Summary
Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.
Abstract
Microinyección en vivo es la técnica de transferencia de genes más comúnmente utilizado para el análisis de las funciones del gene en los mosquitos. Sin embargo, este método requiere más técnicamente exigente operación y consiste en complicados procedimientos, especialmente cuando se utiliza en las larvas debido a su pequeño tamaño, relativamente delgada y frágil de la cutícula y alta mortalidad, que limitan su aplicación. Por el contrario, vectores virales para la entrega del gene se han desarrollado para superar las barreras extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción genética alta, mantenimiento a largo plazo de la expresión génica y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) son específicos de mosquito, pequeños virus de ADN de monocatenario que efectivamente pueden entregar extranjeros los ácidos nucleicos en células de mosquito; sin embargo, la sustitución o inserción de genes foráneos a crear virus recombinantes que típicamente causa una pérdida de capacidades de envases o replicación, que es un obstáculo para el desarrollo de estos virus como vectores de la entrega.
Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describen los procedimientos detallados para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV y para la infección de larvas.
Este estudio demuestra, por primera vez, la viabilidad del desarrollo de un no-defectuosa recombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema de la expresión, proporcionando una potente herramienta para el análisis funcional de genes en mosquito y establecer una base para la aplicación de paratransgenesis viral para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Hemos demostrado que larvas de Aedes albopictus 1st estadio podrían ser fácilmente y efectivamente infectadas mediante la introducción de virus en el cuerpo de agua del sitio de cría de larvas y que el rAaeDVs desarrollado podría utilizarse para sobreexpresar o derribar el expresión de un gen Diana en larvas, proporcionando una herramienta para el análisis funcional del mosquito de genes.
Introduction
Enfermedades transmitidas por mosquitos como la malaria, dengue, fiebre zika y fiebre amarilla, son problemas de salud pública internacional importante que siguen representan una fracción significativa de la carga global enfermedades infecciosas1,2. Los insecticidas convencionales, que han sido utilizados en respuesta a vectores, son un componente importante de la estrategia de control de mosquito integrado sostenible para la prevención de enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, tales estrategias han probado para ser relativamente ineficaz o indeseables debido a los impactos ambientales negativos asociados, así como la evolución de la resistencia en las poblaciones de mosquitos3,4. Por estas razones, hay una necesidad urgente de métodos alternativos de mosquito control y el uso de métodos transgénicos para producir mosquitos machos estériles y la liberación de mosquitos resistentes al patógeno han surgido como prometedoras nuevas estrategias de control. Para desarrollar nuevo control efectivo métodos, tales como seguros y efectivos enfoques en vivo entrega de gen, el análisis integral de funciones de los genes mosquito es necesario.
Microinyección directa de plásmido ADN, doble había trenzado RNA (dsRNA) o ARN interferente pequeño (siRNA) es el más comúnmente utilizado en vivo gene entrega en mosquitos. De hecho, la producción de variedades transgénicas de mosquitos todavía dependen de un proceso de embrión microinyección5,6,7. Sin embargo, microinyección tiene varias limitaciones. En primer lugar, esta técnica es técnicamente exigente y consiste en complicados procedimientos. En segundo lugar, la inyección causa una ofensa física a los embriones, larvas, pupas y adulto, que afecta directamente a la viabilidad del organismo diana. En tercer lugar, es difícil de inmovilizar las larvas de mosquito para microinyección porque la mayoría vive en un hábitat acuático y posee una característica moverse movimiento. En cuarto lugar, el tamaño de 1st-2 larvas desegundo estadio es 10 a 20 veces más pequeño que el de 4th instar y larvas más viejas y las cutículas de los primeros son más delicadas. Estas características hacen difícil manipular 1st-2 larvas desegundo estadio en comparación con aquellos en etapas mayores. Combinados, estos factores contribuyen a una tasa de supervivencia después de la inyección reducida para larvas (aproximadamente 5%) en comparación con adultos8. Sistemas de entrega basados en viral se han desarrollado para superar las barreras asociadas extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción alto, robustos y a largo plazo niveles de expresión y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Por lo tanto, gene sistemas utilizando adenovirus, retrovirus y lentivirus han sido ampliamente utiliza líneas celulares de inmammalian y especies modelo. El sistema de expresión virales Sindbis se había utilizado anteriormente para analizar la función del gene en el mosquito adulto; Además de las preocupaciones de seguridad de la biotecnología, sin embargo, la inyección es todavía un proceso necesario para la infección viral9. Aunque la administración oral sumergiendo las larvas en la solución de dsRNA se ha divulgado previamente como un método factible, es adecuado para pequeños RNA función análisis10. Por lo tanto, métodos de distribución viral eficaz todavía deben desarrollar para los mosquitos.
