Summary
Vi rapporterar använder en konstgjord intronic små RNA uttryck strategi för att utveckla en icke-defekta rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveranssystem. Detaljerade anvisningar för konstruktion, förpackningar och kvantitativ analys av rAaeDV vektorer samt när det gäller larval infektion beskrivs.
Abstract
In vivo Mikroskop är den vanligaste gen överföring tekniken för att analysera funktionerna genen i enskilda myggor. Men denna metod kräver en mer tekniskt krävande operation och innebär komplicerade förfaranden, särskilt när de används i larver på grund av sin ringa storlek, relativt tunna och sköra nagelbanden och hög dödlighet, som begränsar dess tillämpning. Virala vektorer för gen leverans har däremot utvecklats för att övervinna extracellulära och intracellulära hinder. Dessa system har fördelarna med lätt manipulation, hög gen transduktion effektivitet, långsiktigt underhåll av genuttryck och förmågan att producera ihållande effekter i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) är mosquito-specifika, små enkelsträngat DNA virus som effektivt kan leverera utländska nukleinsyror i mygga celler; men orsakar utbyte eller införande av främmande gener att skapa rekombinanta virus vanligtvis en förlust av förpackning eller replikering förmågor, som är ett hinder för utvecklingen av dessa virus som leverans vektorer.
Häri, rapporterar vi använder en konstgjord intronic små-RNA uttryck strategi för att utveckla en icke-defekta rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveranssystem. Detaljerade förfaranden för konstruktion, förpackningar och kvantitativ analys av rAaeDV vektorer, samt larval infektion beskrivs.
Denna studie visar, för första gången möjligheten att utveckla en icke-defekta rekombinant MDV micro RNA (miRNA) uttryck systemet, och därmed ger ett kraftfullt verktyg för funktionell analys av gener i mygga och att upprätta en grund för den tillämpning av viral paratransgenesis för att styra myggor sjukdomar. Vi visat att Aedes albopictus 1st instar larver kan vara enkelt och effektivt smittad genom att införa viruset i vattenförekomsten av de larver som avel webbplats och att de utvecklade rAaeDVs kunde användas till överuttrycka eller slå ner den uttrycket av en specifik gen i larver, ger ett verktyg för funktionell analys av mygga gener.
Introduction
Moskitburen sjukdomar såsom malaria, denguefeber, zika feber och gula febern, är stora internationellt folkhälsoproblem som fortsätter att stå för en betydande del av den globala infektionssjukdomar börda1,2. Konventionella insekticider, som har använts i svar till vektorer, är en viktig del av hållbar integrerad mygga strategi för förebyggande av myggor sjukdomar. Sådana strategier har dock visat sig vara relativt ineffektiva eller oönskade på grund av den associera negativa miljöpåverkan samt utvecklingen av motstånd i mygga populationer3,4. Av dessa skäl finns det ett brådskande behov av alternativa metoder för mygga kontroll och användning av transgena metoder att producera sterila manliga myggor och frisläppandet av patogen-resistenta myggor har uppstått som lovande nya kontrollstrategier. För att utveckla effektiva nya kontrollmetoder, såsom säkra och effektiva metoder för in-vivo gen leverans, den omfattande analysen av mygga geners funktion krävs.
