Summary
No presente estudo, descrevemos uma metodologia para analisar o genótipo C924T. O protocolo consiste em três fases: extração de DNA, amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) em gel de agarose.
Abstract
O gene do receptor (TBXA2R) de tromboxano A2 é um membro da superfamília G-proteína juntamente com regiões transmembrana-7. Está envolvido na progressão atherogenesis, isquemia e infarto do miocárdio. Aqui apresentamos uma metodologia de paciente genotipagem para investigar o papel pós-transcricional do polimorfismo C924T (rs4523) situado na região 3' do gene do receptor do TBXA2. Este método baseia-se na extração de DNA do sangue inteiro, amplificação de reação em cadeia (PCR) polimerase da porção de gene TBXA2 contendo a mutação C924T e a identificação do tipo selvagem e/ou genótipos mutantes usando análise de digerir uma restrição, especificamente um restrição fragmento comprimento polimorfismo (RFLP) em agarose gel. Além disso, os resultados foram confirmados pelo sequenciamento do gene TBXA2R. Esse método apresenta diversas vantagens potenciais, tais como a eficiência elevada e a rápida identificação do polimorfismo C924T pela análise PCR e enzima de restrição. Esta abordagem permite um estudo preditivo para a formação da placa e progressão da aterosclerose, analisando o pacientes genótipos para o polimorfismo TBXA2R C924T. Aplicação deste método tem o potencial para identificar indivíduos que são mais suscetíveis a processos aterotrombótico, em assuntos específicos em um grupo de alto risco, tratados com aspirina.
Introduction
TBXA2R é um membro da superfamília de proteínas G juntamente com regiões transmembrana-7, que são amplamente expressas e localizados sobre as membranas celulares ou sobre estruturas intracelulares1,2. A via de sinalização de TBXA2R está envolvida em processos avançados de aterosclerose3. Aumento da expressão do receptor TBXA2 foi demonstrada durante a progressão atherogenesis e clínicas e estudos experimentais mostraram seu papel relevante na isquemia e infarto do miocárdio4. C924T, um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) do gene TBXA2R, foi reconhecido como um polimorfismo funcional em voluntários saudáveis e tem sido associada a transtornos clínicos5. Além disso, o nosso anterior estudo6 demonstrado que o polimorfismo C924T do gene TBXA2R está envolvido na estabilidade de transcrição; especificamente, há uma maior instabilidade das transcrições do mutante (TT) no que diz respeito ao tipo selvagem (CC). Além disso, vários estímulos como difosfato de adenosina (ADP), epinefrina, colágeno em diferentes concentrações e induziram uma agregação plaquetária menos eficaz para o tipo de mutante (TT). Isto é consistente com uma formação de trombos reduzida e hemostasia. Assim, a instabilidade da transcrição TBXA2R e associada redução da agregação plaquetária pode estar associados com um papel protetor para o genótipo TT TBXA2R contra atherothrombosis e suas complicações em pacientes de alto risco tratados com aspirina6 .
Aqui, descrevemos uma metodologia para a paciente genotipagem investigar o papel pós-transcricional do polimorfismo C924T (rs4523), situado na região 3' do gene do receptor do TBXA2. Este método baseia-se as seguintes etapas: extração de DNA (1) de sangue total, amplificação por PCR (2) da parte de gene TBXA2R, que contém a mutação C924T e (3) identificação do tipo selvagem e/ou genótipos mutantes usando o comprimento do fragmento de restrição polimorfismo (RFLP) em gel de agarose. RFLP é uma técnica que explora variações homólogas de sequências de DNA7. Este aplicativo foi usado para detectar polimorfismos de DNA, especialmente de SNPs e para encontrar e associar a relevância biológica em variações genéticas8. O polimorfismo analisado pela primeira vez usando o PCR-RFLP em seres humanos foi o de sangue ABO9. O método de RFLP-PCR permite a análise de mutações genéticas em sequências homólogas de DNA, avaliando a presença de fragmentos de diferentes comprimentos após a digestão de DNA usando as endonucleases de restrição altamente específico10.