Mosquito densoviruses (MDVs) forman parte de la subfamilia Densovirinae de Parvoviridaey todo pero una caída dentro del género Brevidensovirus11. MDV viriones son no-envueltos y constan de un genoma de ADN (ssDNA) monocatenario y una cápside icosaédrica (20 nm de diámetro). El genoma viral es de aproximadamente 4 kb de tamaño y se replica dentro de los núcleos de las células del huésped. MDVs son relativamente estables en el medio ambiente y muestran una gama estrecha con alta especificidad para los mosquitos. Estos virus tienen el potencial de propagarse y naturalmente persisten en las poblaciones de mosquitos y pueden invadir casi todos los órganos y tejidos de estos insectos, incluyendo el midgut, túbulos de Malpighi, grasa corporal, musculatura, neuronas y glándulas salivales12.
Genomas MDV intactos pueden subcloned en vectores plásmidos para producir clones infecciosos basados en el plásmido; Cuando estos clones se entregan en células de mosquito, el genoma viral se extrae el vector plásmido, y se producen partículas virales infecciosas. Porque MDV tiene un genoma pequeño de ssDNA, clones infecciosos se construyen fácilmente y el genoma viral puede ser fácilmente manipulado11,13. Estas características hacen de MDV un agente valioso para examinar la biología del mosquito. Sin embargo, porque casi la totalidad de la secuencia del genoma viral es esencial para la proliferación viral, la creación de virus recombinantes a través de la sustitución o inserción de genes foráneos provoca una pérdida en la capacidad de envases o replicación viral, que crea un barrera para el desarrollo de MDVs como vectores entrega del gene. Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un rAaeDV de no-defectuosa en vivo RNA sistema de entrega que tiene las ventajas de la construcción del plásmido fácil y el mantenimiento de un virus funcional que puede producir expresión estable y a largo plazo en las células del huésped sin necesidad de virus de tipo salvaje. Además, este método permite la transducción fácil de larvas.
En este estudio se describen los protocolos para los siguientes pasos: 1) diseño de rAaeDVs un casete de expresión de ARN pequeño intronic, 2) producción de partículas de virus recombinantes usando la célula de embalaje C6/36 de la codificación de línea, 3) análisis cuantitativo de la libre rAaeDV genoma copiar números y 4) infección de larvas de Ae. albopictus por introducción directa del virus en el cuerpo de agua del hábitat larval. En general, este trabajo demostró que específico RNAs pequeños genes diana pueden ser overexpressed o derribados en larvas de mosquitos mediante el sistema de entrega MDV desarrollado.
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Protocol
todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de médica sur.
1. diseño de un intrón Artificial
Nota: el intrón artificial utilizado en este trabajo es 65 bp de longitud y la secuencia es de 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Lugar el Hpa restricción sitio en ambos extremos del intrón artificial así que Hpa digestión puede liberar del intrón de plásmidos (véase la figura 1 A).
- Lugar los dos Xba I sitios de restricción en el intrón así que Xba I digestión puede utilizarse para insertar secuencias de expresión de RNA de pequeño.
- Ordenar la síntesis química de secuencias de ADN integrales del intrón artificial de un fabricante de ADN. El sintético creado el ADN es de la clonación en un plasmidio pUC19 estándar.
Nota: Los componentes esenciales del intrón artificial incluyen varios elementos de nucleótido de consenso, incluyendo un 5 ' sitio del empalme del donante (DS) con la secuencia GUAAGAGU, una secuencia conservada-punto de bifurcación (BPS) con la secuencia UACUAAC, un poli-pirimidina tracto (PPT) con la secuencia UCUUC(U) 10 y 3 '-sitio del empalme del aceptador (AS) con la secuencia GAUAUCCUGCAG ( figura 1 A). Dos Xba I sitios de restricción fueron introducidos entre el DS y el BPS que puede utilizarse para insertar secuencias de expresión de RNA de pequeño. La capacidad de empalme con eficacia este intrón artificial de las células de mamíferos y mosquitos ha sido previamente confirmada 14.
