Summary
Her beskriver vi en chromatin immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-seq biblioteket forberedelse protokollen å generere globale epigenomic profiler fra lav-overflod kylling embryonale prøver.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en mye brukt teknikk for å kartlegge lokaliseringen av post-translationally endret histones, histone varianter, transkripsjonsfaktorer eller chromatin-modifisere enzymer i et gitt locus eller på en genomet-bred skala. Kombinasjonen av ChIP analyser med neste generasjons sekvensering (dvs. ChIP-Seq) er en effektiv tilnærming til å avdekke globalt genet regulatoriske nettverk og forbedre funksjonelle merknaden av genomer, spesielt av ikke-kodingen regulatoriske sekvenser. ChIP protokoller krever vanligvis store mengder mobilnettet materiale, dermed utelukker anvendelsen av denne metoden å undersøke sjeldne celletyper eller liten vev biopsier. For å gjøre ChIP analysen kompatibel med mengden biologisk materiale som vanligvis finnes i vivo under tidlig virveldyr embryogenesis, beskriver vi her en forenklet ChIP protokoll der antall trinn som kreves for å fullføre den analysen ble redusert for å unngå tap av prøven. Denne brikken protokollen har blitt brukt til å undersøke ulike histone endringer i ulike embryonale kylling og voksen mus vev med lav til middels cellen tallene (5 x 104 - 5 x 105 celler). Viktigere, denne protokollen er kompatibel med ChIP-seq-teknologi bruker standard bibliotek forberedelse metoder, gir global epigenomic kart i svært relevante embryonale vev.
Introduction
Histone post-translational modifikasjoner er direkte involvert i ulike chromatin avhengig av prosesser, inkludert transkripsjon, replikering og DNA reparasjon1,2,3. Videre ulike histone modifikasjoner Vis positiv (f.eks H3K4me3 og H3K27ac) eller negative (f.eks H3K9me3 og H3K27me3) korrelasjoner med genuttrykk og kan bredt defineres som aktivering eller undertrykkende histone merker, henholdsvis2,3. Følgelig globale histone endring kart, også referert til som epigenomic kart, har dukket opp som kraftige og universell verktøy funksjonelt kommentere virveldyr genomer4,5. For eksempel distale regulatoriske sekvenser som enhancers kan bli identifisert basert på tilstedeværelsen av bestemte chromatin signaturer (f.eks aktive enhancers: H3K4me1 og H3K27ac), som skilles fra proksimale promoter regioner (f.eks aktive arrangører: H3K4me3)6,7,8. På den annen side, finnes gener med store celle identitet regulatoriske funksjoner vanligvis med bred chromatin domener merket med H3K4me3 eller H3K27me3, avhengig av transcriptionally aktiv eller inaktiv status for underliggende genene, henholdsvis9 ,10. Tilsvarende synes uttrykket av store celle identitet gener å styres ofte av flere og romlig gruppert enhancers (dvs. super enhancers), som kan identifiseres som bred H3K27ac-merket domener11.
Foreløpig genereres histone endringen kartene ved hjelp av ChIP-seq-teknologi, som i forhold til forrige metoder som ChIP-chip (ChIP koblet til microarrays) gir høyere oppløsning, færre gjenstander, mindre støy, større dekning og lavere koster12. Likevel, generering av epigenomic kart ved hjelp av ChIP-seq teknologi har iboende begrensninger mostly assosiert med kapasitet til å utføre ChIP i utvalgene av interesse. Tradisjonelle ChIP protokoller vanligvis kreves millioner av celler, som limit anvendelse av denne metoden til i vitro cellen linjer eller celler som kan lett bli isolert i vivo (f.eks blodceller). I de siste årene, har en rekke endret ChIP protokoller kompatibel med lav cellen tallene vært beskrevet13,14,15,16. Men disse protokollene er utviklet for å være sammen med neste generasjons sekvensering (dvs. ChIP-seq), og de bruker adhoc biblioteket forberedelse metoder13,14, 15 , 16.
Her vi beskrev en ChIP-protokoll som kan brukes til å undersøke histone endring profiler med lav til middels celle tall (5 x 104 - 5 x 105 celler) på enten valgte loci (dvs. ChIP-qPCR) eller globalt (dvs. ChIP-seq) (figur 1). Kombinert ChIP-seq teknologi, kan våre ChIP-protokollen brukes sammen med standard bibliotek forberedelse metoder, således gjør den bredt tilgjengelig for mange laboratorier10. Denne protokollen er brukt til å undersøke flere histone merker (f.eks H3K4me3, H3K27me3 og H3K27ac) i annen kylling embryonale vev (f.eks spinal medfødte (SNT), frontonasal prominences og epiblast). Men forventer vi at det skal være bredt aktuelt for andre organismer der biologisk og/eller klinisk relevante eksempler bare finnes i små mengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ifølge tyske dyr omsorg retningslinjer, ingen dyr institusjon og bruk Committee (IACUC) godkjenning var nødvendig å utføre kylling embryoet eksperimenter. I henhold til lokale retningslinjer må bare eksperimenter med kylling HH44 (18-dag) embryoer og eldre IACUC godkjennes. Men embryoene brukt i denne studien var i tidligere stadier av embryonale utvikling (dvs. HH19 (72 h)).
