Summary
Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.
Abstract
Vivo mikroenjeksiyon bireysel sivrisinekler gen işlevlerinde analiz etmek için en sık kullanılan gen transferi tekniği var. Ancak, bu yöntem teknik olarak işlem talep daha fazla gerektirir ve karmaşık prosedürler, özellikle onların küçük büyüklük, nispeten ince ve kırılgan manikür ve yüksek mortalite, uygulama sınırı nedeniyle larva kullanıldığında içerir. Buna ek olarak, viral vektörler gen teslim için hücre içi ve hücre dışı engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Bu sistemlerin avantajları kolayca idare, yüksek gen iletim verimlilik, uzun vadeli bakım gen ekspresyonu ve kalıcı etkileri in vivoüretmek için yeteneği var. Sivrisinek densoviruses (MDVs) yabancı nükleik asitler sivrisinek hücrelere etkin bir şekilde sunabilir, sivrisinek özel, küçük tek iplikçikli DNA virüsler vardır; Ancak, değiştirme veya ekleme rekombinant virüsler genellikle oluşturmak için yabancı genlerin bu virüsler geliştirme olarak teslim vektörel çizimler için bir engel olan ambalaj ve/veya çoğaltma yeteneklerini kaybolmasına neden olur.
Burada, bir kusurlu rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için bir yapay intronic küçük-RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve kantitatif analiz rAaeDV vektörlerin ve larva enfeksiyon için ayrıntılı yordamlar açıklanmıştır.
Bu çalışmada gösterilmiştir, ilk kez, bir kusurlu rekombinant MDV Mikro RNA (miRNA) ifade sistem, geliştirmek ve böylece sivrisinek genlerin fonksiyonel analiz için güçlü bir araç sağlayarak ve için bir temel kurulması fizibilite Sivrisinek kaynaklı hastalıklar kontrol etmek için viral paratransgenesis uygulanması. Biz Aedes albopictus 1st INSTAR larva kolay ve etkili virüs sitesi ıslahı larva su vücuda getirerek enfekte olabilir ki ve gelişmiş rAaeDVs overexpress veya yıkmak için kullanılan olabilir gösterdi larvalar, genler sivrisinek fonksiyonel analiz için bir araç sağlayan bir belirli hedef geni ifadesidir.
Introduction
Sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıklar gibi sıtma, Dang Humması, zika ateş ve sarı humma, küresel bulaşıcı hastalık yükü1,2önemli bir kısmı için hesap devam başlıca uluslararası halk sağlığı sorunları vardır. Yanıt vektörel çizimler olarak kullanılmıştır, geleneksel böcek sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıkların önlenmesi için sürdürülebilir entegre sivrisinek denetimi stratejisi önemli bir bileşeni vardır. Ancak, bu stratejileri nispeten etkisiz veya ilişkili olumsuz çevresel etkilerin yanı sıra sivrisinek nüfus3,4direnç gelişimi nedeniyle istenmeyen olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, denetim ve steril erkek sivrisinekler üretmek için transgenik yöntemleri sivrisinek alternatif yöntemler için acil bir ihtiyaç olduğunu ve patojen dayanıklı sivrisinekler sürümü umut verici yeni kontrol stratejileri ortaya çıktığı. Geliştirmek için etkili yeni kontrol yöntemleri, gibi güvenli ve etkili yaklaşımlar içinde vivo gen teslim, sivrisinek gen işlevi kapsamlı analiz için gerekli.