2. Diseño de un Artificial pequeño Intronic ARN expresión casete
Nota: para la sobreexpresión o caída de los miRNA endógeno, secuencias de codificación de miRNA precursor o una esponja de miRNA fueron insertadas entre el DS y el BPS. Para servir como un ejemplo, un precursor endógeno miRNA de Ae. albopictus aal-let-7 fue seleccionado para construir vectores virales recombinantes para la sobreexpresión de miRNA y caída. Una esponja anti-realquilar-7 fue diseñada según los métodos descritos previamente 15. Para derribar genes diana en larvas, diseñamos miRNA artificial específico (amiRNA) o secuencias de ARN (shRNA) horquilla corto utilizando software en línea 16 , 17; para servir como un ejemplo, subunidad de la V-ATPasa un mRNA (no la adhesión. AY864912) fue seleccionado como un gene de la blanco en este estudio. El amiRNA se hará referencia a como amiVTP de ahora en adelante. Todos los detalles de secuencias del pre-miRNA, esponja, amiRNA y shRNA se describen en la tabla adicional 1.
- Ordenar la síntesis química de secuencias de cDNA de longitud completa del precursor miRNAs, miRNA esponjas y shRNA con Xba I sitios de restricción en ambos extremos de un fabricante DNA.
- Después de recibir el ADN ordenado, hacer girar los tubos que contienen bloques de ADN a 10.000-14.000 x g durante 1 min para asegurarse de que todos secado ADN es en la parte inferior del tubo de.
- Resuspender el ADN seco en agua libre de DNAsas para lograr una concentración final de 10 ng/μl.
- Digerir la columna vertebral del plásmido y DNA secuencias con Xba I a 37 ° C durante 1 hora y luego dephosphorylate el 5 ' extremos de la columna vertebral del plásmido linearizado con fosfatasa alcalina intestinal becerro (CIAP) según el fabricante ' protocolo de s .
- CIAP inactivar por calentamiento durante 60 min a 65 ° C.
- Correr un gel de agarosa al 1.0% y la columna vertebral lineal de corte. Luego extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit de extracción de gel siguiendo el fabricante ' instrucciones s.
- Ligan el fragmento de ADN en el backboneby T4 ADN ligasa (5 U/μL) a 22 ° C por 1 h.
- Transformar los productos de la reacción de la ligadura de las células de paso 2.7 en competentes de Escherichia coli (e. coli) y la placa en una placa de agar caldo de lisogenia (LB) que contiene ampicilina (a una concentración de 100 μg/mL).
- Realizar la transformación a través de un choque de calor método 18 y uso el apropiado e. coli cepa. Por ejemplo, utilizar la cepa de e. coli DH5α para transformación de choque de calor.
- Recoger una sola Colonia de paso 2.8 e incubar en una cultura de 3 mL enriquecido medio que contiene ampicilina (a una concentración de 100 μg/mL).
- Extraer el ADN del plásmido de la cultura bacteriana usando un kit de preparación para el mini tras el fabricante ' instrucciones. Enviar la muestra a una empresa de secuenciación de DNA.
Nota: Para la sobreexpresión o caída de los miRNA endógeno, las secuencias de codificación de miRNA precursor o una esponja de miRNA fueron insertadas entre los dos sitios de Xba. Todas construcciones de expresión o una esponja de miRNA deben ser menos de 400 bp (10% de la longitud del genoma viral) debido al límite de empaquetado del virus 19.
3. Generando un rAeaDV construir por clonación un miRNA o shRNA cassettes de expresión en la columna vertebral de un plásmido
Nota: pUCA, un clon infeccioso que consiste en un plásmido de pUCA que contiene el genoma de AaeDV (3.981 nt) 19, fue amablemente proporcionada por el Prof. Jonathan Carlson y se ha descrito previamente en detalle 11. p7NS1-DsRed expresa una proteína no estructural 1 (NS1)-proteína de fusión de la proteína fluorescente roja (DsRed) de la promotora de p7 y ha sido descrito en detalle en otra parte 14. Un precursor de miR-941-1 específicos humanos 20 y su esponja, un shRNA revuelto (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), también fueron subcloned en AaeDV como control negativo.
- Ligar el pre-miRNA, esponja, shRNA o un casete de expresión amiVTP en el Hpa sitio de la región AaeDV NS1-codificación en el espinazo de plásmido de pUCA como se describe en el paso de protocolo 2.4 a 2.7.