Merk: hensikten med denne protokollen er å gi en detaljert beskrivelse av ChIP analysen slik at den effektivt kan kombineres med qPCR eller neste generasjons sekvensering (dvs. ChIP-seq) å undersøke histone endringer i lav-overflod embryonale prøver (fra 5 x 10-4-5 x 10 5 celler for hver brikke reaksjon) og ulike vev typer ( figur 1). Protokollen skal gjelder undersøker bindende profiler transkripsjonsfaktorer og co aktivator (f.eks p300). Men på grunn av lavere overflod av disse regulatoriske proteiner, større cellen tallene er trolig være nødvendig (5 x 10 5 - 5 x 10 6 celler for hver brikke reaksjon).
1. forberedelse av egg og Microdissection av kylling SNT
Merk: fremgangsmåten for microdissections teknisk varierer fra vev til vev og dyremodell dyr modellen. Denne delen beskriver i detalj disseksjon protokollen brukes til å innhente brachialis SNT deler fra scenen-HH19 kylling embryoer eksempel.
- Ruge fruktbare hvit leghorn høne egg, fra lokale oppdretter, i vannrett retning ved 37 ° C og 80% fuktighet for 3 dager å få scenen-HH19 kylling embryoer.
- Bestemme stadier i henhold til Hamburger og Hamilton kylling embryonale utviklingsmessige oppsetning systemet 17.
- Utfører alle microdissections i kaldt vær, ellers chromatin integritet kan kompromitteres.
- Isolere HH19 embryoer.
- For å gjøre embryoene tilgjengelig, pakke 3 mL albumin bruker en 10-mL sprøyte med en nål (0.90 x 40 mm) for å senke blastoderm.
- Gjøre en liten åpning i egget med fine saks og legge 1 mL av Locke løsning (se Utfyllende materialer for oppskriften) å lette fjerning av ekstra-embryonale membraner.
- Injisere 10% indisk svart blekk/Locke løsning ved hjelp av en 1-mL sprøyte med en nål (0,55 x 25 mm 2) under blastoderm for å forenkle visualisering av embryoene.
- Kuttet av ekstra-embryonale membranen som omgir embryoet medisinsk kirurgisk fine saks og tang.
- Bruke en perforert skje for å overføre embryoet til en 4,5 cm Petriskål inneholder 20 mL 1 x PBS løsning.
- Dissekere bort til amnion og de gjenværende delene av ekstra-embryonale membran med fine saks og tang under en stereomicroscope.
- Kutte tverrgående SNT segmentet brachialis nivået av fosteret, utvide caudally inn i thorax regionen isolere SNT ( figur 2).
- Fjerne vev som lateralt/ventrally omgir SNT (f.eks lateral plate mesoderm, ektoderm, notochord og aorta) ved hjelp av pinsett ( figur 2).
- Fordype hver dissekert kylling SNT segmentet i en 3,5 cm Petriskål inneholder 5 mL av varm (37 ° C) trypsin (Trypsin/EDTA løsning 1:250).
- Stopper trypsin behandling når løsner ikke-nevrale vev rundt SNT oppdages under en stereomicroscope.
Merk: Trypsinization tiden må kontrolleres nøye unngå over fordøyelsen og spredning av nevrale vev og beholde den strukturelle integriteten til SNT. - Etter trypsin behandling, fjerne gjenværende mesenchymal og ectodermal vev manuelt for å forberede delen for ren SNT.
- Overføre delen SNT slik 1,5 mL og flash-fryse det i flytende nitrogen. Når tilstrekkelig SNT delene er akkumulert (pool SNT seksjoner fra ~ 30 kylling embryoer for en ChIP reaksjon), lagre på-80 ° C.
Merk: Hvis tilstrekkelig embryonale vev (dvs. 5 x 10 5-5 x 10 6 celler) kan være dissekert fra en enkelt eller noen kylling embryoer, deretter frysing er ikke nødvendig og det er mulig å gå direkte til de neste trinnene. Se feilsøkingsinformasjonen i tabell 1.
Merk: Advarsel! Flytende nitrogen har en ekstremt lav temperatur, bruk passende sjerm.
2. Crosslinking proteiner til DNA: dag 1
Merk: utføre alle skritt på is hvis oppgitt.
- Legge til 500 µL av DMEM med 10% FBS og 10 µL av 1 M Na-butyrate direkte til frosne vev eller alternativt umiddelbart til nylig dissekert vev. Homogenize cellene ved å suspendere forsiktig med en 1 mL pipette.