Plazmid DNA, çift doğrudan mikroenjeksiyon RNA (dsRNA) telli veya küçük müdahale RNA (siRNA) en sık kullanılan vivo içinde gen teslim sivrisinekler yöntemidir. Aslında, sivrisinekler transgenik suşları üretimi hala embriyo mikroenjeksiyon5,6,7göreve güvenmek. Ancak, mikroenjeksiyon bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu teknik teknik olarak talep ediyor ve karmaşık prosedürler içerir. İkinci olarak, enjeksiyon embriyo, larva, Pupa ve yetişkin, hedef organizmanın canlılığı doğrudan etkileyen fiziksel bir hakaret neden olur. Üçüncü olarak, çünkü çoğu bir su ortamında yaşıyor ve hareket kıvranma karakteristik sahip sivrisinek larva mikroenjeksiyon için immobilize etmek zordur. Dördüncü olarak, 1st-2nd INSTAR larva boyutunu daha küçük 4th bundan daha hassas biçim ve büyük larva ve cuticles eski 10 - için 20 - kat. Bu özellikler 1st-2nd INSTAR larva bu büyük aşamaları ile karşılaştırıldığında işlemek zorlaştırır. Birlikte, bu faktörlerin bir düşük sonrası enjeksiyon sağkalım oranı yetişkin8' e göre larva (yaklaşık % 5) için katkıda bulunur. Viral tabanlı dağıtım sistemleri ilgili ekstraselüler ve hücre içi önündeki engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Bu sistemlerin avantajları kolayca idare, yüksek iletim verimliliği, uzun vadeli ve sağlam düzeyleri ifade ve kalıcı etkileri in vivoüretmek için yeteneği var. Bu nedenle, gen teslim Retrovirüsler, lentiviruses ve adenovirüse bakın sistemleri yaygın olmuştur inmammalian hücre satırları ve modeli tür kullanılır. Sindbis viral ifade sistem daha önce yetişkin sivrisinek gen işlevinde analiz etmek için kullanılmıştı; Biyogüvenlik endişeleri yanı sıra, ancak, enjeksiyon hala viral enfeksiyon9için gerekli bir süreç olduğunu. Her ne kadar larva dsRNA çözümünde iliklerine tarafından sözlü teslim daha önce uygun Teslimat yöntemi olarak bildirilmiştir, küçük RNA işlev analiz10için uygun değildir. Yani, etkili viral teslim yöntemleri hala sivrisinekler için geliştirilmelidir.
Sivrisinek densoviruses (MDVs) Densovirinae alt Parvoviridaeve biri dışında tüm sonbahar Brevidensovirus11cins içinde yer almaktadır. MDV virions sigara saran ve tek iplikçikli DNA (ssDNA) genom ve icosahedral bir kapsid oluşur (20 nm çapında). Viral genom yaklaşık 4 KB içinde büyüklük ve konak hücre çekirdeği içinde çoğaltılır. MDVs ortamında nispeten istikrarlı ve sivrisinekler için yüksek özgüllük ile dar ana bilgisayar aralığını gösterir. Bu virüs yaymak ve doğal olarak sivrisinek nüfus devam potansiyeline sahip ve hemen hemen tüm organ ve dokulara midgut, Malpighi tübüllerin, yağ vücut, kas, sinir hücreleri ve tükürük bezleri12de dahil olmak üzere bu böceklerin istila edebilir.
Sağlam MDV genleri plazmid vektörel çizimler bulaşıcı klonlar plazmid tabanlı üretmek için subcloned; Bu klonlar sivrisinek hücrelere teslim edildiğinde, viral genom plazmid öğesinden elde edilir ve bulaşıcı viral parçacıkların üretilmektedir. MDV küçük ssDNA genom olduğundan, bulaşıcı klonlar kolayca inşa edilir ve viral genom kolay elde edilebilir11,13olabilir. Bu özellikleri MDV sivrisinek Biyoloji incelenmesi için değerli bir ajan olun. Neredeyse tüm viral genom dizisinin viral yayılması için gerekli olduğundan, ancak, rekombinant virüs-den geçerek yedek oluşturma veya ekleme yabancı genlerin viral yeteneklerine, ambalaj ve/veya çoğaltma oluşturur kaybolmasına neden olur bir bariyer MDVs kalkınma olarak gen teslim vektörel çizimler. Burada, biz kolay plazmid inşaat avantajları ve üretebilir işlevsel bir virüs bakım olan bir arızalı olmayan rAaeDV vivo içinde RNA teslim sistemi geliştirmek için bir yapay intronic küçük-RNA ifade strateji kullanarak raporu konak hücreleri vahşi-tipi virüs gerek kalmadan istikrarlı ve uzun vadeli ifade. Ayrıca, bu yöntem larva kolay iletim için sağlar.