- Transformar el ADN de Stbl3 competentes de e. coli las células y selecciona un clon positivo tal como se describe en paso 2.8 a 2.10.
- Después de esto, extraiga el plásmido rAaeDV de las células bacterianas mediante un maxi kit preparación siguiendo el fabricante ' instrucciones s.
Nota: Las células Stbl3 o Stbl4 e. coli deben utilizarse para que la transformación de ADN rAaeDV minimizar la recombinación ITR no deseado. Una preparación para el maxi debe ser utilizado para extraer el plásmido rAaeDV para obtener una gran cantidad de ADN (> 100 μg). Antes de generar el virus, la integridad de la secuencia del plásmido rAaeDV siempre debe ser analizada por secuenciación de ADN 21.
4. Transfectar células C6/36 con rAaeDV plásmidos
- cultura C6/36 células en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio de 1640 con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina en un incubador de 28 ° C.
- En el día 0, las células en diez frascos de cultivo 25 cm 2 de placa 18-20 h antes de la transfección por división células confluentes de 90-95% en una dilución 1:2.
Nota: Día 1, las células deben llegar a confluencia de 90-95%. - El día 1, transfectar las células con la serie de plásmidos de rAaeDV 22.
- 10 μg ADN en 600 μl de Medio RPMI-1640 en un tubo de microcentrífuga de diluir y mezclar suavemente. Mientras tanto, preparar 600 μl de Medio RPMI-1640 y 25 μl de reactivo de transfección por transfección.
- Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente (RT). Luego, añadir 625 μl de la mezcla de reactivo de transfección de 1640 a la mezcla de ADN de plásmido de 1640.
- Incubar la mezcla por 20-30 min a TA. Antes de la transfección, se lavan las células dos veces con 2 mL de Medio RPMI-1640.
- Incubación después de la RT (paso 4.3.3), mezcla de plásmido de DNA de reactivo de the1640-transfección de añadir al matraz de cultivo 25 cm 2 e incubar por 6 h a 28 ° C.
- En aproximadamente 6 h después de la transfección, quitar la transfección, lavan las células dos veces con 5 mL de Medio RPMI-1640 y luego añadir el Medio RPMI-1640 con 10% FBS.
Nota: rAaeDV muestra altas tasas de infección (95%) en larvas de Ae. albopictus; sin embargo, en nuestra experiencia, en casi el 50% de larvas infectadas, la infección estaba restringida a los sitios de infección primaria (p. ej., las papilas anales y cerda células) sin difusión 23. Por lo tanto, si es necesario para infectar larvas en tejidos múltiples, un defectuoso virus recombinante que expresan la proteína fluorescente debe ser coinfectado para permitir la visualización de los sitios de infección. Por ejemplo, para producir el virus recombinante defectuoso expresan DsRed, p7NS1-DsRed debe co transfected con un plásmido helper en células C6/36 según el procedimiento descrito anteriormente (la tasa de concentración de cotransfection debe ser 2:1).
5. Cosecha rAaeDV viriones de Transfected las células C6/36
- cosechar las células 5 días después de la transfección. Desplazar y suspender las células en los platos por un gotero de vidrio de 5 mL, pipeteo arriba y abajo con el medio de cultivo. Todo suspensiones celulares de transferencia a tubos estériles de 15 mL.
- Congelar a-80 ° C o en un baño de hielo seco y etanol durante 30 min y luego descongelar a 37 ° C. Vortex durante 1 minuto Repita el procedimiento de congelación y descongelación 3 veces.
- Centrifugar la muestra a 4.800 x g por 20 min a 4 °C.Collect el sobrenadante y desechar el precipitado. A continuación, pasar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa desechable 0.22 μm. Alícuota y tienda el virión purificado final existencias a -80 ° C.
Nota: Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación.
6. Cuantificación de rAaeDV
- preparar la DNA normas. Alinear todos los plásmidos de rAaeDV con Hpa y purificar los productos digeridos con un gel de extracción kit 24.
- Construir la curva estándar cuantitativa absoluto y medir la concentración de virus según el método anteriormente descrito 25.
7. Transducción de mosquito
- larvas de Ae. albopictus lavado 100 1 st estadio tres veces usando desionizada del agua y a continuación, transferir las larvas en un vaso de precipitados conteniendo 95 mL de agua desionizada. Añadir 5 mL de las cepas rAaeDV (concentración final de 1.00 x 10 10 copias/mL).