NOTE Addisjonen av Na-butyrate er valgfritt, men anbefales hvis undersøker histone acetylation. I stedet for DMEM - 10% FBS, kan prøver bli resuspended i 1 x PBS med 0,1% BSA. Tillegg av FBS eller BSA er valgfritt, men det forenkler pelleting eksemplene i påfølgende sentrifugering trinnene. - Legge til 13,5 µL av 37% formaldehyd (1% formaldehyd endelig) og plasser den på et rotator i 15 min ved romtemperatur.
Merk: Advarsel! Formaldehyd er giftig. - Legge til 25 µL av 2.5 M glysin røret og plassere den på et rotator i 10 min ved romtemperatur å slukke formaldehyd.
- Spinne røret 850 x g i 5 min på 4 ° C i en bord sentrifuge. Forkaste nedbryting.
- Vask pellet gang med 500 µL kald nylagde vask buffer (se Utfyllende materialer for oppskriften), sentrifuger på 850 x g og 4 ° C i 5 minutter, og forkaste nedbryting.
3. Lyse og Sonication
- forberede komplett lysis buffer (LB) (se Utfyllende materialer for oppskriften) og chill på is. 1 mL, bruke 950 µL av LB, 40 µL protease hemmer konsentrat (25 x) og 10 µL av 100% PMSF.
- Resuspend pellet i 300 µL av komplett LB av pipettering og plassere den på en rocking plattform for 10 min 4 ° C.
- Sonicate prøvene med følgende innstillinger: Temp = 4 ° C, totaltid = 7 minutter, “ på ” intervall = 30 s, “ av ” intervall = 30 s, amplitude = 25%
Merk: Sonication betingelser må være optimalisert for hvert vev og vil variere avhengig av sonicator brukes. Det er anbefalt å bruke de laveste sonication innstillingene som skåret DNA spenner fra 200 til 600 bp i størrelse. Klipping varierer sterkt avhengig av vev type, quantity sonication volum, crosslinking vilkår og utstyr. Se feilsøkingsinformasjonen i tabell 1. - Spin sonicated prøven 16.000 x g i 10 min på 4 ° C pellets mobilnettet rusk.
- Overføre lysate (nedbryting) til en frisk 1.5-mL tube.
Merk: Hvis den starte materialet anses tilstrekkelig for to ChIP eksperimenter, deretter 300 µL av komplett LB kan legges til i sonicated chromatin (dvs. siste volum: 600 µL). - Legge til 30 µL av 10% octylphenol ethoxylate for hver 300 µL av sonicated lysate (siste konsentrasjon: 1%) og bland av pipettering.
Merk: Advarsel! Octylphenol ethoxylate er akutt giftig (muntlig, dermal, inhalasjon).
4. Antistoff inkubasjon
- Aliquot av 330 µL av sonicated lysate i to 1,5-mL rør: 300 µL ChIP og 30 µL som input kontroll (10% av utgangsmaterialet). Butikken i " 30 µL input kontroll prøven " på -20 ° C.
Merk: Hvis to ChIP reaksjoner utføres fra samme eksempel, så den 660 µL av sonicated lysate kan distribueres i tre 1,5 mL rør (300 µL for ChIP #1, 300 µL ChIP # 2 og 60 µL som input kontroll (20% av utgangsmaterialet hver chip) ). - Legge til 3-5 µg antistoff 300 µL sonicated chromatin aliquot og Inverter å blande.
Merk: I denne studien hver ChIP reaksjon ble utført med et antistoff som er spesifikke for Histone H3 tri denaturert i K4 (H3K4me3), Histone H3 di denaturert i K4 (H3K4me2), Histone H3 tri denaturert på K27 (H3K27me3), og Histone H3 tri acetylation på K27 (H3K27me3). Suksessen til denne protokollen er helt avhengig av kvaliteten på antistoffer brukes. Antistoffer bør være bestemt og effektiv ved immunoprecipitation av et bestemt protein. Det er viktig å bestemme mengden av antistoff som kan brukes til å immunoprecipitate krysskoblet protein-DNA komplekse. Spesifisitet av antistoffer kan også kontrolleres ved Western blot slik at det oppdages riktig protein. Et antistoff som oppdager flere uspesifikke band er ikke anbefalt for ChIP. - Sett røret på en rocking plattform på 4 ° C over natten (12-16 h) å binde antistoffer til chromatin.
Merk: Se feilsøkingsinformasjonen i tabell 1.
5. Utarbeidelse av magnetiske perler: dag 2
- Aliquot 50 - 100 µL av Protein G/magnetisk perle slurry for hver brikke reaksjon i en 1,5 mL microfuge rør på ice.