Bu çalışmada iletişim kuralları için aşağıdaki adımları açıklanmıştır: 1) rAaeDVs bir intronic küçük-RNA ifade kaset, 2) üretim rekombinant virüs partikülleri C6/36 ambalaj hücre kullanarak kodlama tasarımını satır, boş hücre, kantitatif analiz 3) rAaeDV genom kopya numaraları ve 4) Ae. albopictus larva tarafından virüs doğrudan giriş larva Habitat su vücuda bir enfeksiyon. Genel olarak, bu eser belirli küçük RNA'ların veya hedef genlerin olabilir overexpressed veya gelişmiş MDV dağıtım sistemini kullanarak sivrisinek larva içinde yere serdi olduğunu gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tüm iletişim kuralları Etik Komitesi, Southern Tıp Üniversitesi tarafından kabul edildi.
1. yapay bir Intron tasarımı
Not: Bu çalışmada kullanılan yapay intron 65 model uzunluğu ve sırası kan basıncı olan 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Hpa koyun ben kısıtlama site yapay intron her iki ucundaki Yani o Hpa ben sindirim intron plazmid (bkz: şekil 1 A) üzerinden yayın.
- Yer iki Xba ben kısıtlama siteleri içinde intron Yani o Xba ben sindirim küçük RNA ifade dizileri eklemek için kullanılır.
- Tam uzunlukta DNA dizileri yapay intron kimyasal sentez bir DNA üreticisinden sipariş. Sentetik bir standart pUC19 plazmid klonlama oluşturulan DNA'sı.
Not: Yapay intron temel bileşenleri bir 5 de dahil olmak üzere birkaç fikir birliği nükleotit öğe dahil ' sıra GUAAGAGU, UACUAAC, Poli-pirimidin sıra ile korunmuş şube-noktası sıra (BPS) ile donör splice site (DS) yolu (PPT) sıra UCUUC(U) 10 ve 3 ile '-alıcısı splice sitesi (AS) GAUAUCCUGCAG ( şekil 1 A) sırası ile. İki Xba ben kısıtlama siteleri DS ve küçük-RNA ifade dizileri eklemek için kullanılan bit/sn arasında tanıtıldı. Etkili bir şekilde bu yapay intron memeli ve Sivrisinek hücrelerden splice yeteneği daha önce teyit edilen 14 oldu.
2. Yapay bir Intronic küçük RNA ifade kaset tasarımı
Not: overexpression veya endojen miRNA nakavt için DS ve bit/sn arasında öncü miRNA veya miRNA sünger kodlama dizileri yerleştirildi. Bir örnek olarak hizmet için bir endojen habercisi miRNA Ae. albopictus aal-let-7 miRNA overexpression ve nakavt için rekombinant viral vektörel çizimler oluşturmak için seçildi. Bir let-7 sünger önceden açıklanan yöntemleri 15 göre dizayn edilmiştir. Knock Down larva genlerinde hedef için belirli yapay miRNA (amiRNA) ya da kısa saç tokası RNA (shRNA) dizileri online yazılım 16 , 17 kullanarak tasarlanmış; örnek olarak, V-ATPaz alt birim bir mRNA hizmet etmek (katılım yok. AY864912) Bu çalışmada bir hedef gen olarak seçilmiştir. AmiRNA amiVTP bundan sonra sevk edilecek. Pre-miRNA, sünger, amiRNA ve shRNA dizileri ayrıntılarıyla ek tablo 1 ' de açıklanan.
- Habercisi miRNAs, miRNA sünger ve shRNA Xba ile tam uzunlukta cDNA sıralarının kimyasal sentez sipariş ben kısıtlama siteleri bir DNA üreticisinden her iki ucundaki.
- 10.000-14.000 x DNA blokları içeren tüpleri sipariş edilen DNA, spin aldıktan sonra g tüm DNA kurutulmuş sağlamak 1 dk için tüp alt tarafındadır.
- 10 ng/µL son bir konsantrasyon ulaşmak için kurutulmuş DNA Dnaz ücretsiz su resuspend.
- Sindirmek plazmid omurga ve DNA dizileri Xba ile ben 1s için 37 ° C'de ve 5 dephosphorylate ' sona doğrusallaştırılmış plazmid omurga ile buzağı bağırsak alkalen fosfataz (CIAP) üreticiye göre ' s Protokolü .
- Isıtma için 60 dk 65 tarafından devre dışı CIAP ° C.
- %1,0 özel jel çalıştırmak ve doğrusallaştırılmış omurga kesti. Üretici takip bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak jel dilimden DNA ayıklamak ' s yönergeleri.