Direkta Mikroskop av plasmid DNA, dubbel stranded RNA (dsRNA) eller små störande RNA (siRNA) är vanligaste i vivo gen leveransmetod som myggor. Faktum är att produktionen av transgena stammar av myggor fortfarande förlitar sig på en process av embryo Mikroskop5,6,7. Mikroskop har dock flera begränsningar. Först, denna teknik är tekniskt krävande och komplicerade förfaranden tillämpas. Andra orsakar injektionen en fysiska förolämpning till embryo, larver, puppor och vuxen, vilket direkt påverkar lönsamheten för målorganismen. För det tredje är det svårt att immobilisera mygglarver för Mikroskop eftersom de flesta lever i en akvatiska habitat och besitter en egenskap som slingrande rörelse. Fjärde, storleken på 1st-2nd instar larver är 10 till 20 gånger mindre än 4th instar och äldre larver och nagelbanden den förstnämnda är mer känsliga. Dessa egenskaper gör det svårt att manipulera 1st-2nd instar larver jämfört med dem i äldre stadier. Kombinerat, bidrar dessa faktorer till en minskad efter injektion överlevnad för larver (cirka 5%) jämfört med vuxna8. Viral-baserade leverans system har utvecklats för att övervinna de associera extracellulära och intracellulära hinder. Dessa system har fördelarna med lätt manipulation, hög transduktion effektivitet, långsiktiga och stabila nivåer av uttryck och förmågan att producera ihållande effekter i vivo. Därför används gen leverans system utnyttja retrovirus, lentiviruses och adenoviruses har varit allmänt inmammalian cellinjer och modell arter. Sindbis virus uttryck systemet hade tidigare använts för att analysera funktionen genen i vuxen mygga; Förutom den biosäkerhet oro är injektionen dock fortfarande en nödvändig process för virusinfektion9. Även den muntliga leveransen genom att blötlägga larver i dsRNA lösningen har rapporterats tidigare som ett genomförbart leveransmetod, är det olämpliga för små RNA funktionen analys10. Så, effektiv viral leveransmetoder måste fortfarande utvecklas för myggor.
Mosquito densoviruses (MDVs) är en del av Densovirinae underfamiljen av Parvoviridae, och alla utom en faller inom släktet Brevidensovirus11. MDV virioner är icke höljeförsedda och består av ett enkelsträngat DNA (ssDNA)-genom och en ikosaedrisk kapsid (20 nm i diameter). Det virala genomet är cirka 4 kb i storlek och replikeras inom atomkärnor av värdceller. MDVs är relativt stabilt i miljön och visa ett smalt spektrum med hög specificitet för myggor. Dessa virus har potential att sprida och kvarstår naturligtvis i mygga populationer och kan invadera nästan alla organ och vävnader av dessa insekter, däribland midgut, Malpighian tubuli, fett kroppen, muskulatur, nervceller, och spottkörtlar12.
Intakt MDV genomen kan vara subcloned i plasmiden vektorer att producera plasmid-baserade smittsamma kloner; När dessa kloner levereras i mygga celler, det virala genomet utvinns från plasmiden vektorn och infektiösa viruspartiklar produceras. Eftersom MDV har en liten ssDNA genomet, infektiös kloner är enkelt uppbyggda och det virala genomet kan vara lättmanipulerade11,13. Dessa egenskaper gör MDV ett värdefullt medel för att pröva mygga biologi. Men eftersom nästan alla av den virala genomet sekvensen är viktigt för viral spridning, skapandet av rekombinanta virus genom att ersätta eller införande av främmande gener orsakar en förlust i viral förpackningar eller replikering förmågor, vilket skapar en hinder för utvecklingen av MDVs som gen leverans vektorer. Häri, rapporterar vi använder en konstgjord intronic små-RNA uttryck strategi för att utveckla ett icke-defekta rAaeDV i vivo RNA leveranssystem som har fördelarna med lätt plasmid konstruktion och underhåll av en funktionell virus som kan producera stabil och långsiktig uttryck i värdceller utan behov av vildtyp virus. Dessutom tillåter denna metod den lätt transduktion av larver.
Protokollen för de följande stegen beskrivs i denna studie: 1) utformningen av rAaeDVs kodning en intronic liten-RNA uttryck kassett, 2) produktion av rekombinant viruspartiklar med C6/36 förpackningar cellen fodrar, 3) kvantitativ analys av cellfria rAaeDV genomet kopiera siffror och 4) infektion av Ae. albopictus larver av direkt införande av virus i vatten kroppen larval livsmiljö. Sammantaget visade detta arbete att specifika små RNAs eller målgener kan i ökad utsträckning eller slogs ner i mygglarver dispensersystem utvecklade MDV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla protokoll godkändes av den etiska kommittén vid södra medicinska universitet.
