Summary
في هذه الدراسة، ويمكننا وصف منهجية لتحليل النمط الوراثي C924T. البروتوكول يتكون من ثلاث مراحل: استخراج الحمض النووي، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وتحليل لتقييد يفتت طول التعدد (RFLP) على [اغروس] هلام.
Abstract
A2 ثرومبوكاني الجينات مستقبلات (TBXA2R) عضو فوق ز-البروتين إلى جانب عائلة مع المناطق السبعة transmembrane. أنها تشارك في تطور أثيروجينيسيس، الاسكيمية، واحتشاء عضلة القلب. نقدم هنا منهجية للمريض الوراثي التحقيق في دور تعدد الأشكال C924T (rs4523) التي تقع في المنطقة 3 ' الجينات مستقبلات TBXA2 بوستترانسكريبشونال. يعتمد هذا الأسلوب على استخراج الحمض النووي من الدم كله، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) التضخيم جزء الجينات TBXA2 تحتوي على الطفرة C924T، وتحديد نوع البرية و/أو الأنماط الجينية متحولة استخدام تحليل خلاصة قيد، على وجه التحديد تقييد يفتت طول تعدد الأشكال (RFLP) على [اغروس] هلام. وباﻹضافة إلى ذلك، أكدت النتائج التسلسل الجيني TBXA2R. يتميز هذا الأسلوب بالعديد من المزايا المحتملة، مثل كفاءة عالية والتعرف السريع تعدد الأشكال C924T بتحليل PCR وإنزيم التقييد. ويسمح هذا النهج دراسة تنبؤية لتشكيل اللوحة، وتطور تصلب الشرايين من خلال تحليل الأنماط الجينية المريض لتعدد الأشكال TBXA2R C924T. تطبيق هذا الأسلوب لديه القدرة على التعرف على الأشخاص الذين هم أكثر عرضه لعمليات أثيروثرومبوتيك، في مواضيع معينة في مجموعة عالية الخطورة، والمعالجة بالاسبرين.
Introduction
TBXA2R هو عضو فوق ز-البروتين إلى جانب عائلة مع المناطق السبعة transmembrane، الذي أعرب على نطاق واسع والمترجمة في أغشية الخلايا أو في هياكل داخل الخلايا1،2. ويشارك في مسار الإشارات TBXA2R في عمليات تصلب الشرايين المتقدمة3. زيادة التعبير عن مستقبلات TBXA2 قد أظهرت خلال التقدم أثيروجينيسيس، والسريرية والدراسات التجريبية أظهرت بدورها ذات الصلة في الاسكيمية، واحتشاء عضلة القلب4. C924T، النوكليوتيدات واحدة تعدد الأشكال (SNP) من الجينات TBXA2R، اعترف تعدد الأشكال فنية في المتطوعين صحية وارتبط بالاضطرابات السريرية5. وعلاوة على ذلك، أظهرت لنا الدراسة السابقة6 أن تعدد الأشكال C924T TBXA2R الجينات متورطة في نسخة الاستقرار؛ وهناك على وجه التحديد، تزايد عدم استقرار من محضر نوع المسخ (TT) فيما يتعلق بنوع البرية (CC). وباﻹضافة إلى ذلك، المنبهات عدة مثل الادينوسين diphosphate (ADP) وادرينالين والكولاجين بتركيزات مختلفة المستحث تجميع الصفائح الدموية أقل فعالية لنوع المسخ (ترينيداد وتوباغو). وهذا يتسق مع تكوين خثرة المخفضة والارقاء. وبالتالي، عدم استقرار النسخة TBXA2R وتخفيض تراكم الصفائح الدموية المرتبطة بها قد تكون مقترنة بدور حماية للنمط الوراثي ترينيداد وتوباغو TBXA2R ضد أثيروثرومبوسيس ومضاعفاته شديدة الخطورة المرضى المعالجة بالاسبرين6 .