- Ligate 22 ° c için 1 h. backboneby T4 DNA ligaz (5 U/µL) içine DNA parçası
- Yetkili Escherichia coli (e.coli) içine adım 2.7 hücreleri ve plaka (100 µg/mL konsantrasyon) Ampisilin içeren bir Lysogeny suyu (LB) agar tabakta ligasyonu tepkiden ürünlerin dönüştürmek.
- Gerçekleştir dönüşüm yoluyla ısı şok yöntemi 18 ve kullanımı uygun e.coli suşu. Örneğin, E. coli zorlanma DH5α ısı şok dönüşümü için kullanın.
- Bir koloni kimden adım 2.8 ve 3 mL bir kültürde kuluçkaya çekme zenginleştirilmiş orta içeren Ampisilin (at 100 µg/mL konsantrasyonu).
- Ayıklamak plazmid DNA üretici takip bir mini hazırlık seti kullanarak bakteriyel kültüründen ' s yönergeleri. Örnek bir DNA sıralama şirkete göndermek.
Not: overexpression veya endojen miRNA nakavt için habercisi miRNA veya miRNA sünger kodlama dizileri ikisi arasında yerleştirildi Xba ben siteleri. Tüm miRNA ifade veya sünger yapıları 400 kısa olmalıdır bp (viral genom uzunluğu % 10) virüs 19 ambalaj sınırı nedeniyle.
3. MiRNA veya shRNA ifade kaset bir plazmid omurga klonlama tarafından bir rAeaDV yapı oluşturma
Not: çekim, bulaşıcı bir klon AaeDV genom içeren bir çekim plazmid oluşan (3,981 nt) 19, Lütfen Prof. Jonathan Carlson tarafından sağlandı ve ayrıntı 11 ' önceden tanımlanmıştır. p7NS1-DsRed ifade eder bir yapısal olmayan protein 1 (NS1)-kırmızı floresan protein (DsRed) füzyon protein p7 organizatörü ve oldu 14 başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bir insan özel miR-941-1 habercisi 20 ve onun sünger, şifreli shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), ayrıca bir negatif kontrol olarak AaeDV içine subcloned.
- Pre-miRNA, sünger, shRNA veya bir amiVTP ifade kaset ı site Hpa ligate 2,4-2,7 iletişim kuralı adımda anlatıldığı gibi çekim plazmid omurgasında AaeDV NS1 kodlama bölgesinin.
- Yetkili E. coli hücreleri ve olumlu bir klon 2.8-2,10 adımda açıklandığı gibi seçin Stbl3 DNA dönüştürün.
- Üretici takip maxi hazırlık seti kullanarak bakteri hücreleri hulâsa rAaeDV plazmid, takip ' s yönergeleri.
Not: Stbl3 veya Stbl4 E. coli hücre istenmeyen ITR rekombinasyon en aza indirmek için rAaeDV DNA dönüşümü için kullanılması. Maxi hazırlık rAaeDV plazmid DNA büyük miktarda elde etmek için ayıklamak için kullanılmalıdır (> 100 µg). Virüs oluşturmadan önce rAaeDV Plazmid dizi bütünlüğünü her zaman DNA sıralama 21 tarafından analiz edilmelidir.
4. Transfecting C6/36 hücreleri rAaeDV Plasmid'ler ile
- kültür C6/36% 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin 28 ° C kuluçka içeren 1640 orta Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) hücreleri.
- 0 günde on 25 cm 2 kültür şişeler hücrelerde plaka 18-20 h 90-%95 1:2 seyreltme Konfluent hücreleri bölme tarafından transfection önce.
Not: gün 1, % 90-95 izdiham hücreleri ulaştırılması gerekmektedir. - 1 günde rAaeDV plazmid 22 dizi hücrelerle transfect.
- 10 µg DNA RPMI-1640 orta microcentrifuge tüp içinde 600 µL sulandırmak ve karışımı yavaşça. Bu arada, RPMI-1640 orta 600 µL ve transfection reaktif transfection başına 25 µL hazırlayın.
- Incubate (RT) oda sıcaklığında 5-10 dk için. O zaman, 1640-transfection reaktif karışımı 625 µL 1640-plazmid DNA karışıma ekleyin.
