biologia do mosquito e paratransgenesis para controle de vírus da dengue.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio financeiro da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1200500 de Chen Xiao Guang), Nacional Natural Science Foundation da China (81672054 e 81371846), a equipe de investigação do Natural Fundação de ciência de Guangdong (2014A030312016) e o programa científico e tecnológico de Guangzhou (201508020263). Reconhecemos com gratidão Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) para gentilmente fornecendo os plasmideos pUCA e p7NS1-GFP e ler criticamente este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
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