No últimos anos, as seguintes metodologias foram utilizadas para análise SNP utilizando a técnica PCR: hibridação de curto oligonucleotídeos alelo-específico11, PCR alelo-específico12, extensão da primeira demão no DNA microarrays13. ligadura do oligonucleotide do ensaio14, DNA direto de sequenciamento para identificação de polimorfismos de single-nucleotide específicos de posição15, Taqman método16, extração Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo ( MALDI-TOF), espectrometria de massa17e GeneChips18. Estas técnicas não são simples de usar e podem exigir um equipamento caro. Por outro lado, o método de PCR-RFLP é barato, simples de usar, conveniente, tem uma eficiência elevada e permite a identificação rápida do polimorfismo C924T. Além disso, confirmamos os resultados pelo sequenciamento do gene TBXA2R, usando o método de Sanger15.
Esta abordagem permite um estudo preditivo da formação da placa e progressão da aterosclerose, analisando o pacientes genótipos para o polimorfismo TBXA2R C924T. Esse método pode identificar indivíduos mais suscetíveis a processos aterotrombótico, em particular aqueles entre pacientes de alto risco, tratados com aspirina.
Protocol
O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética médica pesquisa da Universidade de Chieti.
1. reagente Setup
- Prepare o tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8.0). Adicionar 200 µ l de EDTA 0,5 M e 1 mL de Tris-Cl 1 M num copo e trazer a 100 mL com água estéril. Concentração final de TE reserva: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
- Prepare 1 L do 10x buffer de electroforese de solução-mãe (TBE). Dissolver 108 g de Base de Tris, 55 g de ácido bórico e 40 mL de EDTA 0,5 M (pH 8) em um béquer e trazer para o volume de 1 L com água estéril. Loja em RT.
- Prepare o gel corante de carregamento. Dissolver a 0,25 g de bromofenol, 0,25 g de xileno cianol FF, 50 g de glicerol, 1 mM de EDTA (pH 8) em 60 mL de água deionizada ou água destilada e trazer para um volume de 100 mL com água estéril. Armazenar a 4 ° C (por alguns meses) ou a-20 ° C (por anos)
-
Prepare 200 mL de gel de agarose 2%. Uso ele fresco ou, alternativamente, armazenar solidificado em RT para até várias semanas.
- Dissolva 4 g de agarose em 200 mL de 1 buffer de x TBE em um copo de 600 mL. Misture usando um misturador magnético por cerca de 5 min, até que a agarose é completamente suspensa.
- Aquece a solução de agarose 2% em água a ferver ou em uma chapa quente (por cerca de 10 min, até que a agarose é completamente dissolvido). Observe que o copo com o gel de agarose deve ser coberto com papel alumínio. Alternativamente, aqueça o béquer descoberto no microondas em alta temperatura por cerca de 3 – 5 min.
- Agite a solução de agarose 2% usando um misturador magnético, verificando que a agarose é completamente dissolvido.
Nota: As partículas de agarose aparecem como grãos translúcidos antes da dissolução completa. Pode ser necessário para partículas de reaquecimento por vários minutos (cerca de 5-10 min). - Se uma parte armazenada o gel de agarose é usado aquecer o béquer, coberto com papel alumínio, num banho de água quente (a cerca de 60 ° C) até o agarose é dissolvido. Retire com uma pipeta Pasteur "vestígios" de agarose solidificado da superfície antes de servir.
2. purificação de DNA
-
Faça o seguinte antes de iniciar a depuração:
- Utilizar amostras de sangue total fresco humano, ou descongelar o sangue congelado amostras rapidamente (por cerca de 2-3 min) em um banho de água (a 37 ° C) aplicando uma agitação suave e então equilibrar a RT antes do uso.
- Misture as amostras de sangue fresco ou descongelado invertendo os tubos várias vezes.
- Inicie o processo de purificação, seguindo os protocolos do fornecedor para 100 µ l de volume de eluição.
-
Quantificar e calcular a pureza do DNA medir a absorvância a 260, 280 e 320 nm.
- Use água estéril para diluir as amostras e para calibrar o Espectrofotômetro.