- 20-30 dk RT. az için bu karışımı kuluçkaya Transfection önce iki kere RPMI-1640 orta 2 mL içeren hücreleri yıkayın.
- Sonra RT kuluçka (Adım 4.3.3), 25 cm 2 kültür şişesi için the1640-transfection reaktif DNA plazmid karışımı ekleyin ve 28 6 h için kuluçkaya ° C.
- Yaklaşık 6 h sonrası transfection at, kaldırmak transfection medya, iki kez 5 mL RPMI-1640 orta de içeren hücreleri yıkayın ve % 10 ile RPMI-1640 orta ekleyin FBS.
Not: rAaeDV enfeksiyonu (% 95) yüksek oranda Ae. albopictus larva gösterir; ancak, bizim deneyim, yaklaşık % 50'virüslü larva, enfeksiyon birincil enfeksiyon sitelere (örneğin, anal papilla ve kıl hücreleri) sınırlı yayma 23. Bu nedenle, larva birden fazla dokularda bulaştırmak için bir ihtiyaç varsa, floresan protein ifade arızalı rekombinant virüs enfeksiyonu siteleri görselleştirme etkinleştirmek için ortak virüslü olmalıdır. Örneğin, DsRed ifade arızalı rekombinant virüs üretmek için p7NS1-DsRed ile yardımcı plazmid C6/36 hücrelere göre yukarıda açıklanan yordamı co transfected olmalıdır (cotransfection konsantrasyon oranı-meli var olmak 2:1).
5. RAaeDV Virions Transfected C6/36 hücrelerden hasat
- hasat hücreleri 5 gün sonra transfection. Çıkarmak ve bulaşıkları tarafından yukarı ve aşağı ile Kültür orta pipetting bir 5 mL cam damlalık hücrelerde askıya alma. Tüm hücre süspansiyonlar steril 15 mL tüpler için transfer.
- -80 ° C'de veya kuru buz/etanol banyo için 30 dk içinde dondurmak ve 37, çözülme ° C. girdap 1 dk. 3 kere donma-çözülme yordamı yineleyin.
- Örneği 4800 x g 20 dk 4 °C.Collect süpernatant az için'santrifüj kapasitesi ve Pelet atın. Sonra süpernatant 0,22 µm tek kullanımlık şırınga filtreden geçirir. Aliquot ve mağaza son saf virion hisse senetleri-80 ° C.
Not: tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek.
6. RAaeDV miktarının
- hazırla DNA standartları. Tüm rAaeDV plazmid Hpa ile linearize ben ve bir jel ekstraksiyon kiti 24 sindirilir ürünleriyle arındırmak.
- Mutlak nicel standart eğri oluşturmak ve yukarıda açıklanan yöntemleri 25 göre virüs titresi ölçmek.
7. Sivrisinek iletim
- yıkama 100 1 st INSTAR Ae. albopictus larva üç kez deiyonize su kullanıp ardından larvalar 95 mL deiyonize su içeren bir kabı aktarın. RAaeDV hisse senetleri (10 10 kopya/mL x 1.00 son konsantrasyonu) 5 mL ekleyin.
- 24 28 ° C, s deiyonize su kullanarak kere larva üç yıkama ve larvalar tabakaları bana geri aktarmak için kuluçkaya ve düzenli olarak yem.
- Larvalar qPCR veya Western blot (temsilcisi-den sonuçlanmak göstermek rakamlar 3 ve 4) ile hedef gen ifadesinde düzeyini izlemek.