وهنا يصف لنا منهجية للمريض الوراثي للتحقيق في دور بوستترانسكريبشونال C924T تعدد الأشكال (rs4523) الواقعة في المنطقة 3 ' الجينات مستقبلات TBXA2. يعتمد هذا الأسلوب على الخطوات التالية: استخراج الحمض النووي (1) من الدم كله، (2) [بكر] تضخيم الجزء الجينات TBXA2R التي تحتوي على الطفرة C924T، و (3) تحديد نوع البرية و/أو الأنماط الجينية متحولة استخدام تقييد طول جزء تعدد الأشكال (RFLP) على [اغروس] هلام. رفلب هو أسلوب الذي يستغل الاختلافات في تسلسل الحمض النووي مثلى7. وكان استخدام هذا التطبيق للكشف عن الحمض النووي مجمع الأشكال المتعددة، لا سيما بطانات، وفي إيجاد والمنتسبين أهميتها البيولوجية في الاختلافات الوراثية8. وكان التعدد تحليلها للمرة الأولى باستخدام رفلب-PCR في البشر الدم أبو9. يسمح أسلوب RFLP PCR تحليل الطفرات الوراثية في تسلسل الحمض النووي مثلى بتقييم وجود شظايا من أطوال مختلفة بعد هضم الحمض النووي باستخدام اندونوكليسيس قيود محددة للغاية10.
في السنوات الماضية، المنهجيات التالية التي استخدمت لتحليل SNP استخدام تقنية PCR: التهجين قصيرة محددة اليل النوكليوتيد11، محددة اليل بكر12، تمديد التمهيدي على الحمض النووي [ميكروارس]13، ربط اليغنوكليوتيد الاعتداء14، "الحمض النووي مباشرة" التسلسل لتحديد الهوية الخاصة بموقف واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة15، تكمان الأسلوب16، استخراج (ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران مالديتوف) الكتلي17و18من جينيتشيبس. هذه التقنيات ليست سهلة الاستعمال، وقد تتطلب معدات باهظة الثمن. على العكس من ذلك، طريقة PCR-RFLP غير مكلفة، وسهلة الاستخدام ومريحة، كفاءة عالية، ويتيح التعرف السريع على تعدد الأشكال C924T. وباﻹضافة إلى ذلك، أكدنا النتائج حسب تسلسل الجين TBXA2R استخدام الأسلوب سانجر15.
ويسمح هذا النهج دراسة تنبؤية لتشكيل اللوحة، وتطور تصلب الشرايين من خلال تحليل الأنماط الجينية المريض لتعدد الأشكال TBXA2R C924T. هذا الأسلوب يمكن تحديد مواضيع أكثر عرضه لعمليات أثيروثرومبوتيك، خاصة تلك التي بين المرضى المعرضة للخطر، والمعالجة بالاسبرين.
Protocol
البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "اللجنة أخلاقيات البحوث الطبية" من جامعة Chieti.
1-كاشف الإعداد
- إعداد المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) (pH 8.0). إضافة 200 ميليلتر يدتا 0.5 M و 1 مل من تريس Cl 1 م في كوب وتقديمهم إلى 100 مل بالماء المعقم. الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت التركيز النهائي: 10 مم تريس-Cl، 1 مم يدتا. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تحضير 1 لتر 10 × الحل الأسهم التفريد المخزن المؤقت (TBE). حل ز 108 من قاعدة تريس و 55 غراما من الماء المقطر مل 40 يدتا 0.5 متر (pH 8) داخل كوب، وجلب لحجم 1 لتر بالماء المعقم. مخزن في الرايت
- تحضير هلام تحميل صبغ. حل 0.25 غرام بروموفينول الأزرق، منزوع 0.25 غرام من زيلين نفط زايلين FF، 50 جرام الجلسرين، 1 مم يدتا (pH 8) 60 مل أو الماء المقطر، وتجلب إلى حجم 100 مل مع الماء المعقم. تخزين في 4 درجات مئوية (لبضعة أشهر) أو عند-20 درجة مئوية (لسنوات)
-
إعداد 200 مل من 2% [اغروس] هلام. استخدام تخزينه طازجة، أو بدلاً من ذلك، وطدت في RT لتصل إلى عدة أسابيع.
- حل 4 غرام من [اغروس] في 200 مل من المخزن المؤقت x TBE 1 في كوب 600 مل. يحرك باستخدام خلاط مغناطيسي لمدة حوالي 5 دقائق حتى تعليق [اغروس] هو تماما.