1. utforma en konstgjord Intron
Obs: den konstgjorda intron som används i detta arbete är 65 bp i längd, och sekvensen är 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Placera Hpa jag begränsning webbplats på båda ändarna av konstgjorda intron så att Hpa jag matsmältningen kan släppa intron från plasmider (se figur 1).
- Plats två Xba jag begränsning platser i intron så att Xba jag matsmältningen kan användas för att infoga små-RNA uttryck sekvenser.
- Beställ kemiska syntesen av fullängds DNA-sekvenser av den konstgjorda intron från en DNA-tillverkare. Syntetiska DNA skapade är från kloning i en standard pUC19 plasmid.
Obs: De väsentliga delarna av den konstgjorda intron innehålla flera samförstånd nukleotid element, inklusive en 5 ' givare splice webbplats (DS) med sekvens GUAAGAGU, en bevarade gren-punkt sekvens (BPS) med sekvens UACUAAC, en poly-pyrimidin tarmkanalen (PPT) med sekvens UCUUC(U) 10, och en 3 '-acceptor splice webbplats (AS) med sekvens GAUAUCCUGCAG ( figur 1 A). Två Xba jag begränsning platser infördes mellan DS och BPS som kan användas för att infoga små-RNA uttryck sekvenser. Förmågan att effektivt skarva denna konstgjorda intron från däggdjurs- och mygga celler har varit tidigare bekräftade 14.
2. Utforma en konstgjord Intronic små RNA uttryck kassett
Obs: för överuttryck eller Nedslagning av endogena miRNA, sekvenser kodning föregångare miRNA eller miRNA svamp sattes in mellan DS och BPS. För att tjäna som ett exempel, valdes en endogen föregångare miRNA från Ae. albopictus aal-låt-7 att konstruera rekombinant virala vektorer för miRNA överuttryck och knockdown. En anti-let-7 svamp utformades enligt tidigare beskrivna metoder 15. För att slå ner målgener i larver, utformat vi specifika konstgjorda miRNA (amiRNA) eller kort hårnål RNA (shRNA) sekvenser med online-programvara 16 , 17; att tjäna som ett exempel, V-ATPas subenhet en mRNA (anslutningen nr. AY864912) valdes som en målgenen i denna studie. AmiRNA kommer att betecknas som amiVTP nedan. Alla sekvenser detaljer i pre-miRNA, svamp, amiRNA och shRNA beskrivs i kompletterande Tabell1.
- Beställa den kemiska syntesen av fullängds cDNA sekvenser av föregångare MicroRNA, miRNA svampar och shRNA med Xba jag begränsning platser på båda ändar från DNA tillverkaren.
- Efter att ha mottagit beställda DNA, snurra rören som innehåller DNA block på 10 000-14 000 x g för 1 min att se till att alla torkade DNA är på botten av röret.
- Omsuspendera torkade DNA i DNAS-fritt vatten för att uppnå en slutlig koncentration på 10 ng/µL.
- Smälta plasmid ryggraden och DNA sekvenser med Xba jag vid 37 ° C i 1 h och sedan dephosphorylate 5 ' ändarna av linearized plasmid stamnätet med kalv intestinal alkaliskt fosfatas (CIAP) enligt tillverkaren ' s-protokollet .
- Inaktivera CIAP av värme för 60 min vid 65 ° C.
- Kör en 1,0% agarosgel och skär linearized ryggraden. Sedan extrahera DNA från gel segmentet med en gel utvinning kit efter tillverkaren ' anvisningar.
- Ligate i DNA-fragment i den backboneby T4 DNA-ligase (5 U/µL) vid 22 ° C i 1 h.