- Incubar 24 h a 28 ° C, lavarse las larvas tres veces con agua desionizada y luego transferir las larvas a las placas y alimentar regularmente.
- Controlar el nivel de expresión del gen Diana en las larvas con qPCR o Western blot (representante de resultados se muestran en las figuras 3 y 4).
Nota: El método de detección de señal de fluorescencia se puede utilizar para aislar las larvas infectadas más precisamente. Por ejemplo, para detectar señales fluorescentes de larvas infectadas con el virus recombinante que expresan DsRed, las larvas pueden coloca en un portaobjetos de concavidad y observadas bajo un microscopio de fluorescencia invertido cada 8 h hasta 2 días post-infección. Una vez que se detectan larvas fluorescentes, deben estar separados en las tazas de la prueba individual de plástico para permitir la posterior observación continua. Larvas con múltiples tejidos infectados pueden ser identificadas usando este método.
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Representative Results
Estrategias para la construcción de rAaeDV
Un vector de rAaeDV defectuosa se generó para expresar el gen DsRed en larvas de mosquitos. El plásmido resultante contenía un cassette de la proteína NS1-DsRed fusión con la proteína VP eliminada (figura 1A). rAaeDV de plásmidos que contienen construcciones de expresión de miRNA, amiRNA, shRNA y miRNA esponja fueron diseñados (se muestra en la figura 1B). Por ejemplo, un vector rAaeDV se generó para sobreexpresar aal-let-7 en larvas de mosquitos. El plásmido resultante contenía un casete intronic de pre-aal-let-7 en el exón de NS1 viral (figura 1B). Un vector de rAaeDV que contiene un casete de expresión intronic esponja aal-let-7 en el exón NS1 viral se generó para derribar aal-let-7 expresión en larvas de mosquitos (figura 1B y 2 de la figuraB). Un rAaeDV shRNA vector y un rAaeDV amiRNA que contiene shRNA intronic y pre-amiRNA cassettes de expresión, respectivamente, se utilizaron para derribar el mRNA de la V-ATPasa en larvas de mosquitos (figura 2C).
Cálculo de los títulos de rAaeDV basados en una curva estándar que genera el análisis de regresión lineal
El eje y representa el valor Log10 del estándar concentración molecular del ADN, y el eje x indica el valor de CT. Los números de TC (eje x) y Log10 (concentración) valores (eje y) muestran una buena correlación (R2 = 0.9988) y resolver la ecuación y = - 0.288 x + 13.87 (figura 3). Calcular los títulos rAaeDV de las muestras utilizando la ecuación lineal (tabla 1). Utilizando el método descrito en el protocolo (paso 6.2 y cuadro 1), los títulos elevados de rAaeDV (4 mL, > 7.65 x 1010 partículas/mL) fueron cosechadas. Virus recombinantes (VrepUCA-7 VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s y VrepUCA-shct) fueron generados por transferencia la correspondiente infección clones pUCA-7 7s pUCA pUCA-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct en células C6/36 (secciones 3, 4 y 5).
Determinar la eficacia de la sobreexpresión y caída de miRNA de vectores rAaeDV
En el ejemplo 1 de 100 larvas de estadiost fueron tratadas con cantidades iguales (1.00 x 1010 partículas/mL) de rAaeDV que contiene la expresión de pre-realquilar-7 intronic vector, el vector de expresión intronic esponja de let-7, el específico de humanos vector de la expresión pre-miR-941-1 o el vector de la expresión de miR-941-1 esponja añadiendo el virus en el cuerpo de agua del hábitat larval. Cinco días después de la infección, la expresión de aal-let-7 se determinó mediante qPCR (figura 4, n = 3; Tabla 2 suplementaria). Los niveles de let-7 que se muestran como la media ± SD de biológico tres réplicas en las larvas, fueron substancialmente aumentarse o disminuirse de la rAaeDV pre-realquilar-7-expresión (overexpressed en 2.843,31 ± 80.72%, p < 0.0001, t-test) y la rAaeDV Let-7-esponja-expresar (o 74.78 ± 1.60%, p < 0.0001, t-test), respectivamente.