- الحرارة 2% [اغروس] الحل في الماء المغلي أو على لوحة الساخن (لحوالي 10 دقائق، حتى يذوب تماما [اغروس]). علما بأن الكأس مع [اغروس] هلام يجب أن تغطي برقائق الألومنيوم. وبدلاً من ذلك، الحرارة الكأس اكتشفت في ميكروويف على درجة حرارة عالية لحوالي 3-5 دقيقة.
- دوامة الحل 2% [اغروس] باستخدام خلاط مغناطيسي، التحقق من أن يذوب تماما [اغروس].
ملاحظة: تظهر جزيئات [اغروس] كالحبوب شفافة قبل حل كامل. قد يكون من الضروري إعادة تسخين الجسيمات لعدة دقائق (حوالي 5 – 10 دقيقة). - إذا كان المخزن جزء من [اغروس] هلام يستخدم، الحرارة في الكأس، مغطاة برقائق الألومنيوم، يذوب في حمام الماء الساخن (في حوالي 60 درجة مئوية) حتى [اغروس]. إزالة مع ماصة باستور أي "أثر" للصلب [اغروس] من على سطح الأرض قبل صب.
2. تنقية الحمض النووي
-
نفذ ما يلي قبل البدء التنقية:
- استخدام العينات البشرية دماء جديدة كلياً، أو ذوبان الجليد الدم كله تجميد عينات بسرعة (لحوالي 2 – 3 دقيقة) في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) تطبيق الانفعالات معتدل وحجته ثم إلى RT قبل الاستخدام.
- مزيج من عينات الدم الطازج أو المذابة عكس الأنابيب عدة مرات.
- ابدأ عملية تنقية باتباع بروتوكولات المورد من أجل 100 ميليلتر من شطف وحدة التخزين.
-
قياس وحساب نقاء الحمض النووي قياس امتصاص في 260 و 280 و 320 نانومتر.
- استخدام الماء المعقم لتمييع العينات ومعايرة جهاز المطياف الضوئي.
- تطبيق الصيغة التالية لحساب تركيز عينة الحمض النووي = 50 ميكروغرام/مل x (260 − A320) × معامل التخفيف، ونقاء الحمض النووي = (من260 − A320)/(280 − A320)، مع نسبة مقبولة بين 1.7 و 1.9.
3-[بكر] تضخيم لعينات من الحمض النووي
- إعداد 25 ميليلتر من رد فعل الخليط في أنبوب مايكرو-تضخيم 0.2 مل، كما هو مبين في الجدول 1.
- الاضطلاع [بكر] تضخيم المنقي عينات الحمض النووي باستخدام cycler حرارية الآلي، في أعقاب برنامج التضخيم هو مبين في الجدول 2.
- في النهاية [بكر] تضخيم، وقف ردود الفعل بكر بترك عينات الحمض النووي في 4 درجات مئوية.
4-رفلب منتجات PCR
- إعداد ميليلتر 22.5 الحل الرئيسي--مزيج لكل عينة، حيث أن إنزيم التقييد المحدد هضم منتجات PCR، كما هو مبين في الجدول 3.
- نقل 2.5 ميليلتر من منتج PCR إلى أنبوب بكر جديدة لكل عينة، استخدام ماصة ونصائح عامل التصفية.
- إضافة ميليلتر 22.5 الحل الرئيسي--ميكس الهضم للأنابيب التي تحتوي على منتج PCR لكل نموذج، باستخدام ماصة ونصائح تصفية.
- احتضان الخليط رد فعل (الحل الرئيسي--ميكس ومنتج PCR) عند 37 درجة مئوية ح 4.
5-جل التفريد تحليل العينات PCR-رفلب
- وصمة عار [اغروس] هلام بإضافة اثيديوم بروميد (أتبر) في 0.5 ميكروغرام/مل للجل لأدنى 10 أتبر بربط الحمض النووي، التي يمكن تصور تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية).
تنبيه: من المهم استخدام قفازات وغيرها من الأجهزة الواقية أثناء المناولة والتخزين والتخلص من أتبر، لأنه مطفر مع احتمال الإصابة بالسرطان. - صب استعداد [اغروس] هلام في علبة جل مع المشط جيدا في المكان، والانتظار حتى أنه هو توطد.
- ضع طدت [اغروس] هلام في مربع هلام (التفريد وحدة).
- ملء مربع هلام مع 1 x TBE حتى يتم تغطية الهلام.