- Omvandla produkter av ligering reaktionen från steg 2,7 till behöriga Escherichia coli (E. coli) celler och plattan på en Lysogeny buljong (LB) agarplatta som innehåller Ampicillin (vid en koncentration på 100 µg/mL).
- Utför omvandlingen genom en värme chock metod 18, och använda den lämpliga E. coli-stam. Exempelvis använda E. coli-stam DH5α för värme chock omvandling.
- Plocka en enda koloni från steg 2,8 och inkubera i en kultur av 3 mL berikad medium innehållande Ampicillin (vid en koncentration på 100 µg/mL).
- Extrakt av plasmid DNA från bakteriella kulturen med en mini prep kit efter tillverkaren ' anvisningar. Skicka provet till ett DNA sekvensering företag.
Obs: För överuttryck eller Nedslagning av endogena miRNA, sekvenser kodning föregångare miRNA eller miRNA svamp sattes in mellan två Xba jag webbplatser. Alla miRNA uttryck eller svamp konstruktioner måste vara kortare än 400 bp (10% av den virala genomet längden) på grund av gränsen förpackning av virus 19.
3. Generera en rAeaDV konstruktion av kloning en miRNA eller shRNA uttryck kassett i en Plasmid ryggrad
Obs: pUCA, en infektiös klon bestående av en pUCA plasmid som innehåller AaeDV genomet (3.981 nt) 19, var vänligen tillhandahållen av Prof. Jonathan Carlson och tidigare har beskrivits i detalj 11. p7NS1-DsRed uttrycker ett icke-strukturella protein 1 (NS1)-fusionsprotein röd fluorescerande protein (DsRed) från p7 arrangören och har varit beskrivs i detalj på annan plats 14. En mänskliga-specifika miR-941-1 föregångaren 20 och dess svamp, en äggröra shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), var också subcloned till AaeDV som en negativ kontroll.
- Ligera den pre-miRNA, svamp, shRNA eller ett amiVTP uttryck kassett till Hpa jag webbplats av AaeDV NS1-kodande regionen i pUCA plasmid ryggraden som beskrivs i protokollet steg 2,4 till 2,7.
- Omvandla DNA till Stbl3 behöriga E. coli celler och välj en positiv klon som beskrivs i steg 2,8 till 2.10.
- Efter detta, extrahera rAaeDV plasmiden från bakteriecellerna med en maxi prep kit efter tillverkaren ' anvisningar.
Obs: Stbl3 eller Stbl4 E. coli celler bör utnyttjas för rAaeDV DNA omvandling att minimera oönskade ITR rekombination. En maxi prep bör användas för att extrahera rAaeDV plasmiden för att få en stor mängd DNA (> 100 µg). Innan du genererar viruset, rAaeDV plasmiden sekvens integritet bör alltid analyseras med DNA sekvensering 21.
4. Transfecting C6/36 celler med rAaeDV plasmider
- kultur C6/36 celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin i en 28 ° C inkubator.
- På dag 0, platta celler i tio 25 cm 2 kultur kolvar 18-20 h innan transfection genom att dela upp 90-95% konfluenta celler i en spädning 1:2.
Obs: Dag 1, cellerna bör nå 90-95% sammanflödet. - På dag 1, transfect cellerna med serien av rAaeDV plasmider 22.
- Späd 10 µg DNA i 600 µL RPMI-1640 medium i en mikrocentrifug rör och blanda försiktigt. Under tiden förbereder 600 µL RPMI-1640 medium och 25 µL transfection reagens per transfection.
- Inkubera i 5-10 min i rumstemperatur (RT). Lägg sedan till 625 µL av 1640-transfection reagens blandningen till 1640-plasmid DNA blandningen.
- Inkubera denna blandning för 20-30 min på RT. Innan transfection, tvätta cellerna två gånger med 2 mL RPMI-1640 medium.