Not: Floresan sinyal algılama yöntemi daha doğrusu virüslü larva yalıtmak için kullanılabilir. Örneğin, DsRed ifade rekombinant virüs bulaşmış larva floresan sinyallerini algılamak için larva bir çukurluk slayt üzerinde yerleştirilen olabilir ve bir ters floresan mikroskop altında her 8 h 2 gün sonrası enfeksiyon kadar gözlenen. Kez floresan larva algılandı, sonraki sürekli gözlem için izin vermek için testin plastik bardak içine ayrılmalıdır. Larvaları ile birden fazla dokular enfekte bu yöntemi kullanarak belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAaeDV inşaat için stratejiler
Arızalı rAaeDV vektör sivrisinek larva DsRed gen ifade etmek için oluşturuldu. Elde edilen plazmid NS1-DsRed füzyon protein kaset VP protein (şekil 1A) silinmiş yer. miRNA için ifade yapıları içeren rAaeDV plazmid miRNA sünger, shRNA ve amiRNA ( şekil 1Bgösterildiği) tasarlanmıştır. Örneğin, bir rAaeDV vektör aal-let-7 sivrisinek larva'overexpress için oluşturuldu. Elde edilen plazmid viral NS1 exon (şekil 1B) bir intronic pre-aal-let-7 kasete içeriyordu. Bir intronic aal-let-7 sünger ifade kasete viral NS1 exon içeren bir rAaeDV vektör knock down aal-let-7 ifade sivrisinek larva (şekil 1B ve Şekil 2B) için üretildi. RAaeDV shRNA vektör ve intronic shRNA ve pre-amiRNA ifade kaset, içeren bir rAaeDV amiRNA vektör sırasıyla, knock down V-ATPaz mRNA sivrisinek larva (Şekil 2C) olarak kullanılmıştır.
Bu doğrusal regresyon analizi ile oluşturulan standart bir eğri dayalı rAaeDV titreleri hesaplama
Y ekseni standart DNA moleküler konsantrasyon Log10 değerini temsil eder ve x ekseni CT değeri gösterir. CT numaraları (x ekseni) ve Log10 (konsantrasyon) değerleri (y ekseni) görüntülenen iyi bir korelasyon (R2 0.9988 =) ve denklemi y = - 0.288 x + 13.87 (şekil 3). Doğrusal denklem (Tablo 1) kullanarak örnekleri rAaeDV titreleri hesaplayın. RAaeDV yüksek titreleri açıklanan protokol (Adım 6.2 ve Tablo 1), istimal belgili tanımlık yöntem (4 mL, > 7,65 x 1010 parçacıklar/mL) hasat edildi. Rekombinant virüsler (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1'ler ve VrepUCA-shct) karşılık gelen enfeksiyon klonlar çekim-7, çekim-7s, çekim-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s transfecting tarafından oluşturulan, Çekim-shct C6/36 hücrelere (Bölüm 3, 4 ve 5).
RAaeDV vektörel çizimler miRNA overexpression ve nakavt verimliliğini belirleme
Örneğin, 100 1st INSTAR larva eşit tutarlar (1010 parçacıklar/mL x 1.00) intronic ön let 7 ifade içeren rAaeDV ile tedavi edilen vektör, intronic izin-7 sünger ifade vektör insan özel Oluşturma öncesi miR-941 1 ifade vektör veya virüs larva habitat su vücut içine ekleyerek miR-941-1 sünger ifade vektör. Beş gün sonra enfeksiyon, aal-let-7 ifade qPCR tarafından tespit edilmiştir (şekil 4, n = 3; Ek tablo 2). Larvalar, üç biyolojik ortalama ± SD çoğaltır gibi görüntülenen let-7 düzeyi önemli ölçüde artırılması veya ön-let-7-ifade rAaeDV tarafından azaltılması (2,843.31 ± 80.72 oranında, p overexpressed < 0.0001, t-Testi) ve Let-7-sünger-ifade rAaeDV (downregulated 74.78 ± %1,60, p < 0.0001, t-Testi), anılan sıraya göre.
RAaeDV vektörel çizimler V-ATPaz mRNA devirme etkinliğini izlemek
Toplam 100st INSTAR larva eşit miktarda intronic amiRNA ifade rAaeDV, intronic shRNA ifade rAaeDV, insan özgü ön-miR-941-1-ifade rAaeDV ile (1010 parçacıklar/mL x 1.00) tedavi 1 orscramble virüs larva habitat su vücut içine ekleyerek shRNA ifade rAaeDV. Beş gün sonra enfeksiyon, V-ATPaz mRNA ifade qPCR tarafından tespit edildi (Resim 5, n = 3; Ek tablo 2). Üç biyolojik ortalama ± SD içinde larvalar çoğaltır olarak gösterilen V-ATPaz düzeyi önemli ölçüde amiRNA ifade rAaeDV tarafından düşürüldü (downregulated 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, t-Testi) ve intronic shRNA ifade rAaeDV (downregulated 72.88 ± tarafından %5,74, p = 0.0001, t-Testi).