- Vask de magnetiske perlene tre ganger med kaldt blokk løsning (se Utfyllende materialer for oppskriften) (4 ° C). Legge til 500 µL av kaldt blokk løsning og blanding av invertere eller flicking. Legge røret i en magnetisk holder og venter perler å bosette seg på siden av røret. Hell av klar væske og gjenta. Etter siste vask, fjerne all væsken med gel-lasting tips.
6. Immunoprecipitation av Chromatin
- legger til 300 µL av antistoff-bundet chromatin vasket perler og Inverter for å mikse.
- Roter loddrett på et rør rotator ved 4 ° C i minst 4 h binde antistoffer til perlene.
7. Vask, Elute og reversere krysskoblinger
- Chill RIPA vaskebuffer (se Utfyllende materialer for oppskriften) på is, satt vannbad til 65 ° C, og nedkjøling sentrifuge 4 ° C.
- Vask chromatin-bundet perlene fire ganger i 1 mL av kaldt RIPA vaskebuffer og holde på is. Gjør legge 1 mL kaldt RIPA vaskebuffer og blanding av invertere eller flicking. Sett røret i magnetiske holderen og venter perler å bosette seg på siden av røret. Hell av klar væske og gjenta.
Merk: Antall vasker med RIPA vaskebuffer måtte være optimalisert avhengig av eksempel type, prøve overflod og antistoff brukes. Et økt antall vasker vil redusere bakgrunnen men vil også redusere den totale mengden gjenopprettede DNA, som kan skade nedstrøms analyse av qPCR eller ChIP-seq. - Legge til 1 mL av TE/50 mM NaCl røret og overføre chromatin-bundet perlene i TE/50 mM NaCl slik frisk 1.5-mL microfuge før du fjerner væske ved hjelp av magnetiske innehaveren, som beskrevet ovenfor.
- Spin perler på 900 x g i 3 minutter på 4 ° C, sett røret tilbake inn i magnetiske holderen og fjerne alle gjenværende TE med gel-lasting tips.
- Legge til 210 µL av elueringsbufferen (se Utfyllende materialer for oppskriften) i romtemperatur og resuspend ved å sveipe.
- Elute i 15 min på 65 ° C i en varme blokk mens risting.
- Spinn perlene 16.000 x g i 1 min i romtemperatur og sett røret i magnetiske innehaveren.
- Overføre nedbryting (~ 200 µL) til en frisk microfuge rør når perlene har avgjort.
- Tine input kontroll prøvene (30 µL) fra 20 ° C til romtemperatur (frossen i trinn 4.1) legge 3 mengder elueringsbufferen (90 µL) og bland ved kort vortexing.
- Ruge chip og kontroll eksemplene på 65 ° C over natten (12-16 h) å reversere krysskoblinger.
8. Digest Cellular Protein og RNA: dag 3
- 8.1At romtemperatur, legge til 1 volumet av TE buffer per tube (å fortynne SDS) og Inverter for å blande: legge til 120 µL av TE 120 µL av kontroll prøven og 200 µL av TE til 200 µL av ChIP utvalget.
- Legge til RNase A 0,2 mg/mL siste konsentrasjon og Inverter å blande: legge til 2,4 µL av 20 mg/mL RNase A 240 µL av kontroll prøven og 4 µL av 20 mg/mL RNase A til 400 µL av ChIP utvalget.
- Ruge rørene på 37 ° C i et vannbad 2 h å fordøye RNA.
- Legge proteinasen K til en siste konsentrasjon av 0,2 mg/mL og Inverter for å blande: legge til 2,4 µL av 20 mg/mL proteinasen K 240 µL av kontroll prøven og 4 µL av 20 mg/mL proteinasen K til 400 µL av ChIP utvalget.
- Incubate på 55 ° C i et vannbad 2 h å fordøye protein og rense DNA.
9. ChIP-qPCR
Merk: utfører DNA utvinning og rensing, som beskrevet i Supplerende materiale.
Merk: kontrollere sonication effektivitet som beskrevet i Supplerende materiale, bekrefte at 200-500 bp DNA fragmenter hentes ( Figur 3).
Merk: et viktig skritt er å avgjøre om ChIP faktisk jobbet. Hvis det er kjent genomisk bindende områder for protein av interesse, kan primere være konstruert for kvantitative PCR (qPCR) til å fastslå om de kjente nettstedene er spesielt beriket i ChIP DNA, med negative-kontroll områder ikke forventes å være bundet av kandidato proteiner. Som et eksempel, dette arbeidet viser ChIP-qPCR resultatene med sjetonger utført for H3K4me3 (aktiv promoter histone merke) og H3K27me3 (inaktiv promoter histone merke) i SNT deler isolert fra HH14 kylling embryoer ( figur 4A ).
- Mix hver primer pair (forover og bakover) i samme rør og forberede en lager konsentrasjon på 20 µM hver bruker dH 2 O (tabell 2).