- Efter the RT inkubationen (steg 4.3.3), tillsätt the1640-transfection reagens DNA plasmid blandning till 25 cm 2 kultur kolven och inkubera i 6 h 28 ° C.
- På ca 6 h efter transfection, ta bort transfection media, tvätta cellerna två gånger med 5 mL RPMI-1640 medium och sedan lägga RPMI-1640 medium med 10% FBS.
Obs: rAaeDV visar höga nivåer av infektion (95%) i Ae. albopictus larver, men enligt vår erfarenhet, i nästan 50% av infekterade larver, infektionen begränsades till primär infektion webbplatser (t.ex., anal papiller och borst celler) utan spridning 23. Om det finns ett behov att infektera larver i flera vävnader, bör en defekt rekombinanta virus uttrycker fluorescerande protein därför samtidig infektion att aktivera visualisering av infektion platser. Exempelvis för att producera defekta rekombinanta virus uttrycker DsRed, p7NS1-DsRed bör samtidig transfekterade med en helper plasmid i C6/36 celler enligt proceduren som beskrivits ovan (cotransfection koncentrationsgraden bör vara 2:1).
5. Skörd från transfekterade C6/36 celler virioner på rAaeDV
- skörda cellerna 5 dagar efter transfection. Rubba och stänga av cellerna i rätterna av en 5 mL glas dropper, pipettering upp och ner med odlingssubstratet. Överföra alla cellsuspensioner till steril 15 mL tuber.
- Fryser vid-80 ° C eller i badkar torris/etanol i 30 min och sedan Tina i 37 ° C. Vortex för 1 min. Upprepa förfarandet frysning-och-tining 3 gånger.
- Centrifugera provet vid 4800 x g i 20 min på 4 °C.Collect supernatanten och kassera pelleten. Sedan, passera supernatanten genom ett 0,22 µm engångsspruta filter. Delprov och store den slutliga renat virion bestånd vid -80 ° C.
Obs: Undvik upprepad frysning-tining cykler.
6. Kvantifiera rAaeDV
- Förbered DNA standarder. Linjär alla rAaeDV plasmider med Hpa, och rena smält produkterna med en gel utvinning kit 24.
- Konstruera absoluta kvantitativa standardkurvan och mäta antikroppnivåns på virus enligt tidigare beskrivna metoder 25.
7. Mygga transduktion
- tvätta 100 1 st instar Ae. albopictus larver tre gånger med hjälp av avjoniserat vatten och överför sedan larverna till en bägare som innehåller 95 mL avjoniserat vatten. Tillsätt 5 mL av rAaeDV bestånden (slutlig koncentration på 1,00 x 10 10 kopior/mL).
- Inkubera för 24 h vid 28 ° C, tvätta larvaena tre gånger med hjälp av avjoniserat vatten och överför sedan larverna tillbaka till plattorna och foder regelbundet.
- Övervaka nivån på målet genuttryck i larverna med qPCR eller Western blot (representant resultaten visas i figur 3 och 4).
Obs: Fluorescens signal upptäckt metoden kan användas för att isolera infekterade larver mer exakt. Till exempel för att upptäcka fluorescerande signaler från larver smittats med rekombinanta virus uttrycker DsRed, kan larverna placeras på en konkavitet bild och observerade under en inverterad fluorescens Mikroskop varje 8 h tills 2 dagar efter infektion. När fluorescerande larverna upptäcks, bör de delas in i individuella plast test koppar att möjliggöra efterföljande kontinuerlig observation. Larver med flera vävnader infekterade kan identifieras med den här metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strategier för rAaeDV konstruktion
En defekt rAaeDV vektor genererades för att uttrycka den DsRed genen i mygglarver. Resulterande plasmiden innehöll en NS1-DsRed fusion protein kassett med VP proteinet tas bort (figur 1A). rAaeDV plasmider som innehåller uttrycket konstruktioner för miRNA, utformades miRNA svamp, shRNA och amiRNA (visas i figur 1B). Exempelvis genererades en rAaeDV vektor för att överuttrycka aal-låt-7 i mygglarver. Resulterande plasmiden innehöll en intronic pre-aal-låt-7 kassett i den virala NS1 exon (figur 1B). En rAaeDV vektor som innehåller en intronic aal-låt-7 svamp uttryck kassett i den virala NS1 exon genererades för att slå ner aal-låt-7 uttryck i mygglarver (figur 1B och figur 2B). En rAaeDV shRNA vektor och en rAaeDV amiRNA vektor som innehåller intronic shRNA och pre-amiRNA uttryck kassetter, respektive, användes för att slå ner V-ATPas mRNA i mygglarver (figur 2C).