Monitoreo de la eficiencia de precipitación de mRNA de la V-ATPasa de vectores rAaeDV
Un total de 1 100 larvas de estadiost fueron tratadas con cantidades iguales (1.00 x 1010 partículas/mL) de rAaeDV expresando amiRNA intronic, intronic shRNA-expresión rAaeDV, rAaeDV pre-miR-941-1-expresión específica de humanos orscramble shRNA-expresión rAaeDV añadiendo el virus en el cuerpo de agua del hábitat larval. Cinco días después de la infección, se determinó la expresión del ARNm de la V-ATPasa por qPCR (figura 5, n = 3; Tabla 2 suplementaria). El nivel de la V-ATPasa muestran como la media ± SD de biológico tres réplicas en las larvas fue reducido substancialmente por rAaeDV expresar amiRNA (regulada por el 43,01% de ±6.37, p = 0.0011, t-test) y intronic shRNA-expresión rAaeDV (regulada por 72.88 ± 5,74%, p = 0.0001, t-test).
Figura 1 : Organización esquemática de la plásmidos recombinante de AaeDV. (A) los promotores virales pNS y pVP unidad la expresión de los genes de la VP y genes NS1/NS2 respectivamente. En el plásmido p7NS1-DsRed, el gen DsRed fue fusionado al gen NS1. PUCA-7 (B), pUCA-7s, pUCA pUCA-941-1, pUCA-941-1s-shct, pUCA-shVTP y pUCA-amiVTP contienen intrones artificiales, incluyendo la esponja aal-let-7, aal-let-7, ha-miR-941-1 ha-miR-941-1 esponja, shRNA revuelto, V-ATPasa shRNA y artificial miRNA, respectivamente, que fueron clonados en el Hpasitio del gen NS1. El intrón artificial se muestra flanked por un donante de empalme (DS) y un sitio del aceptador (AS) y contiene un dominio punto de rama (BrP), un tracto de poli-pirimidina (PPT) y pre-miRNA. La esponja de miRNA o secuencia artificial miRNA se inserta dentro del intrón entre el sitio 5-empalme y el BrP. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Biogénesis de artificial intronic microRNA (miRNA) y estrategia para la generación de miRNA esponjas y miRNAs artificial. (A) miRNA Intronic es co transcrito en un precursor de ARN mensajero (pre-mRNA) de NS1, que será conducido por el promotor del pNS1 y troceados de pre-mRNA por empalmar del RNA. Aunque los exones se unen para formar un ARN mensajero maduro (ARNm) para la síntesis de la proteína NS1, el intron empalmado con el pre-miRNA se procesa más lejos en miRNA maduro por Dicer. (B) estrategia para la generación de las construcciones anti-realquilar-7 y miR-941-1. Alineación de anti-realquilar-7 y miR-941-1 secuencias con aal-let-7 y ha-miR-941-1, respectivamente. Juego completo de las regiones de semilla con las regiones de la secuencia y la cola de anti-miRNA se muestra. Let-7 y miR-941-1 esponjas contienen tres construcciones antisentidas repetición (letras rojas) que se pueden unir a aal-let-7 y ha-miR-941-1, respectivamente. (C) las secuencias y estructuras precursor predicho para los miRNAs artificial basada en miRNA y shRNA utilizados en este estudio. Los miRNAs maduros de artificial y shRNA se muestran en rojo, y sus secuencias de mRNA objetivo relacionados están en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Curva estándar para valoración de rAaeDV y el conce calculadontrations MDVs. (A) en tiempo real qPCR se realizó con un estándar de pUCA que se diluyó por la relación de aumento de 10 veces, y el valor de CT se midió en un ABI 7500 x. Número de copia se calculó según el paso 6.2 y 6.3 con la siguiente fórmula: Copiar número (y) =-0.288x + 10,87; R2 = 0.9988. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Sobreexpresión recombinante mediada por MDV aal-let-7 y caída en larvas de Ae. albopictus . (A) análisis de expresión de miRNA endógeno en larvas después de la infección con el virus recombinante que contiene el cassette de expresión aal-let-7 (panel izquierdo). (B) la eficacia de los anti-realquilar-7 construcción determinó en larvas (panel derecho). La esponja ha-miR-941-1 y ha-941-1 (control negativo) overexpressed y dando los miRNAs maduros de let-7, respectivamente, en comparación con los niveles basales observados en el grupo de control. abundancia de miRNA se normalizó a 5S rRNA y los datos se muestran como la media ± SD de biológico tres repeticiones. Se realizaron pruebas de T a diferente niveles de significancia. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre las larvas infectadas y correspondientes tratados con mock (cuatro asteriscos, p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Análisis de la expresión del mRNA de la V-ATPasa después de la infección con virus recombinantes que contienen cintas de shRNA y amiRNA. abundancia del mRNA se normalizó a aalrpS7. Barras de error representan el desvío estándar de los 2 valores−ΔΔCT para la expresión del mRNA de la V-ATPasa en las larvas de Ae. albopictus evaluada por RT-PCR en tiempo real (**, p < 0.01; ***, p < 0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: La recombinante MDV C T el valor determinado por qPCR corresponde a la x valor en la fórmula, que se utiliza para calcular el y valor. El número de copias de genoma viral en cada muestra de 1 μl se obtuvo por la potencia de la función (10, y), que en última instancia se multiplicó por 40, convertir el valor a la concentración del virus de la suspensión de virus.