Merk: effektiviteten i hvert primer skal evalueres før ChIP-qPCR analyse. - Bruker ChIP og 20% inn kontrollen DNA fikk i trinn 8.5 for qPCR optimalisering.
Merk: Input DNA er vanligvis utvannet 20 x (til 1% av utgangsmaterialet i ChIP reaksjonene) for qPCR analyse. - For hver 10 µL av PCR, blande følgende komponenter i et PCR-rør: DNA mastermix, legge til 2 µL dH2O, 2,5 µL SYBR grønn mix og 1 µL av DNA (fra ChIP eller 1% inngang), for mastermix med primer , Legg 2.375 µL dH2O, 2,5 µL SYBR grønn mix og 0.125 µL av forover og bakover grunning.
- Bland prøvene av vortexing for 2 s og kort sentrifuge 900 x g i 1
- Utføre sanntid PCR (et eksempel primere og sykling betingelsene brukes her kan finnes i tabell 2 og tabell 3, henholdsvis).
Merk: ChIP-qPCR analyse: ChIP signaler beregnes som prosent av input. Kort, når Ct verdiene hentes for hver qPCR reaksjon, en fortynningsfaktoren 100 eller 6.644 sykluser (log2 100) brukes for Ct verdiene hentes for input DNA reaksjonene. Deretter for et område av interesse (dvs. primer par), ChIP signalene er beregnet som følger:
justert input = Ct (inngang) - 6.644
ChIP signal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. chIP-seq biblioteket forberedelse; Slutten reparasjon: Dag 4
- fortynne opptil 100 ng ChIP-DNA i 60 µL av elueringsbufferen (se materialer tabell).
- Legge til 40 μL slutten reparere blanding og Pipetter forsiktig 10 ganger.
- Incubate på 30 ° C i 30 min på en termisk cycler.
- Vortex den magnetiske perler og tilsett 160 μL røret som inneholder slutten reparasjon mix. Bland godt av pipettering 10 ganger. Inkuber 15 min ved romtemperatur.
- Sett røret i magnetiske holderen og venter perler å bosette seg på siden av røret...
- Hell av klar væske.
- Mens du holder røret med magnetiske innehaveren, tilsett 200 μL nylagde 80% EtOH.
- Incubate ved romtemperatur for 30 s og Forkast nedbryting. Gjenta en gang...
- Holde røret i 15 min med magnetiske holderen ved romtemperatur. Når pellet er tørt, fjerne røret fra magnetiske abonnenten.
- Resuspend pellet i 20 μL rørets buffer. Pipetter forsiktig 10 ganger for å blande grundig.
- Incubate i 2 minutter ved romtemperatur.
- Sett røret i magnetiske holderen og venter perler å bosette seg på siden av røret. Overføre 17,5 μL nedbryting av til en ny tube.
11. ChIP-seq biblioteket forberedelse; Adenylate 3 ' ender
- legge 12,5 μL A tailing blanding til den nye rør og bland grundig av pipettering forsiktig opp og ned 10 ganger. Sett røret på en termisk cycler og Inkuber etter følgende program: 37 ° C i 30 min, 70 ° C i 5 min og hold på 4 ° C
12. ChIP-seq biblioteket forberedelse; Ligate kort
- legge til 2,5 μL rørets buffer, 2,5 μL ligation blanding og 2,5 μL riktig RNA kort indeksen. Mix grundig av pipettering forsiktig opp og ned 10 ganger.
- Incubate på en termisk cycler i 10 min på 30 °.
- Legge til 5 μL stopp ligation buffer og bland grundig av pipettering 10 ganger.
- Vortex den magnetiske perler og tilsett 42,5 μL prøven. Bland godt av pipettering 10 ganger. Inkuber 15 min ved romtemperatur.
- Sett røret i magnetiske holderen og venter perler å bosette seg på siden av røret og hell av klar væske
- Mens du holder røret med magnetiske innehaveren, tilsett 200 μL nylagde 80% EtOH.
- Incubate ved romtemperatur for 30 s og Forkast nedbryting. Gjentas én gang.
- Holder røret på magnetiske innehaveren, og la prøven air-dry i 15 min..
- Fjern røret fra magnetiske abonnenten og resuspend pellet i 52.5 μL rørets buffer. Bland godt av pipettering 10 ganger. Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter, sett røret i magnetiske holderen og vente på perler å bosette seg på siden av røret. Overføre 50 μL klart nedbryting av til en ny tube.
- Vortex den magnetiske perler og tilsett 50 μL prøven. Bland godt av pipettering 10 ganger. Inkuber 15 min ved romtemperatur.
- Sett røret i magnetiske holderen og venter perler å bosette seg på siden av røret og hell av klar væske.
- Mens du holder røret med magnetiske innehaveren, tilsett 200 μL nylagde 80% EtOH.
- Incubate ved romtemperatur for 30 s og Forkast nedbryting. Gjentas én gang.