Beräkning av de rAaeDV titrar baserat på en standardkurva som genereras med den linjär regressionsanalysen
Y-axeln representerar Log10 värdet av standard molekylära DNA-koncentration och x-axeln anger värdet CT. CT siffror (x-axeln) och Log10 (koncentration) värden (y-axeln) visas en god korrelation (R2 = 0.9988) och uppfyller ekvationen y = - 0,288 x + 13.87 (figur 3). Beräkna de rAaeDV titrarna av prover med hjälp av linjär ekvation (tabell 1). Metoden beskrivs i protokollet (steg 6,2 och tabell 1), de höga titrarna av rAaeDV (4 mL, > 7,65 x 1010 partiklar/mL) skördades. Rekombinanta virus (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s och VrepUCA-shct) genererades av transfecting de motsvarande infektion kloner pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct till C6/36 celler (avsnitt 3, 4 och 5).
MiRNA effektivitet överuttryck och Nedslagning av i rAaeDV vektorer
I exempel vektor 100 1st instar larverna behandlades med lika stora belopp (1,00 x 1010 partiklar/mL) av rAaeDV som innehåller intronic pre-let-7 uttrycket, intronic låt-7 svamp uttryck vektorn, de mänskliga-specifika Pre-miR-941-1 uttryck vektor- eller miR-941-1 svamp uttryck vektorn genom att lägga till viruset in i vatten kroppen larval livsmiljö. Fem dagar efter infektion, uttryck för aal-låt-7 bestämdes av qPCR (figur 4, n = 3; Kompletterande tabell 2). Låt-7 nivåer som visas som den medelvärde ± SD för tre biologiska replikerar i larverna, var väsentligen ökas eller minskas med den pre-let-7-uttrycka rAaeDV (2,843.31 ± 80.72%, p i ökad utsträckning < 0,0001, t-test) och den Låt-7-svamp-uttryckande rAaeDV (nedreglerade 74.78 ± 1,60%, p < 0,0001, t-test), respektive.
Övervakning av rAaeDV vektorer V-ATPas mRNA knockdown effektivitet
Sammanlagt 100 1st instar larverna behandlades med lika mängder (1,00 x 1010 partiklar/mL) intronic amiRNA-uttryckande rAaeDV, intronic shRNA-uttryckande rAaeDV, mänskliga-specifika pre-miR-941-1-uttryckande rAaeDV orscramble shRNA-uttryckande rAaeDV genom att lägga till viruset in i vatten kroppen larval livsmiljö. Fem dagar efter infektion, uttrycket av V-ATPas mRNA bestämdes av qPCR (figur 5, n = 3; Kompletterande tabell 2). V-ATPas nivån visas som den medelvärde ± SD för tre biologiska replikerar i larverna väsentligt minskade amiRNA-uttryckande rAaeDV (nedreglerade av 43.01 ±6.37%, p = 0,0011, t-test) och intronic shRNA-uttryckande rAaeDV (nedreglerade av 72,88 ± 5.74%, p = 0,0001, t-test).