- Aplicar a seguinte fórmula, para calcular a concentração da amostra de DNA = 50 µ g/mL x (um260 − A320) x fator de diluição e a pureza do DNA = (um260 − A320) / (um280 − A320), com uma razão aceitável entre 1,7 e 1,9.
3. PCR amplificação de amostras de DNA
- Prepare 25 µ l de mistura reacional em um tubo de microamplificação de 0,2 mL, conforme mostrado na tabela 1.
- Realize uma PCR-amplificação das amostras de DNA purificadas usando um cycler térmico automatizado, seguindo o programa de amplificação mostrado na tabela 2.
- No final da amplificação por PCR, parar as reações de PCR, deixando as amostras de DNA em 4 ° C.
4. RFLP de produtos do PCR
- Prepare 22,5 µ l da solução de mestre-mistura para cada amostra, para que a enzima de restrição selecionada digere os produtos PCR, como mostrado na tabela 3.
- Transferência de 2,5 µ l de produto PCR para um novo tubo de PCR para cada amostra, usando uma pipeta e pontas de filtro.
- Adicione 22,5 µ l da solução de mestre-mistura de digestão para os tubos contendo o produto do PCR de cada amostra, usando uma pipeta e pontas de filtro.
- Incube a mistura de reação (mestre-mistura solução e produto do PCR) a 37 ° C por 4 h.
5. gel eletroforese de análise de amostras de PCR-RFLP
- Mancha do gel do agarose adicionando brometo de etídio (EtBr) a 0,5 µ g/mL para o gel durante 10 min. EtBr vincula-se ao DNA, que pode ser visualizado sob luz ultravioleta (UV).
Atenção: É importante o uso de luvas e outros dispositivos de protecção durante o manuseamento, armazenamento e eliminação de EtBr, porque é um agente mutagénico com potencial carcinogenicidade. - Despeje o gel de agarose preparado em uma bandeja de gel com o pente bem no lugar e espere até que ele é solidificado.
- Coloque o gel de agarose solidificado na caixa de gel (unidade de electroforese).
- Encha a caixa de gel com 1 x TBE até que o gel é coberto.
- Com uma pipeta e pontas de filtro, carga 6 µ l do digest amplificado DNA (especificamente, carga 5 µ l de cada amostra e 1 µ l de gel corante de carregamento) nos poços do gel do agarose. Adicione um marcador de tamanho de DNA em um separado bem e em paralelo com as amostras.
- Funcione o gel para 20-30 min a 100 V.
- Com um transiluminador de UV, Visualizar os fragmentos de DNA clivados ou os produtos PCR não digeridos, comparando os fragmentos com o marcador de tamanho de DNA e registrar os resultados pela fotografia seguindo as instruções do fabricante.
Atenção: Utilize dispositivos de proteção (óculos de segurança ou uma máscara de rosto) em torno de fontes de luz UV.
Representative Results
O objetivo desse método é avaliar o genótipo do receptor de tromboxano A2 no que diz respeito o polimorfismo de C924T. O gene humano de TBXA2R situa-se na 19p13.3, abrange 15 kbp e consiste de três exões separados por dois intrões. O polimorfismo C924T do gene TBXA2R (de 539 bp) foi amplificado utilizando os primers PCR mostrados na Figura 1, que eram bem projetados para amplificar uma região específica do DNA, mas não um ortólogas ou parólogo região inespecífica. Além disso, foi realizada uma análise RFLP utilizando uma enzima de restrição RsaI (Figura 1) sobre os produtos PCR e os resultados foram visualizados em um gel de agarose, para caracterizar o SNP específico estudado.