- Holde røret på magnetiske innehaveren, og la prøve luften tørke i 15 minutter
- Fjern røret fra magnetiske abonnenten og resuspend pellet i 27.5 μL rørets buffer. Mix grundig av pipettering 10 ganger.
- Incubate i romtemperatur i 2 minutter, sett røret i magnetiske holderen og venter perler å bosette seg på siden av røret. Overføre 25 μL klart nedbryting av til en ny tube.
13. ChIP-seq biblioteket forberedelse; Forsterkning av DNA
- sted 12,5 µL av malen i en 0,2 mL PCR rør. Legg 2,5 μL PCR primer cocktail, 10 μL forbedret PCR mix. Mix grundig av pipettering opp og ned 10 ganger. Sett røret på en termisk cycler og bruke forholdene beskrevet i Tabell 4.
- Vortex den magnetiske perler og tilsett 25 μL prøven. Bland godt av pipettering 10 ganger. Inkuber 15 min ved romtemperatur.
- Sett røret i magnetiske innehaveren, venter perler å bosette seg på siden av røret og hell av klar væske.
- Mens du holder røret med magnetiske innehaveren, tilsett 200 μL nylagde 80% EtOH. Inkuber ved romtemperatur for 30 s og Forkast nedbryting. Gjentas én gang.
- Holde røret på magnetiske sammen, og la utvalg luft tørke i 15 min. Fjern røret fra magnetiske abonnenten og resuspend pellet i 32,5 μL rørets buffer. Mix grundig av pipettering 10 ganger.
- Ruge PCR rør/plate i 2 minutter ved romtemperatur. PCR rør/platen på magnetiske stå ved romtemperatur, venter perler å bosette seg på siden av røret og overføre 30 μL nedbryting av til en ny tube.
14. ChIP-seq biblioteket forberedelse; Biblioteket godkjenningen
Merk: valideringen av biblioteket utføres med en DNA og RNA kvalitetskontroll system. Utarbeidelse av stigen: aliquot 1 µL av genomisk DNA stige inn i første rør/godt og legge 3 µL eksempel bufferen.
- Utarbeidelse av prøven: Bland 1 µL av biblioteket utvalget (10-100 ng/µL) med 3 µL av prøven buffer i et rør. Nedspinning og deretter vortex på maksimal hastighet for 5 s. spinne ned til plasser prøven på bunnen av røret.
- Laste prøvene i kvalitetskontroll systemet.
- En gang fullført, analysere resultatene ved å angi kontrasten på maksimumsverdien å sikre at ingen primer dimers finnes i utvalget ( figur 5), primer dimers bør samsvare på et band rundt 135 bp. Hvis selv en svak band, gå videre til en andre oppryddingen ved å legge elueringsbufferen (se Materialer tabell) opp til en 50 µL volum og legge 47,5 µL av blandet magnetiske perler. Hvis konsentrasjonen av prøven er for lav (< 2 nM), fortsetter å kjøre PCR (trinn 13,1), med 18 sykluser i stedet for 15, med 12,5-µL volumet av prøven igjen fra trinn 12.16.
- Kvantifisere bibliotekene individuelt ved qPCR bruke kommersielt tilgjengelige kits.
Merk: Av biblioteker kan være sekvensielt med en enkelt lese 1 x 50 nt protokollen sikte på 30 M leser/prøve en sequencer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere ytelsen til vår ChIP-protokollen, utført vi ChIP-seq eksperimenter med grupperte SNT inndelinger fra HH19 kylling embryoer, maxillary prominences av HH22 kylling embryoer og scenen-HH3 kylling embryoer undersøke bindende profiler ulike histone endringer (dvs. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 og H3K27me3). Når ChIP DNAs ble innhentet, ble sonication effektiviteten evaluert av agarose gel geleelektroforese av de tilsvarende input DNAs (Figur 3). Deretter ble ChIP og input DNAs brukt for ChIP-qPCR analyse måle enrichments på loci forventes å være enten bundet eller ubundet av undersøkte histone endringene (figur 4A). I eksemplet i figur 4A, H3K27me3 og H3K4me3 berikelse ble nivåer i HH19 SNT delene vurdert av ChIP-qPCR rundt promoter regionene SOX17 og SOX2, to gener som er inaktiv og aktiv i SNT henholdsvis. Som forventet, var SOX2 selskapet sterkt preget av H3K4me3, men ikke av H3K27me3, mens SOX17 selskapet viste motsatt mønsteret (figur 4A). Ved å evaluere noen loci, er det mulig å beregne kvaliteten på ChIP uten å miste mye DNA stoff for nedstrøms ChIP-seq analyse. Når kvaliteten på sjetongene ble bekreftet, ble ChIP-seq biblioteker forberedt og sekvensielt. Representant loci vises for hver av undersøkte kylling embryonale vev: (i) profiler for H3K27me3 og H3K4me3 i SNT av HH19 kylling embryoer rundt PAX7 (figur 4B); (ii) profiler for H3K4me2 og H3K27ac i maxillary prominenser av HH22 kylling embryoer rundt SNAI1 (figur 4C); og (iii) profil for H3K27me3 i HH3-trinns kylling embryoer rundt TBX3/TBX5 locus (Figur 4 d). Disse ChIP-seq eksperimentene tydelig illustrerer at våre ChIP-protokollen kan brukes til å generere epigenomic profiler fra begrensede mengder av biologisk materiale i et bredt spekter av embryonale vev.