Figur 1 : Schematisk organisation av rekombinant AaeDV plasmidsna. (A) pNS och pVP viral initiativtagarna köra uttrycket NS1/NS2 gener och VP gener, respektive. I p7NS1-DsRed plasmiden, var den DsRed genen smält till NS1 genen. (B) pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-941-1, pUCA-941-1s, pUCA-shct, pUCA-shVTP och pUCA-amiVTP innehåller konstgjorda introner, inklusive aal-låt-7, aal-låt-7 svamp, har-miR-941-1, har-miR-941-1 svamp, kodade shRNA, V-ATPas shRNA och konstgjorda miRNA, respektive, som var klonade in Hpajag webbplats av NS1 genen. Den konstgjorda intron visas flanked av en skarv givare (DS) och en acceptor site (AS) och innehåller en vägdelningen domän (BrP), en poly-pyrimidin-tarmkanalen (PPT) och pre-miRNA. Den miRNA svamp eller konstgjorda miRNA infogas inuti intron mellan 5-skarv webbplats och i BrP. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Biogenes av konstgjorda intronic mikroRNA (miRNA) och strategi för att generera miRNA svampar och konstgjorda microRNA. (A) Intronic miRNA är samtidig transkriberas inom en föregångare budbärar-RNA (pre-mRNA) av NS1, som drivs av pNS1 promotorn och klyvs av pre-mRNA av RNA skarvning. Även om exonerna är sammanskrivna för att bilda en mogen budbärar-RNA (mRNA) för NS1 proteinsyntesen, bearbetas den skarvade intron med den pre-miRNA ytterligare till mogen miRNA av Dicer. (B) strategi för att generera de anti-let-7 och anti-miR-941-1 konstruktioner. Justering av anti-let-7 och anti-miR-941-1 sekvenser med aal-låt-7 och har-miR-941-1, respektive. Fullständig matchning av Regionkommittén utsäde med anti-miRNA sekvens och svans regioner visas. Både låt-7 och miR-941-1 svampar innehåller tre upprepa antisense konstruktioner (röda bokstäver) som kan binda till aal-låt-7 och har-miR-941-1, respektive. (C) sekvenser och förutspådda föregångare strukturer för miRNA-baserade konstgjorda MicroRNA och shRNA används i denna studie. Den mogna konstgjorda MicroRNA och shRNA visas i rött, och deras relaterade mål mRNA sekvenser är i blått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Standardkurvan för rAaeDV titrering och den beräknade concentrations av MDVs. (A) realtids qPCR utfördes med en pUCA standard som var utspädd med 10 gånger förstoring förhållandet, och CT -värdet mättes på en ABI 7500 som x. Kopienumret beräknades enligt steg 6.2 och 6.3 med följande formel: Kopiera nummer (y) =-0.288x + 10,87; R2 = 0.9988. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Rekombinant MDV-medierad aal-låt-7 överuttryck och knockdown i Ae. albopictus larver. (A) analys av endogena miRNA uttryck i larver efter infektion med rekombinanta virus som innehåller aal-låt-7 uttryck kassetten (till vänster). (B), effektiviteten i anti-let-7 konstruktion var beslutsam i larver (höger panel). Den har-miR-941-1 och har-941-1 svamp (negativ kontroll) i ökad utsträckning nedreglerade den mogna låt-7 MicroRNA, respektive, jämfört de basala nivåer som observerats i kontrollgruppen. miRNA överflöd var normaliserade till 5S rRNA, och data visas som den medelvärde ± SD för tre biologiska replikerar. T-tester utfördes på olika nivåer av betydelse. Asteriskerna visar statistiskt signifikanta skillnader mellan de infekterade och motsvarande mock-behandlade larvaena (fyra asterisker, p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Analys av V-ATPas mRNA uttryck efter infektion med rekombinanta virus som innehåller shRNA och amiRNA kassetter. mRNA överflöd var normaliserade till aalrpS7. Felstaplar representera standardavvikelsen för 2−ΔΔCT värdena för V-ATPas mRNA uttryck i Ae. albopictus larverna som utvärderas av real-time RT-PCR (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Rekombinant MDV C T värde bestäms av qPCR motsvarar den x värdet i den formel, som används för att beräkna de y värde. Virusgenom kopienumret i varje 1 µL prov erhölls genom maktens funktion (10, y), som var ytterst multipliceras med 40, konvertera värdet till virus koncentrationen av virussuspension.