- ماصة ونصائح التصفية، تحميل ميليلتر 6 الخلاصة تضخيم الحمض النووي (على وجه التحديد، تحميل 5 ميليلتر لكل عينة و 1 ميليلتر من جل تحميل صبغ) في الآبار [اغروس] هلام. إضافة علامة حجم الحمض النووي في منفصلة أيضا وبالتوازي مع العينات.
- تشغيل هلام لمدة 20 – 30 دقيقة في 100 V.
- مع الأشعة فوق البنفسجية-ترانسيلوميناتور، تصور الشظايا من الحمض النووي ملصوق أو منتجات PCR عسر الهضم، مقارنة الأجزاء مع علامة حجم الحمض النووي، وتسجيل النتائج بواسطة التصوير الفوتوغرافي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
تحذير: استخدام وسائل واقية (نظارات السلامة أو قناع لوجه) حول مصادر الضوء الأشعة فوق البنفسجية.
Representative Results
والهدف من هذا الأسلوب تقييم النمط الوراثي مستقبلات A2 ثرومبوكاني فيما يتعلق بتعدد الأشكال C924T. الجينات البشرية TBXA2R يقع في 19p13.3، ويمتد 15 kbp ويتكون من ثلاثة exons مفصولة بواسطة introns اثنين. C924T مجمع الأشكال المتعددة للجينات TBXA2R (من 539 bp) اتسع نطاق استخدام كبسولة تفجير PCR هو مبين في الشكل 1، الذي كان جيدا هندسيا لتضخيم في منطقة محددة من الحمض النووي ولكن لا أورثولوجوس أو بارالوجوس المنطقة غير محدد. وبالإضافة إلى ذلك، أجرى تحليل RFLP استخدام إنزيم تقييد رساي (الشكل 1) على منتجات PCR وكانت تصور النتائج على [اغروس] هلام، لوصف SNP درس معين.
استناداً إلى وجود أطوال بلغة مختلفة بعد الهضم من الحمض النووي، فمن الممكن التمييز الوراثي المريض لتعدد الأشكال C924T. وفي الواقع، كما هو مبين في الشكل 2، هوموزيجوسيتي اليل الرئيسية (CC) يعرض شريطين (bp 395 و 144)، نظراً للتخفيضات إنزيم التقييد التحديد الجزء الجين TBXA2R في الموقع تعدد الأشكال C924T. هوموزيجوسيتي اليل القصر (TT) يتضح من عصابة واحدة (539 bp)، لأنه لا يحدث قطع إنزيم التقييد. اليل (CT) متخالف يظهر ثلاثة نطاقات (539 و 395 و 144 bp). كما هو مبين في الشكل 2، أكدته التعدد C924T، يحددها الهضم رساي على منتج PCR، تحليل تسلسل.
| المكون | وحدة التخزين (ميليلتر) | التركيز النهائي |
| 10 × PCR العازلة توين-20 (15 م MgCl2) | 0.25 | 1.5 مجكل2 ميللي مول/لتر |
| دنتب ميكس (10 مم) | 1 | 200 ميكرومتر |
| التمهيدي (إلى الأمام) (10 pmol/ميكرومتر) | 1 | 0.4 ميكرون/ميليلتر |
| التمهيدي (عكس) (10 pmol/ميكرومتر) | 1 | 0.4 ميكرون/ميليلتر |
| [تق ] [بولمرس] (يو 5/ميليلتر) | 0.2 | 1 ش/ميليلتر |
| عينة من الحمض النووي (42 ng/ميليلتر) | 1 | 42 ng/ميليلتر |
| الدناز الماء مجاناً | 20.55 | |
| المجموع | 25 |
الجدول 1: بكر تضخيم الإعداد. خليط رد فعل الرئيسي--ميكس 25 ميليلتر أنشئت في أنبوب بكر 0.2 مل لتضخيم الحمض النووي عينة واحدة.