Resim 1 : Rekombinant AaeDV plazmid şematik organizasyonu. (A)pNS ve pVP viral rehberleri NS1/NS2 genler ve VP genler, ifadesi sırasıyla sürücü. P7NS1-DsRed plazmid DsRed gen NS1 gene ile erimiş. (B) çekim-7, çekim-7s, çekim-941-1, çekim-941-1s, çekim shct, çekim-shVTP ve çekim-amiVTP içeren yapay intron aal-let-7, aal-let-7 sünger, vardır-miR-941-1, vardır-miR-941-1 sünger, şifreli shRNA, V-ATPaz shRNA de dahil olmak üzere ve yapay miRNA, sırasıyla, hangi ı site Hpaklonlanmış NS1 gen. Yapay intron flanked splice donör (DS) ve bir alıcısı sitesi (AS) tarafından gösterilir ve şube-noktası etki alanı (BrP), Poli-pirimidin yolu (PPT) ve pre-miRNA içerir. MiRNA sünger veya yapay miRNA sıra içinde 5-splice sitesi ve BrP. arasında intron eklenir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Biyogenez yapay intronic mikroRNA (miRNA) ve strateji miRNA sünger ve yapay miRNAs oluşturmak için. (A)Intronic miRNA işbirliği içinde bir habercisi pNS1 düzenleyici tarafından tahrik ve RNA'ın porno versiyonunu pre-mRNA dışarı i ciddi NS1, mesajcı RNA (pre-mRNA) kopya etmek. Her ne kadar ekzonlar NS1 protein sentezi için olgun bir mesajcı RNA (mRNA) forma bakmaksızın, pre-miRNA ile spliced intron olgun miRNA daha fazla Dicer tarafından işlenir. (B) strateji let-7 ve miR-941-1 yapıları oluşturmak için. Let-7 ve miR-941-1 aal-let-7 ve vardır-miR-941-1 ile sırasıyla diziler. Anti-miRNA sırası ve kuyruk bölgeleri ile tohum bölgelerin tam eşleme gösterilir. Let-7 ve miR-941-1 sünger aal-let-7 ve vardır-miR-941-1 için sırasıyla bağlayabileceğiniz üç tekrar antianlamlı yapıları (kırmızı harflerle) içerir. (C) dizileri ve tahmin edilen habercisi yapıları için yapay miRNAs miRNA tabanlı ve bu çalışmada kullanılan shRNA. Olgun yapay miRNAs ve shRNA kırmızı renkte gösterilir ve onların ilgili hedef mRNA mavi dizileridir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : RAaeDV titrasyon ve hesaplanan conce için standart eğriMDVs.(a)gerçek zamanlı qPCR ntrations standart 10 kat büyütme oranı tarafından düşürülmüştü bir çekim ile gerçekleştirilmiş ve CT değeri üzerinde bir ABI 7500 xolarak ölçüldü. Kopya numarası aşağıdaki formül ile adım 6.2 ve 6,3 göre hesaplanmıştır: kopya sayısı (y)-0.288 =x + 10,87; R2 0.9988 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Rekombinant MDV-aracılı aal-let-7 overexpression ve nakavt Ae. albopictus larva. içinde Aal-let-7 ifade kaset (sol panelde) içeren rekombinant virüsü ile enfeksiyon sonra larva endojen miRNA ifade analizi(a). (B) anti-7'let verimliliğini inşa larva (doğru kapı aynası) tespit edilmiştir. Overexpressed vardır-miR-941-1 ve vardır-941-1 sünger (negatif kontrol) ve downregulated olgun izin-7 miRNAs, sırasıyla, kontrol grubunda gözlenen bazal düzeyleri ile karşılaştırıldığında. miRNA bereket 5S rRNA için normalleştirilmiş ve üç biyolojik ortalama ± SD çoğaltır gibi verileri görüntülenir. Different düzeyleri ve önemi T-testleri yapıldı. Yıldız işaretlerini bulaşmış ve karşılık gelen sahte tedavi larva arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir (dört yıldız, p < 0.0001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : ShRNA ve amiRNA kasetleri içeren rekombinant virüsü ile enfeksiyon sonra V-ATPaz mRNA ifade analizi. mRNA bereket aalrpS7 için normalleştirilmiş. Hata çubukları temsil Ae. albopictus larva V-ATPaz mRNA ifade için 2−ΔΔCT değerleri standart sapması gerçek zamanlı RT-PCR tarafından değerlendirilen gibi (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Rekombinant MDV C T qPCR tarafından belirlenen değeri karşılık gelen için x değeri hesaplamak için kullanılan formül y değeri. Her 1 µL örnek viral genom kopyası sayısında virüs süspansiyon virüs konsantrasyon dönüştürme çarpıldıktan sonuçta 40 tarafından, işlev güç (10, y), tarafından elde edildi.