Figur 1: skjematisk oversikt over ChIP protokollen for lav-overflod embryonale prøver isolert fra kylling embryoer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kort oversikt over SNT Microdissection protokollen. Tverrgående SNT segmentet kuttes brachialis nivået av et HH19 kylling embryo. Etter trypsin behandling fjernes ikke-nevrale vevet mekanisk ved hjelp av pinsett. Ikke notochord; SNT spinal medfødte; og så, somite. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempel på optimale Sonication. Et eksempel på kylling SNT HH19 var sonicated for 11 sykluser, med 30 s på og 45 s OFF pulser på "høy" amplituden ved hjelp av en sonicator. Krysskoblinger ble snudd og renset DNA ble løst på en 1,5% agarose gel. Optimal fragment størrelsen er observert etter 11 sykluser, spenner fra 200-500 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative eksempler på ChIP analyse av ChIP-qPCR eller ChIP-seq. (A) H3K27me3 (venstre) og H3K4me3 (høyre) nivåer på de angitte områdene ble målt med ChIP-qPCR analyse utført ved hjelp av SNT deler isolert fra HH19 kylling embryoer. SOX2 formidler regionen er aktiv i SNT og vedkommendes av H3K4me3 men ikke av H3K27me3; SOX17 formidler regionen er inaktiv i SNT og er derfor beriket i H3K27me3 men ikke i H3K4me3; Chr6 Neg representerer et intergenisk område i kylling kromosom 6 og fungerer som en negativ kontroll. Feilfelt representerer standardavviket fra tre tekniske gjentak. (B) ChIP-seq (H3K27me3 i magenta, H3K4me3 i blått, og input i rødt) profiler fra SNTs av HH14 kylling embryoer vises rundt PAX7 locus. (C) ChIP-seq (H3K4me2 i oransje, H3K27ac i grønt, og input i rødt) profiler fra maxillary prominenser av HH22 kylling embryoer vises rundt SNAI1 locus. (D) ChIP-seq (H3K27me3 i magenta) og innspill i rødt profiler fra HH3 kylling embryoer vises rundt TBX3/TBX5 locus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: eksempel på ChIP-seq biblioteket godkjenningen ved hjelp av automatisert RNA kvalitetskontroll System. Samme ChIP-seq bibliotekene ble analysert med automatisert RNA kvalitetskontroll system før (A) og etter (B) primer dimer opprydding. Primer dimers kan sees som en svak ~ 135 bp band i (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Problem | Mulig årsak | Løsning |
| 1,2,3,4 5 og 11 | Lav ChIP signal til støy forhold i henhold til ChIP-qPCR og/eller ChIP-seq | Vevet kvalitet kompromittert. | Utføre mikro-dissections i kulde; ellers kan chromatin integritet være kompromittert. |
| Eksempel tap etter sentrifugering krysskoblet prøvene. | Bruk DMEM medium med 10-20% serum- eller gjenta sentrifugering trinn og øke til 10 min. | ||
| Cross-Linking varighet. | Optimalisere crosslinking tiden. Økt crosslinking ganger kan lette oppdagelsen av visse proteiner, som co Aktivator og co repressors som ikke binde til DNA direkte. | ||
| Eksempel tap på grunn av flere vasker i PBS. | Redusere antall vasker; sentrifugering fremgangsmåten kan gjentas på 1500 x g. | ||
| Suboptimal sonication resulterer i for lang eller for kort DNA størrelser. | Utføre en gang kurs eksperiment for å optimalisere sonication forhold. Optimal fragment størrelser fra 200 til 500 bp | ||
| Antistoff ikke egnet for ChIP. | Bruk en annen antistoff mot endogene protein eller et antistoff mot en kode til en exogenously uttrykt proteiner (f.eks flagg, HA). | ||
| 12 | Lav eller ingen signaler i qPCR, selv for inndata DNA | Suboptimal primere | Når primer-effektivitet og spesifisitet; utforme nye primere. |
| Utilstrekkelig mengde DNA | Ikke nok utgangsmaterialet. Øke mengden av DNA brukes per qPCR reaksjon. |
| Primere | Sekvens |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Tabell 2: Primer sekvenser for ChIP-qPCR.
| Preincubation | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 5 min | |
| Forsterkning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Sykluser |
| Smeltende kurve | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 min | |
| Kjøling | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Tabell 3: PCR betingelser for ChIP-qPCR.