| بكر القياسية | |||
| خطوة أولية لتفعيل | 5 دقيقة | 95 درجة مئوية | |
| الخطوة 3--ركوب الدراجات | |||
| تمسخ | 30 s | 94 درجة مئوية | |
| الصلب | 60 s | 55 درجة مئوية | |
| ملحق | 60 s | 72 درجة مئوية | |
| عدد الدورات | دورات 30 | ||
| التمديد النهائي | 8 دقيقة | 72 درجة مئوية | |
الجدول 2: برنامج التضخيم PCR. قم بإعداد cycler حرارية الآلي من أجل إجراء PCR وتضخيم الحمض النووي القالب. يتم إيقاف PCR ردود الفعل التي تقشعر لها اﻷبدان في 4 درجات مئوية.
| المكون | وحدة التخزين (ميليلتر) (n = 1) | وحدة التخزين (ميليلتر) (n = 10) * |
| 10 × الإنزيم المخزن المؤقت | 2.5 | 27.5 |
| إنزيم التقييد (يو 5/ميليلتر) | 0.5 | 5.5 |
| الدناز الماء مجاناً | 19.5 | 214.5 |
| المجموع | 22.5 | 247.5 |
الجدول 3: الهضم إنزيم التقييد من منتجات PCR. حل ميكس ماجستير أعد حيث أن إنزيم التقييد المحدد هضم منتجات PCR. *: لإعداد حل ميكس ماستر لعينات 10، إضافة 10% أكثر، وأخيراً تقديم عينات 11.
الشكل 1: [بكر] كبسولة تفجير وإنزيم التقييد رساي. الإشعال إلى الأمام وعكس مصممة لتضخيم جزء الجينات TBXA2R 539 bp التي تحتوي على تعدد الأشكال C924T. رساي هو إنزيم التقييد المحدد للتعرف مواقع غتاك. ˅: الموقع قطع من الإنزيم رساي. C(/T): C924T تعدد الأشكال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نمط الغرواني الكهربي والحمض النووي تسلسل تحليل. (أ) C924T الوراثي يعترف RFLP نمط بعد الهضم مع الإنزيم رساي محددة. تسلسل الحمض النووي (ب) التحليل: تم تأكيد النتائج التي توصلت إليها RFLP بعد الهضم مع إنزيم التقييد رساي باستخدام تحليل تسلسل عرض تعدد الأشكال C924T. لقد تم تعديل هذا الرقم من De إيولييس et al.، البروستاغلاندينات وسائر الوسطاء الدهن6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
في هذه الدراسة، التي وصفناها منهجية تسمح الوراثي المريض من أجل التحقيق في دور بوستترانسكريبشونال C924T تعدد الأشكال (rs4523) الواقعة في المنطقة 3 ' الجينات TBXA2R. أولاً، يعتمد هذا الأسلوب على استخراج الحمض النووي من الدم كله. على وجه الخصوص، تتكون هذه العملية الأولى لتنقية الحمض النووي البشري الإجمالية، الجينوم والميتوكوندريا، من عينات الدم كله الطازجة أو المجمدة، تعامل مع يدتا (سترات أو الهيبارين). للتخزين على المدى القصير من عينات الدم كله، تخزن في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام. تخزين أكثر من 10 أيام، لتخزين العينات في-70 درجة مئوية. عملية تنقية الآلي تضم 4 خطوات: ليس وربط وتغسل والوت. ثانيا، الأسلوب يعتمد على [بكر] تضخيم الجزء الجينات TBXA2R التي تحتوي على الطفرة C924T. وأخيراً، يتم تحديد نوع البرية و/أو متحولة الوراثي استخدام تحليل إنزيم التقييد (RFLP) على [اغروس] هلام.