Ek tablo 1: Dizileri miRNA habercisi.
Ek tablo 2: qPCR veri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İki rAaeDV inşaat sınırlamak önemli engelleri aşmak önemlidir. İlk arızalı rekombinant virüs yapımıdır. Bu uygun bir şekilde ifade etmek için bir vektör Akrep böcek özgü neurotoxins20 ve GFP protein gibi yabancı genlerin boyutlu gibi MDV kullanılabilir bildirilmiştir; MDV ORFs eklenen veya değiştirilen eksojen genler ile bir kez yardımcı plazmid eksik vazgeçilmez viral proteinler sağlamak için cotransfected sürece ancak, inşaat strateji ne olursa olsun, virions bağımsız olarak oluşamıyor. Arızalı virüs içinde vivo sivrisinek arızalı genleri ile oluşur ikincil iletim meşgul değiştiremiyor. Sonuçlarımız MDVs kısıtlamaları yabancı genlerin verimli bir şekilde teslim sivrisinekler içine etkinleştirmek için arızalı genleri ile üstesinden gelebilir yeni bir paradigma sunar bir intronic ifade strateji doğrulayın.
Viral kapsid boyutu tarafından dayatılan rekombinant viral genom zorlu uzunluk sınırını ikincisidir. Verimli paketleme için genom büyüklüğündeki 4.400 nükleotit (wt MDVs genom süresinin % 110) fazla olamaz. 400'den fazla ve bir intronic miRNA ifade kaset (miRNA ifade kaset ve yapay intron dahil) nt AaeDV genom tanıttı. Rekombinant virüs genomu uzunluğu ambalaj için hala uygun olmasına rağmen bu dağıtım sistemi geliştirilmesi için bir oda vardır. Genom uzunluğunda sınırlama nedeniyle, hızlı genler arızalı intronic ifade stratejileri olmadan zor.
C6/36 hücreleri başarılı transfection ve rAaeDV ambalaj etkinleştirmek için sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidir. Ancak, burada kullanılan Katyonik lipozom reaktifler ve ticari böcek belirli transfection reaktifler hücre, hücre transfection (40-%60) C6/36 verimliliğini artırmak değil. Bu nedenle, yüksek-titresi rekombinant virüs hasat için yukarıda açıklanan büyüme özellikleri14tarihinde göre transfection sonra 5 gün boyunca hücreleri korumak gereklidir. Ayrıca, başarılı larva enfeksiyonları, larva bulaşıcı virüs parçacıkları için 24-yüksek enfeksiyon oranları23sağlamak için 36 h ile temas halinde olmak için gerekli olduğunu.
Sonuç olarak, burada açıklanan intronic ifade strateji arızalı MDV nesil tarafından dayatılan önündeki engelleri aşmak için ilkidir. Bu strateji arızalı rekombinant overexpress MDVs veya tümleyici miRNAs ve hedef sivrisinekler genlerinde üretimini sağlar. Bu teknik karmaşık larva mikroenjeksiyon yordamları kullanmadan sivrisinek genlerin fonksiyonel analiz için bir araç sağlar ve açık ticari uygulamalar vardır. Daha fazla çalışmaları açıklanan ifade strateji uygulanması sivrisinek Biyoloji ve paratransgenesis dang virüs denetimi için araştırmak için genişleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin mali desteği kabul için Xiao-Guang Chen (2016YFC1200500), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81672054 ve 81371846), araştırma ekibi programı doğal Guangdong (2014A030312016) temeli bilim ve bilimsel ve teknolojik programı Guangzhou (201508020263). Minnetle Profesör Jonathan Carlson (Colorado State University) lütfen çekim ve p7NS1-GFP plazmidleri sağlamak için ve eleştirel okuma bu el yazması için anıyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
- BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
- GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