Baseado na presença de comprimentos diferentes de fragmento após digestão do DNA, é possível discriminar o genótipo de um paciente para o polimorfismo C924T. Na verdade, como mostrado na Figura 2, a homozigotia do alelo principal (CC) exibe duas bandas (395 e 144 bp), porque a enzima de restrição corta precisamente a porção do gene TBXA2R no local C924T polimorfismo. A homozigotia do alelo menor (TT) é demonstrada por uma única banda (539 bp), porque o corte de enzima de restrição não ocorre. O alelo (CT) heterozigoto mostra três bandas (539, 395 e 144 bp). Como mostrado na Figura 2, o polimorfismo C924T, definido pela digestão RsaI no produto do PCR, foi confirmado pela análise de sequência.
| Componente de | Volume (µ l) | Concentração final |
| 10x buffer de PCR Tween-20 (15m MgCl2) | 0.25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| dNTP mix (10 mM) | 1 | 200 ΜM |
| Primeira demão (frente) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/Μ l |
| Primeira demão (reverso) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/Μ l |
| Taq polimerase (5 U / µ l) | 0.2 | 1 U/Μ l |
| DNA da amostra (42 ng / µ l) | 1 | 42 ng / µ l |
| DNase-free-água | 20.55 | |
| Total | 25 |
Tabela 1: Configuração de amplificação do PCR. Uma mistura de reação de mestre-mistura de 25 µ l criada em um tubo PCR de 0,2 mL para amplificar uma única amostra de DNA.
| PCR padrão | |||
| Passo de activação inicial | 5 min | 95 ° C | |
| Passo 3-ciclismo | |||
| Desnaturação | 30 s | 94 ° C | |
| Recozimento | 60 s | 55 ° C | |
| Extensão | 60 s | 72 ° C | |
| Número de ciclos | 30 ciclos | ||
| Extensão final | 8 min | 72 ° C | |
Tabela 2: Programa de amplificação do PCR. Configure um cycler térmico automatizado para realizar o PCR e amplificar o DNA do modelo. Reações de PCR são interrompidas por refrigeração a 4 ° C.
| Componente de | Volume (µ l) (n = 1) | Volume (µ l) (n = 10) * |
| 10x buffer de enzima | 2.5 | 27.5 |
| Enzima de restrição (5 U / µ l) | 0,5 | 5.5 |
| DNase-free-água | 19,5 | 214.5 |
| Total | 22.5 | 247,5 |
Tabela 3: Enzima de restrição digestão dos produtos PCR. Para que a enzima de restrição selecionada digere os produtos PCR, é preparada uma solução de mistura de mestre. *: Para configurar uma solução de mestre-mistura para 10 amostras, adicionar 10% a mais, finalmente fazendo 11 amostras.
Figura 1: PCR primers e enzima de restrição RsaI. Os primers para diante e reversos projetados para amplificar a porção do gene TBXA2R de 539 bp contendo o polimorfismo C924T. RsaI é a enzima de restrição selecionada para reconhecer os sites GTAC. ˅: local do corte da enzima RsaI. C(/T): C924T polimorfismo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise de sequências padrão eletroforético e DNA. (A), o C924T genótipo é reconhecido pelo RFLP padrão após digestão com a enzima específica da RsaI. Análise de sequências de DNA (B): os resultados obtidos por RFLP após digestão com a enzima de restrição RsaI foram confirmados usando análise de sequência mostrando o polimorfismo C924T. Esta figura foi modificada De Iuliis et al, prostaglandinas e outros mediadores lipídicos6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
No presente estudo, descrevemos uma metodologia que permite o paciente genotipagem para investigar o papel pós-transcricional do polimorfismo C924T (rs4523), situado na região 3' do gene TBXA2R. Primeiro, esse método se baseia na extração de DNA do sangue inteiro. Em particular, este primeiro processo consiste em uma purificação de DNA humano total, genômica e mitocondrial, a partir de amostras de sangue total frescas ou congeladas, tratados com EDTA (citrato ou heparina). Para armazenamento de curto prazo das amostras de sangue total, armazene a 2-8 ° C por até 10 dias. Para o armazenamento de mais de 10 dias, armazenar amostras a-70 ° C. O processo de purificação automatizado é composto por 4 etapas: lyse, vincular, lavar e eluir. Em segundo lugar, o método se baseia na amplificação por PCR da porção de gene TBXA2R contendo a mutação C924T. Finalmente, a identificação do tipo selvagem e/ou genótipo mutante usando uma análise de enzimas de restrição (RFLP) em gel de agarose é realizada.