| Første rødsprit | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 3 min | |
| Forsterkning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Sykluser |
| Endelig utvidelse | ||
| Temperatur | Tid | |
| 72 ° C | 5 s | |
| Kjøling | ||
| 4 ° C | Hold | |
Tabell 4: PCR betingelser for forsterkning av DNA under ChIP-seq biblioteket forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenomic profilering av histone modifisering benytter ChIP-seq kan brukes til å forbedre funksjonelle merknaden av virveldyr genomer i ulike mobilnettet sammenhenger4,5,18. Disse epigenomic profiler kan brukes, blant annet for å identifisere enhancer elementer, definere regulatoriske delstaten enhancers (dvs. aktiv, primet og klar), og å definere store celle identitet regulatorer i forskjellige biologiske eller patologisk sammenhenger (f.eks bred H3K4me3 promoter domener og super-enhancers)6,7,9,10,11,19. Men på grunn av iboende begrensningene av ChIP analysen, som vanligvis krever millioner av celler, sortert de fleste histone modifisering har blitt generert på i vitro cellelinjer og celle som kan være i vivo i store mengder 4. nå nylig, flere ChIP-seq protokoller har blitt beskrevet som er kompatible med ekstremt lav celle tall, dermed dramatisk utvide rekkevidden av celletyper og vev som epigenomic profiler kan i prinsippet være generert13 ,14,15,16. Disse nye ChIP-seq protokoller hver er avhengige av spesifikke adhoc biblioteket forberedelse metoder som, minst i enkelte tilfeller krever ikke-standard utstyr og/eller reagenser14,15,16.
Her beskriver vi en ChIP protokoll som fungerer med lav til middels cellen tallene (5 x 104 - 5 x 105 celler) innhentet i vivo fra forskjellige embryonale vev10. For å øke sensitiviteten av våre ChIP analyser, har vi eliminert flere trinn som vanligvis brukes under ChIP, som sekvensiell cellen og kjernefysiske lysis, som kan resultere i en progressiv tap av verdifulle materialet. Dermed etter crosslinking, prøver behandles med en enkelt lyseringsbuffer og deretter sonicated for å unngå tap av prøven. Viktigere, er våre ChIP-protokollen kompatibel med qPCR analyse, dermed muliggjør epigenomic analyse av valgte loci rundt. Videre kan våre ChIP-protokollen kombineres med standard ChIP-seq biblioteket forberedelse metoder, dermed er potensielt nyttig å de fleste laboratorier med tilgang til neste generasjons sekvensering teknologi.
ChIP og ChIP-seq-protokoller kan brukes ikke bare undersøke bindende profiler av histone endringer, men også å avdekke bindende områder av andre viktige transcriptional regulatorer, som transkripsjonsfaktorer og co aktivator (f.eks P300 og CBP)20. Vanligvis krever ChIPs (og ChIP-seq) for transkripsjonsfaktorer og co aktivator, som ikke er så rikelig som histones, betydelig mer utgangsmaterialet enn sjetonger for histone merker. Dermed beskrevet protokollen kan ikke nødvendigvis fungerer for de fleste transkripsjonsfaktorer eller co aktivator med mindre antall starter celler er betydelig økt (f.eks 5 x 105 - 5 x 106 celler) og/eller svært spesifikke og effektiv antistoffer er tilgjengelig. Likevel ytterligere optimalisering og de stadig bedre biblioteket forberedelse forventer vi at ChIP-seq begrenset mobilnettet materiale vil bli mulig for de fleste regulatoriske proteiner.
Selv om våre ChIP og ChIP-seq protokoller har validert mye for en rekke histone modifikasjoner og embryonale vev, ønsker vi å fremheve noen avgjørende skritt som vi anser nødvendig å generere høy kvalitet epigenomic profiler. Først må embryonale prøvene isoleres fersk under forhold som ikke kompromiss chromatin integritet. Disse inkluderer utføre disseksjoner under kalde forhold eller flash-Underkjølt gruppert prøver til nok materiale er akkumuleres. Et annet viktig skritt er sonication, som må være nøyaktig optimalisert for å utføre høykvalitets ChIPs. Optimale sonication forhold varierer ofte avhengig vev, vev, eller sonicator som brukes. Sist men ikke minst, avhengig en vellykket ChIP slutt av tilgjengeligheten av spesifikke og ChIP-kompatible antistoffer mot proteiner av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noen konkurrerende økonomiske interesser avsløres.
Acknowledgments
Forfatterne takker Jan Appel for hans utmerket kundestøtte under etableringen av denne protokollen. Arbeid i Rada-Iglesias laboratoriet støttes av CMMC intramural finansiering, DFG forskningsmidler (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 og TE 1007/3-1), UoC avanserte forskeren gruppe Grant og CECAD tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