Suplemento tabla 1: Secuencias de miRNA precursor.
Suplemento tabla 2: datos de qPCR.
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Discussion
Es importante superar dos de las principales barreras que limitan la construcción de rAaeDV. La primera es la producción de virus recombinante defectuoso. Se ha reportado que MDV se puede utilizar como un vector para expresar apropiadamente genes extranjeros, como el escorpión insectos específicos neurotoxins20 y la proteína GFP; sin embargo, independientemente de la estrategia de construcción, una vez ORFs de MDV se inserta o se reemplazan con genes exógenos, los viriones no pueden formar independientemente a menos que un plásmido helper es cotransfected para suministrar las proteínas virales indispensables que falta. El virus defectuoso es incapaz de participar en la transmisión secundaria, que se presenta en vivo en los mosquitos con genomas defectuosos. Nuestros resultados validan una estrategia de expresión intronic que ofrece un nuevo paradigma que puede superar las limitaciones del MDVs con genomas defectuosos para permitir la entrega eficiente de genes foráneos en los mosquitos.
El segundo es el límite de longitud de exigentes del genoma viral recombinante impuesto por el tamaño de la cápside viral. Para el empaquetado eficiente, el tamaño del genoma no puede exceder 4.400 nucleótidos (110% de la longitud del genoma MDVs wt). Un casete de expresión de miRNA intronic (incluyendo casete de expresión de miRNA y artificial del intrón) de no más de 400 nt puede ser introducido en el genoma de la AaeDV. Aunque la longitud del genoma del virus recombinante es todavía conveniente para el empaquetado, este sistema de entrega tiene margen de mejora. Debido a la limitación en la longitud del genoma, es difícil expresados genes sin estrategias de expresión intronic defectuosa.
Es esencial para asegurar que las células C6/36 son saludables para la exitosa transfección y envasado de rAaeDV. Sin embargo, los reactivos de liposoma catiónico utilizados aquí e insecto comercial reactivos específicos de la transfección de la célula, no mejoran la eficiencia de la transfección de células C6/36 (40-60%). Por lo tanto, para cosechar alto-título virus recombinante, es necesario mantener las células 5 días después de la transfección basada en características de crecimiento descrita14. Además, para la infección de larvas exitoso, es esencial para larvas para estar en contacto con las partículas de virus infeccioso para 24–36 h para ratios de infección alta23.
En conclusión, la estrategia de expresión intronic descrita aquí es el primero en superar las barreras impuestas por la generación de MDV defectuoso. Esta estrategia permite la producción de no-defectuosa recombinante MDVs que puede sobreexpresar o genes miRNAs y destino regular a la baja en los mosquitos. Esta técnica proporciona una herramienta para el análisis funcional de genes del mosquito sin el uso de larvas complicados procedimientos de microinyección y tiene aplicaciones comerciales claro. Estudios posteriores ampliarán la aplicación de la estrategia de expresión descritas para investigar la biología del mosquito y paratransgenesis para control del virus del dengue.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo financiero de la investigación clave y programa de desarrollo de China (2016YFC1200500 a Xiao Guang Chen), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (81672054 y 81371846), el programa equipo de investigación de lo Natural Fundación de Ciencias de Guangdong (2014A030312016) y el programa científico y tecnológico de Guangzhou (201508020263). Agradecemos a profesor Jonathan Carlson (Colorado State University) amablemente la plásmidos pUCA y p7NS1-GFP y de lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
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