Passos críticos no protocolo são os seguintes: (i) no caso de uma parte do gel do agarose armazenada no RT é usado, a agarose solidificado pode ser re-dissolvida num banho de água fervente (a 60 ° C por cerca de 15-20 min) ou em um forno de microondas (3-5 min) antes de servir. Nota: Solte a tampa quando re-fusão de agarose em uma garrafa. (ii), além disso, quando re-aquecimento do agarose, evaporação causará um aumento de sua concentração. Por esta razão, pode ser útil compensar adicionando um pequeno volume de água. (iii) fragmentos de DNA de menos de 1.000 bp foram diferenciadas por gel de agarose e amortecedor de TBE é recomendado para obter a melhor possível separação. (iv) preferimos usar um gel de agarose, em vez de um gel de poliacrilamida, porque a preparação deste último é mais difícil, e demora muito mais tempo para configurar. (v) a escolha do tempo de execução da electroforese do gel depende do tamanho esperado dos produtos da amplificação. Baseado no presente protocolo, é suficiente realizar uma eletroforese para 20-30 min a 100 V em gel de agarose 2%, desde que o tamanho do PCR fragmentos varia de 100-500 BP (vi) é obrigatório para obter 10 a 50 ng de um modelo de boa qualidade DNA extraído de amostras humanas . Por esta razão, nós preferimos usar uma purificação de DNA automatizada, em vez de um semi-automático ou manual. (vii) preparar a reação do mestre-mistura para amplificação por PCR e a solução de mistura de mestre para a digestão de produtos PCR, adicionando 10% a mais (para compensar a perda de líquido durante a pipetagem) para o volume calcularam multiplicado pelo número de amostras para o volume necessário para uma amostra de DNA.
A armadilha mais frequente do método é a presença de produtos de amplificação extra devido a um programa incorreto termociclador, uma preparação de mestre-mistura de amplificação incorreto ou uma contaminação do modelo de DNA. Além disso, a ausência de produtos do PCR pode ser devido polymerase de Taq inactivado ou um cycler térmico incorreto executar. Além disso, a presença de fragmentos inesperados pode ser devido à contaminação de produtos PCR ou para uma digestão incompleta de uma enzima inactivada, pouca quantidade de enzima de restrição de volume ou um tempo de incubação muito curto.
Nos últimos anos, foram utilizadas as seguintes metodologias para análise SNP utilizando a técnica PCR: hibridação de curto oligonucleotídeos alelo-específico11, PCR alelo-específico12, extensão da primeira demão sobre DNA microarrays13 , ligadura do oligonucleotide do ensaio14, direto de sequenciamento de DNA para a identificação de polimorfismos de single-nucleotide específicos de posição15, Taqman método16, extração Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização Espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF)17e GeneChips18. Esses métodos não são ideais, porque eles não são simples de usar e/ou exigem equipamentos caros. Por outro lado, o método de PCR-RFLP descrito neste estudo é barato, simples de usar, conveniente, tem uma eficiência elevada e permite a identificação rápida do polimorfismo C924T. Uma limitação para o presente método é que ele só pode ser usado para um pequeno número de SNPs e para algumas amostras em uma sessão de trabalho.
Para aplicações futuras, este método pode ser usado para estudos preditivos relativas à formação de placa bacteriana e progressão da aterosclerose, analisando os pacientes genótipos para o polimorfismo TBXA2R C924T. Além disso, esse método poderia identificar indivíduos mais suscetíveis a processos aterotrombótico, em particular, os pacientes de risco tratadocom com aspirina. Finalmente, esse método poderia ser aplicado para estudar outros polimorfismos envolvidos em medicina personalizada para drogas específicas (por exemplo, anticoagulantes e anticonvulsivantes) a fim de compreender a dosagem do medicamento adequado e o indivíduo farmacológico e resposta clínica para cada paciente antes de iniciar a terapia e para evitar efeitos adversos.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projeto foi parcialmente financiado por 60% Ateneo concede do Ministero dell'Università, Itália, S.M., e E.T. Também recebemos contribuições parciais para despesas pelo departamento de medicina, Oral e Ciências biotecnológicas, Universidade de Chieti "G. d'Annunzio" de investigação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
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