Kompletterande tabell 1: Sekvenser av miRNA föregångare.
Kompletterande tabell 2: qPCR data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att övervinna två av de viktigaste hindren som begränsar rAaeDV konstruktion. Först är produktionen av defekta rekombinanta virus. Det har rapporterats att MDV kan användas som en vektor att uttrycka korrekt storlek främmande gener, såsom scorpion insekt-specifika neurotoxins20 och proteinet GFP; men oavsett konstruktion strategin, när den ORFs av MDV infogas eller ersättas med exogena gener, virioner kan inte bilda självständigt såvida inte en helper plasmid är cotransfected för att tillhandahålla de saknade oumbärlig virusproteiner. Den defekta viruset går inte att engagera sig i sekundär överföring, som förekommer i vivo i myggor med defekta genomen. Våra resultat validera ett intronic uttryck-strategi som erbjuder ett nytt paradigm som kan övervinna begränsningarna av MDVs med defekt genom att möjliggöra effektiv distribution av främmande gener i myggor.
Andra är krävande längdbegränsningen av rekombinant virala genomet som införts av storleken på viral kapsid. För effektiv förpackning, får inte genomet storlek överstiga 4.400 nukleotider (110% av längden på wt MDVs genomet). En intronic miRNA uttryck kassett (inklusive miRNA uttryck kassett och konstgjorda intron) av mer än 400 nt kan införas i AaeDV genomet. Även om längden på rekombinant virusgenom är fortfarande lämplig för förpackning, har leverans systemet utrymme för förbättringar. På grund av begränsningen i genomet längd är det svårt att uttrycka gener utan defekt intronic uttryck strategier.
Det är viktigt att säkerställa att C6/36 celler friska att de framgångsrika transfection och förpackning av rAaeDV. Men de katjoniska Liposom reagenser som används här och kommersiella insekt cell specifika transfection reagenser, förbättrar inte effektiviteten i C6/36 cell transfection (40-60%). Därför, för att skörda hög-titer rekombinanta virus, det är nödvändigt att behålla cellerna i 5 dagar efter transfection baserat på tidigare beskrivna tillväxt egenskaper14. Dessutom för framgångsrika larval infektion är det viktigt för larver kommer i kontakt med infektiösa viruspartiklar för 24–36 h att säkerställa hög infektion nyckeltal23.
Avslutningsvis är intronic uttryck strategin beskrivs här först med att övervinna de hinder som införts av generationen av defekta MDV. Denna strategi möjliggör produktion av icke-defekta rekombinant MDVs som kan överuttrycka eller downregulate MicroRNA och mål gener i myggor. Denna teknik ger ett verktyg för funktionell analys av mygga gener utan användning av komplicerade larver Mikroskop förfaranden och har tydliga kommersiella tillämpningar. Fortsatta studier kommer att utöka tillämpningen av strategin beskrivs uttryck att undersöka mygga biologi och paratransgenesis för denguefeber virus kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiellt stöd från nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2016YFC1200500 till Xiao-Guang Chen), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (81672054 och 81371846), Team forskningsprogrammet inom naturligt Science Foundation av Guangdong (2014A030312016), och vetenskapliga och tekniska programmet för Guangzhou (201508020263). Vi erkänner tacksamt Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) för vänligt att tillhandahålla de pUCA och p7NS1-GFP plasmidsna och kritiskt läsa detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
- BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
- GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