خطوات حاسمة في البروتوكول بما يلي: (ط) في حالة تخزين جزء من [اغروس] هلام في يستخدم RT، يمكن أن يكون [اغروس] طدت إعادة المذابة على حمام الماء المغلي (عند 60 درجة مئوية لحوالي 15-20 دقيقة) أو في فرن ميكروويف (3-5 دقائق) قبل صب. ملاحظة: فك الغطاء عند إعادة الصهر [اغروس] في زجاجة. (ثانيا)، وعلاوة على ذلك، عند إعادة تدفئة [اغروس]، التبخر سوف يسبب زيادة تركيزه. لهذا السبب، قد يكون من المفيد أن تعوض عن طريق إضافة كمية صغيرة من المياه. (ثالثا) شظايا من الحمض النووي أقل من 1000 شركة بريتيش بتروليوم تم تمييزه بواسطة [اغروس] هلام، وينصح TBE العازلة للحصول على فصل ممكن أفضل. (رابعا) أننا نفضل استخدام [اغروس] هلام بدلاً من جل polyacrylamide لأن إعداد هذا الأخير أكثر صعوبة، ويستغرق وقتاً أطول بكثير لإعداد. (ت) اختيار وقت تشغيل التفريد جل تعتمد على الحجم المتوقع لمنتجات التضخيم. وبناء على هذا البروتوكول، يكفي للقيام التفريد لمدة 20-30 دقيقة في 100 الخامس في 2% [اغروس] هلام، نظراً لحجم PCR شظايا يتراوح من 100-500 هناك (سادسا) أنها إلزامية للحصول على 10 إلى 50 نانوغرام قالب الحمض النووي المستخرج من عينات بشرية ذات نوعية جيدة . لهذا السبب، فإننا نفضل أن تستخدم تنقية الحمض النووي الآلي بدلاً من واحدة شبه تلقائي أو يدوي. (سابعا) إعداد حساب رد فعل مزيج الرئيسي للتضخيم بكر والحل الرئيسي--ميكس لهضم منتجات PCR، إضافة 10% أكثر (على حساب فقدان السائل أثناء بيبيتينج) لوحدة التخزين مضروباً في العدد العينات لوحدة التخزين المطلوب للحمض النووي عينة واحدة.
شرك الأكثر تكراراً للأسلوب هو وجود منتجات التضخيم إضافي بسبب برنامج cycler حرارية غير صحيحة، إعداد مزيج ماجستير تضخيم غير صحيحة، أو تلوث قالب الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، قد يكون عدم وجود منتجات PCR سبب المعطل [تق ] [بولمرس] أو cycler حرارية غير صحيحة تشغيل. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون وجود شظايا غير متوقع بسبب تلوث منتج PCR أو هضم غير مكتملة من إنزيم خامل أو المبلغ قليلاً جداً من حجم إنزيم التقييد، أو فترة حضانة قصيرة جداً.
في السنوات الماضية، استخدمت SNP التحليل باستخدام تقنية PCR المنهجيات التالية: التهجين قصيرة محددة اليل النوكليوتيد11، محددة اليل بكر12، تمديد التمهيدي على الحمض النووي [ميكروارس]13 ، ربط اليغنوكليوتيد الاعتداء14، مباشرة تسلسل الحمض النووي لتحديد هوية خاصة بموقف واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة15، تكمان الأسلوب16، استخراج ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الكتلي17، وجينيتشيبس18. هذه الأساليب ليست مثالية لأنها ليست بسيطة استخدام و/أو تتطلب معدات باهظة الثمن. على العكس من ذلك، بكر RFLP الطريقة الموضحة في هذه الدراسة غير مكلفة، وسهلة الاستخدام ومريحة، كفاءة عالية، ويتيح التعرف السريع على تعدد الأشكال C924T. وجود قيود على هذا الأسلوب أن فإنه يتم إلا لعدد صغير من بطانات وعينات قليلة في جلسة عمل.
للتطبيقات المستقبلية، يمكن استخدام هذا الأسلوب للدراسات التنبؤية بشأن تشكيل اللوحة وتطور تصلب الشرايين من خلال تحليل الأنماط الجينية المريض لتعدد الأشكال TBXA2R C924T. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن تحديد مواضيع أكثر عرضه لعمليات أثيروثرومبوتيك، وعلى وجه الخصوص، علاج المرضى شديدة الخطورة مع الأسبرين. أخيرا، يمكن تطبيق هذا الأسلوب على دراسة أخرى تشارك في الطب شخصية للمخدرات محددة (على سبيل المثال، التخثر ومضادات الاختلاج) مجمع الأشكال المتعددة من أجل فهم الجرعة المناسبة من المخدرات والفرد الدوائي و الاستجابة السريرية لكل مريض قبل البدء في العلاج، وتجنب الآثار السلبية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكان تمويل هذا المشروع جزئيا بنسبة 60% اتينيو المنح من مينيستيرو ديل ' جامعة، إيطاليا إلى س. م.، وتي. كما تلقينا مساهمات جزئية البحوث نفقات الإدارة الطبية، وعن طريق الفم و "البيوتكنولوجية العلوم"، جامعة Chieti "زاي d'Annunzio".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
